Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica e regulação gênica, como como várias regiões reguladoras de genes, também conhecidas como intensificadores, trabalham juntas para controlar a transcrição. A principal vantagem dessa técnica é que vários intensificadores próximos a vários genes diferentes podem ser testados simultaneamente para identificar rapidamente as regiões envolvidas na regulação gênica. Para iniciar o projeto do RNA guia, primeiro gere sequências de DNA conforme descrito no protocolo de texto.

Use um programa como o E-CRISP nas sequências de DNA geradas para encontrar RNAs guia com baixos alvos fora dos alvos. Os RNAs guia consistem em 20 nucleotídeos a montante de um motivo adjacente ao protoespaçador, que assume a forma de NGG para o dCas9 de S. pyogenes. No site do E-CRISP, selecione o organismo de interesse usando o menu suspenso.

A montagem do genoma aparece à direita do nome da espécie. Selecione o botão de opção Entrada é sequência FASTA. Copie as sequências FASTA de cima e cole-as na caixa de diálogo.

Certifique-se de que um cabeçalho FASTA esteja incluído para cada sequência. Selecione o botão de opção médio e Design único no menu suspenso. Clique no botão Iniciar pesquisa de gRNA único.

Uma nova guia do navegador será aberta e os resultados serão exibidos. Baixe as sequências candidatas clicando no botão Baixar um relatório tabular formulado pelo Excel para todas as sequências de consulta juntas. Em seguida, use o navegador de genoma UCSC para BLAT candidato a sequências de RNA guia de comprimento total para o genoma.

Em um navegador, navegue até o site do navegador do genoma da UCSC. Na seção Nossas ferramentas, localize a palavra BLAT e clique nela. A ferramenta de pesquisa BLAT será aberta.

Use os menus suspensos localizados sob o texto do genoma de pesquisa BLAT para selecionar o organismo e o conjunto do genoma de interesse. Copie as sequências de RNA guia do relatório tabular gerado pelo E-CRISP e cole-as na caixa de diálogo. Certifique-se de que cada sequência tenha um cabeçalho FASTA exclusivo e clique em enviar na parte inferior da caixa de diálogo.

Na página de resultados da pesquisa BLAT, os alinhamentos de cada sequência de RNA guia aparecerão, com cada linha representando um alinhamento. Idealmente, deve haver um alinhamento para cada RNA guia, indicando a singularidade desse RNA guia. Evite guias que mapeiam para vários locais no genoma, se possível.

Para examinar a localização e distribuição do RNA-guia na região de interesse, clique no link do navegador na seção Ações para um dos RNAs-guia consultados. O navegador do genoma aparecerá e será centralizado no RNA guia selecionado. Use os botões de zoom out na parte superior da página para visualizar a distribuição de outros RNAs guia identificados pelo E-CRISP na região de interesse.

Selecione quatro, de preferência não sobrepostos, RNAs guia que estão distribuídos por toda a região de interesse. Se a região de interesse exceder 600 pares de bases, considere adicionar uma ou duas guias adicionais. Evite RNAs guia com trechos homopoliméricos e conteúdo extremo de GC, pois esses recursos podem dificultar o processo de clonagem do RNA guia e reduzir a eficiência do direcionamento do RNA guia.

Reconstituir oligos de RNA guia a uma concentração final de 100 micromolares em água ultrapura. Deve haver pelo menos quatro oligos de RNA guia separados para cada região de interesse. Para cada região regulatória de interesse, crie um pool de todos os oligos correspondentes à região de interesse.

Em um tubo Eppendorf, combine cinco microlitros de cada oligo de RNA guia reconstituído individual para cada região. Misture bem a piscina por vórtice, remova um microlitro e dilua este eloquat 1 a 200 em água ultrapura. Realize uma PCR curta com os primers USICS para anexar regiões de homologia aos oligos, conforme detalhado no protocolo de texto.

Cerca de 40 bases serão adicionadas a cada oligo, produzindo um produto de aproximadamente 100 pares de bases que contém homologia suficiente para o espectro USIC em ambas as extremidades. Em seguida, configure as reações do Gibson Assembly no gelo. Use 50 nanogramas do vetor digerido e sete nanogramas da inserção em uma reação de 20 microlitros.

Além disso, configure uma reação de montagem Gibson somente de vetor digerido usando 50 nanogramas do vetor e substituindo o inserto por água. Incube as reações do conjunto Gibson por 15 minutos a 50 graus Celsius, seguido por uma retenção a 4 graus Celsius. Depois de transferir os produtos montados para o gelo, dilua-os de 1 a 4 em água ultrapura sobre gelo.

Por exemplo, adicione cinco microlitros de produto Gibson Assembly a 15 microlitros de água ultrapura. Em seguida, transforme os produtos Gibson Assembly diluídos. Coloque células competentes de alta eficiência no gelo e faça 25 eloquats de microlitro para cada transformação.

Se um pool complexo direcionado a vários locais for desejado, coloque células suficientes em tubos diferentes para realizar várias transformações independentes. Coloque 50 microlitros das células transformadas e coloque as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite. Para mini-preparações das piscinas direcionadas a locais individuais, coloque as células diretamente em três a cinco mililitros de caldo LB contendo ampicilina ou carbenicilina.

Incube as células durante a noite com agitação a 250 rpm e 37 graus Celsius. Para grandes bibliotecas, use um raspador de placas para coletar todas as colônias de cada placa individual em uma maxi-preparação. Isso pode ser facilitado despejando aproximadamente cinco mililitros de LB com o antibiótico apropriado em um tubo Falcon de 15 mililitros e raspando as colônias no tubo.

No dia anterior à transfecção, coloque as células em uma placa de 24 poços, a 30 a 50% de confluência. Plaquear células suficientes para que as transfecções possam ser realizadas em duplicata e incluir poços a serem transfectados com RNAs guia de controle. Certifique-se de que as células estejam distribuídas uniformemente pelo poço, agitando suavemente a placa após o revestimento das células.

Agite a cada cinco minutos nos primeiros 15 minutos. No dia seguinte, prepare as transfecções de acordo com as instruções do reagente de transfecção de sua escolha. Para células de Ishikawa, use 550 nanogramas de plasmídeo total para cada poço de uma placa de 24 poços.

Diluir os plasmídeos até uma concentração final de 020 microgramas por mililitro em meio isento de soro. Use três microlitros de reagente de transfecção para cada micrograma de DNA, vortex suavemente e incube por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione 25 microlitros da mistura final a cada poço.

Prepare um volume suficiente de tampão de lise com beta-mercaptoetanol a 1%. Aspire o meio usando um aspirador a vácuo. Lave as células uma vez com um volume igual de 1x PBS e aspire para remover o máximo de PBS possível.

Adicione 300 microlitros da solução BME de lise a cada poço, usando uma pipeta multicanal. Pipete a solução de lise para cima e para baixo oito a dez vezes e transfira para uma placa de poço profundo ou tubos Eppendorf de 1,7 mililitro no gelo. O RNA pode ser extraído imediatamente ou os lisados podem ser congelados a 80 graus Celsius negativos para processamento futuro.

Os desenhos de RNA guia são mostrados para os três locais de ligação do fator de transcrição próximos ao MMP17. A região alvo é o local de ligação para ER alfa, conforme definido por ChiP-seq, e os quatro RNAs guia se encaixam nessa região. Aqui é mostrado o produto de RNA guia esperado após uma PCR curta, usando os primers internos do USIC.

A reação adicionará 20 pares de bases de sequência a cada extremidade do fragmento de RNA guia de 59 pares de bases, resultando em uma sequência aproximada de 100 pares de bases. Os resultados qualitativos de PCR de um experimento Enhancer-I em MMP17 são mostrados. Os locais visados pelo Enhancer-I são indicados com um hexágono preto.

Os locais 1 e 2 são necessários para a resposta estrogênica completa da MMP17, enquanto o local 3 não contribui. O site 1 pode contribuir com alguma expressão por si só, mas a maior atividade é vista quando os sites 1 e 2 estão ativos. Uma vez otimizada para a linhagem celular de interesse, essa técnica pode ser feita em cinco a sete dias, se for realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar RNAs guia para o Enhancer-I, criar e transfectar pools complexos de RNAs guia e colher células transfectadas. Ao tentar este procedimento, é importante manter um ambiente de cultura de tecidos estéril e usar materiais livres de RNase e DNase. Após esse procedimento, outros métodos, como ChiP-seq e RNA-seq, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como onde no genoma o Enhancer-I está se ligando e como ele está afetando a expressão gênica global.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a regulação gênica induzida por estrogênio em loci endógenos no genoma humano, em vez de usar repórteres epissómicos. Não se esqueça de que trabalhar em ambientes de cultura de tecidos de mamíferos pode ser perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.