Name: Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a dissecar funções de enhancers usando CRISPR multiplexado em linhas celulares. Este método permite identificar regiões reguladoras que controlam a expressão gênica simultaneamente.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH/tempo R00 HG006922 e HG008974 de R01 NIH/tempo de J.G. e o Instituto de câncer Huntsman. J.B.C. foi apoiada pelo programa de treinamento de NIH em genética T32GM007464.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um método simples e flexível para dissecar função potenciador no locus genômico endógena sem fisicamente alterar a sequência de DNA. Enquanto similar em conceito a protocolos de interferência CRISPR anteriormente publicados usando dCas9-CASCUDO27, Enhancer-i difere esses protocolos de 3 maneiras. Primeiro, Enhancer-i utiliza o domínio interagindo SIN3A de MAD120 para alcançar a desativação do realçador. Desativação de potenciador pode ser resgatada usando inibidores HDAC, sugerindo que o mecanismo primário de desativação é dependente de HDAC. Ao contrário de interferência CRISPR com dCas9-CASCUDO, Enhancer-i não leva à deposição de H3K9me3. Isto é provavelmente devido ao fato de que Enhancer-i baseia-se na transitória introdução guia RNAs, para o post com as células, sendo colhidas aos 3 dias do transfection. Interferência de CRISPR, observa-se um aumento na H3K9me3 em 7 dias post transdução12. Finalmente, o protocolo de Enhancer-i fornece uma estratégia para vários sites de destino simultaneamente e monitorar a eficiência da segmentação. Em mosaico-seq17, dCas9-CASCUDO é usado para direcionar potenciadores de múltiplos simultaneamente, mas esta técnica se baseia em sequenciamento de RNA monocelulares identificar alterações de expressão, e muitos genes (tais como genes hormona-responsivo) passam despercebidos devido a baixa sensibilidade da célula única RNA-Seq Enhancer-i fornece um método confiável para estudar potenciadores individualmente e em combinação para qualquer gene.
A etapa mais crítica de Enhancer-i é transfeccao, quais deve ser otimizado para a linhagem de células de interesse. Este protocolo se baseia em puromicina enriquecer para células transfectadas, mas é possível que o co transfecting guia RNAs com uma proteína fluorescente e a classificação para as células fluorescentes usando citometria de fluxo pode vir a ser um melhor método de enriquecimento para uma célula tipos. Recomenda-se monitoramento do nível de expressão do guia RNAs e SID4x-dCas9-CASCUDO por qPCR para solucionar problemas e confirmar a transfeccao. Se a guia RNA níveis são baixos (ciclo limite > 30), os usuários também podem considerar guia alternativo estratégias de produção de RNA como em vitro transcrição28. Também é possível que apesar de gRNA altos níveis, guia RNA alvo da proteína SID4x-dCas9-CASCUDO é ineficiente, caso em que selecionando diferentes: guia de sequências de RNA pode ser necessário. Por meio de ChIP-seq a proteína de fusão com cromatina das células tratada Enhancer-i, a eficiência de segmentação pode ser monitorada. Se houver sinal elevado de SID4x-dCas9-CASCUDO na região de interesse, e sem alterações de expressão em seu gene alvo putativo são detectadas, então a região provável não contribui para a expressão de que gene nas condições estudadas.
Uma limitação potencial de Enhancer-i é que efeitos fora do alvo podem acumular-se se há muitos sites são direcionados simultaneamente. No entanto, estratégias de interferência CRISPR por nocaute tem menos fora alvo dos efeitos do RNAi29, especialmente quando é usada uma linha de celular policlonal expressando dCas9-CASCUDO. Enquanto nós vimos o alvo genômica vinculação de SID4X-dCas9-CASCUDO ao direcionamento 10 sites simultaneamente, não identificamos as mudanças de expressão de gene como resultado desses eventos de vinculação. Como alguns intensificadores podem contatar vários promotores e/ou outros potenciadores, é possível que muitos genes podem mudar a expressão sobre o direcionamento de um único potenciador, embora não está claro se esta forma de regulação genética é comum. Para confirmar que as mudanças de expressão observaram são devido ao direcionamento de um específico potenciador e não fora do alvo os efeitos, os usuários podem executar Enhancer-i com dois conjuntos distintos de disjunto guia RNAs direcionamento da mesma região. Além disso, a exclusão genética da região usando Cas9 nuclease-competente pode confirmar ainda mais seus efeitos na expressão gênica.
Como funções de Enhancer-i através da deacetilação de histona, é possível que suas habilidades de desativação são limitadas para potenciadores que têm níveis apreciáveis de acetilação da histona. Há uma variedade de fusões de repressivos alternativos que pode ser mais eficaz no direcionamento específicos potenciadores. Fusões de DNA metiltransferase para dCas9 podem ser usados para reduzir a expressão de gene quando direcionados para distal potenciadores de30, mas essa repressão muitas vezes não é transitória. Outra fusão repressiva usa o domínio de amigo de GATA1 (FOG1), que leva a histona H3 lisina 27 trimethylation e reprime a expressão gênica em níveis semelhantes para dCas9-CASCUDO através de uma variedade de células linhas e promotores31. Curiosamente, adicionar mais cópias de FOG1 para dCas9 reduziu o potencial repressivo em promotores, sugerindo que uma única cópia do domínio SID pode fornecer mais desativação potenciador do que as 4 cópias atualmente utilizados nas Enhancer-i. É possível que alguns loci pode beneficiar de dupla definião de combinações diferentes das fusões de dCas9 acima. Por exemplo, repressão de longo prazo estável pode ser conseguida simultânea transdução de dCas9-DNMT3a e dCas9-CASCUDO32. Maior parte destas fusões repressivas têm sido alvo de um único locus cada vez, e ele ainda não está claro que é mais eficaz na manipulação potenciadores de múltiplos simultaneamente.
Potenciador-i, enquanto um método adequado para estudar combinações de potenciadores de por um punhado de genes, é ainda um pouco limitada na taxa de transferência se o usuário deseja estudar putativos potenciadores para centenas de genes. Futuras aplicações desta técnica irão incorporar tecnologias baseadas em imagem para quantificar vários genes em amostras múltiplas simultaneamente. Importante, essas tecnologias são compatíveis com detecção direta de moléculas de RNA de lisado, eliminando a necessidade de isolamento de RNA demorada. Estas adaptações facilitam o interrogatório de conjuntos maiores de realçadores.

Em grande escala sequenciamento projetos como ENCODE1, roteiro Epigenomics2e FANTOM3 identificaram milhões de realçadores putativos dentro do genoma humano em centenas de tipos de células. Estima-se que cada promotor associa-se com uma média de 4,9 potenciadores e cada potenciador de contatos uma média de 2,4 genes3, sugerindo que a expressão gênica é muitas vezes o resultado da integração de múltiplas interações reguladoras distribuídas. Um desafio significativo remanescente é definir não só individuais como potenciadores de contribuam para a expressão do gene, mas como eles se combinam para afetar a expressão. Abordagens genéticas são comumente usadas para identificar as relações entre potenciadores em organismos-modelo de drosófila4 para ratos5. No entanto, estas experiências são morosas e de baixo rendimento para o estudo de múltiplas potenciadores de múltiplos genes.
Uma abordagem para estudar a função potenciador em grande escala envolve ensaios repórter massivamente paralelo. Estes ensaios permitem a exibição simultânea de milhares de sequências de DNA por sua capacidade de conduzir a expressão de um gene de repórter6. Enquanto estes ensaios têm mostrado que a sequência de DNA sozinho pode ser suficiente para transmitir o gene Regulamento informações7, eles vêm com as advertências de sendo executada fora do contexto de cromatina nativa e com um promotor heterólogo. Além disso, o tamanho da sequência de DNA, sendo analisado em ensaios de repórter maciçamente paralelo é geralmente basepairs menos de 200, que podem excluir a sequência relevante circundante. Importante, como repórter ensaios apenas medem a atividade de uma sequência de cada vez, eles não levam em conta as relações complexas que podem existir entre potenciadores. Assim, enquanto repórter maciçamente paralelo ensaios podem ser informativos sobre a atividade intrínseca de uma sequência de DNA, eles não necessariamente nos informar sobre a função dessa sequência de DNA no contexto do genoma.
Recentemente desenvolvidos CRISPR/Cas9 ferramentas8 facilitaram o estudo da regulação genética, já que permitem a exclusão de realçadores no locus endógeno. No entanto, excluir potenciadores de múltiplos simultaneamente pode levar à instabilidade genômica e é demorado para gerar exclusões potenciador sucessivas em uma linha única célula. Além disso, nova sequência genômica é criada no site da exclusão após o reparo, e essa sequência pode ganhar função reguladora. Uma versão alternativa do Cas9 foi desenvolvida especificamente para modular a expressão gênica, contando com fusões de ativação9,10 ou reprimir11,12 domínios de forma deficiente nuclease das Cas9 (dCas9). Estas proteínas de fusão são ideais para estudar simultaneamente múltiplos loci, como eles não fisicamente alterar a sequência de DNA e em vez disso, modulam epigenética para interrogar uma região reguladora. A fusão repressiva mais amplamente utilizada é CASCUDO, que recruta o complexo de repressor co KAP1, promovendo a deposição da repressão-associado histona H3 lisina 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-CASCUDO, também conhecido como CRISPR interferência14, tem sido usada para alvo e tela potenciadores individuais por suas contribuições para o de15,de expressão do gene16; no entanto, isso não foi otimizado para segmentação de várias regiões simultaneamente. Uma versão do multiplex interferência CRISPR para realçadores, mosaico-seq17, usa única célula RNA-seq como uma leitura, mas esta tecnologia é caro e indicado apenas para o estudo de genes altamente expressos devido à baixa sensibilidade de uma única célula RNA-Seq
Temos procurado desenvolver um método baseado em interferência de CRISPR para dissecar função combinatória potenciador dentro do contexto de uma resposta transcricional de estrogênio. Cerca de metade dos genes hormona-responsivo contêm 2 ou mais potenciadores vinculados pela Alfa do receptor de estrógeno (ER) nas proximidades de18, sugerindo que potenciadores de múltiplas podem ser participantes em resposta ao estrogênio e compreender que a lógica de regulamentação exigiria segmentação potenciadores de múltiplos simultaneamente. Como os estudos iniciais usando interferência CRISPR em promotores sugeriram que nem todos os promotores são igualmente responsivos a repressão mediada por CASCUDO19, nós raciocinou que a adição de um domínio repressivo distinta para dCas9 pode facilitar a desativação de potenciadores de diversas. Escolhemos o interagindo na Sin3a domínio de Mad1 (SID)20 como ele leva para o recrutamento de histona deacetilases21, que removem grupos acetila em histonas que estão associados com a atividade transcricional. Importante, o domínio de SID foi eficaz em reduzir a expressão de gene quando fundido dCas922 e contos23, e Sin3a tem demonstrado ser um potente repressivo co-fator em uma variedade de potenciador sequência contextos24. Costumávamos a alvo 10 diferentes realçadores vinculados a ER SID4x-dCas9-CASCUDO (Enhancer-i) e identificar os locais obrigatórios de ER (ERBS) que são necessários para a resposta transcricional de estrogênio em 4 genes18. Também escolhemos as combinações de potenciadores para identificar os sites que cooperam na produção da resposta transcricional de estrogênio. Achamos que até 50 sites pode potencialmente ser alvo simultaneamente com as mudanças de expressão de gene detectável. Usando o ChIP-seq e RNA-seq, demonstrámos que Enhancer-i é uma técnica altamente específica para estudar potenciadores de múltiplos simultaneamente.
Este protocolo, descreveremos as etapas envolvidas na realização de Enhancer-i, uma técnica flexível que permite o estudo funcional de potenciadores de múltiplos simultaneamente em uma configuração de cultura de tecidos. Potenciador-i está altamente correlacionada com deleção genética mas fornece desativação transiente que é dependente de histona deacetilases (HDACs). Entregando a guia RNAs através de transfecção transiente em oposição a integração estável através de vetores virais, este protocolo evita deposição e potencial de disseminação de H3K9me3. Este protocolo detalhes guia RNA design e clonagem através de montagem de Gibson, o transfection de guia RNAs usando lipofection, e a análise resultante da expressão do gene alterado por qPCR. Nós também incluímos os métodos para avaliar a especificidade do Enhancer-i visando ao nível do genoma e transcriptoma. Enquanto esta técnica foi desenvolvida para estudar a regulação gênica por ER vinculado potenciadores em linhas de células cancerosas humanas, é aplicável para a dissecação de qualquer realçador de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Kit de RNA rápido de 96 poços ZR</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1 Etapa</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restrição AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR de alta fidelidade Master Mix com tampão HF</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Limpo & Kit Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células de Ishikawa</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac coelho policlonal Motivo</td><td>Ativo&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 coelho policlonal</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG mouse monoclonal</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER coelho alfa policlonal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro plasmídeo</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector plasmídeo</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 plasmídeo puromicina</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB plasmídeo</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPure DNase/RNase-Free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio Sérico Reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Kit de mRNA-Seq Encalhado, com Contas de Captura de mRNA KAPA</td><td>Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Mini comprimidos para inibidores de protease e fosfatase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico seletivo geneticina (sulfato G418) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA de 2 Logs Roxo de Carregamento Rápido</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecação do enhancer função usando interferência multiplex enhancer crispr-baseado em linhas de células

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Potenciadores de múltiplas vezes regulam um determinado gene, no entanto, para a maioria dos genes, ainda não está claro quais realçadores são necessários para a expressão do gene, e como estes potenciadores combinam para produzir uma resposta transcricional. Como milhões de realçadores foram identificados, ferramentas de alta produtividade são necessários para determinar a função de potenciador na escala do genoma. Métodos atuais para estudar a função potenciador incluem fazer genéticas exclusões usando Cas9 nuclease-proficiente, mas é difícil de estudar os efeitos combinatórios de realçadores múltiplos usando esta técnica, como várias linhas sucessivas clonal de célula devem ser gerados. Aqui, apresentamos Enhancer-i, um método baseado em interferência CRISPR que permite o interrogatório funcional de potenciadores de múltiplos simultaneamente em seus loci endógena. Potenciador-i empreg dois domínios repressivos fundidos a nuclease deficiente Cas9, SID e CASCUDO, para alcançar a desativação do realçador através de deacetilação de histona em loci alvo. Este protocolo utiliza transfection transiente de guia RNAs para habilitar transitória inactivação das regiões alvo e é particularmente eficaz em bloquear inducible transcriptional respostas aos estímulos em configurações de cultura de tecidos. Potenciador-i é altamente específica, tanto em seu direcionamento genômica e seus efeitos na expressão gênica global. Resultados obtidos com este protocolo ajudam a compreender se um intensificador está a contribuir para a expressão do gene, a magnitude da contribuição e como a contribuição é afectada por outros potenciadores nas proximidades.

A Figura 1 mostra um diagrama de fluxo de trabalho descrito no protocolo. Para determinar as contribuições dos realçadores de ER-limite perto o estrogênio-regulado do gene MMP17, que tem 3 sítios de ligação nas proximidades, definidos pelo ChIP-seq (Figura 2A), guia de RNAs foram projetados para cada região. Para a concepção de guia RNAs, uma janela de bp de 600-900 da sequência que cercam cada ER local obrigatório de interesse foi selecionado e colocar em um programa de design de RNA guia. RNA resultando guia sequências com 0-2 prevista fora do alvo locais foram alinhados para o genoma humano usando BLAT. Quatro não-sobreposição guia RNAs que atravessavam a região definida pelo ChIP-seq e DNaseI hipersensibilidade foram escolhidos para o direcionamento (Figura 2B). Sequência adicional (tabela 1) foi adicionada a cada extremidade para facilitar a jusante de clonagem e o resultante 59 fragmentos de nucleotídeos foram ordenados. À chegada, guia RNAs foram diluídos e agrupados por site e um curto PCR foi realizado para adicionar regiões de homologia antes da montagem de Gibson. A Figura 2 mostra o produto de RNA guia esperado após um curto PCR utilizando primers "U6_internal" (tabela 1), que irão adicionar 20 basepairs de sequência para cada extremidade do basepair 59 guia fragmento de RNA, resultando em uma sequência de basepair ~ 100. Na sequência de montagem de Gibson, estas piscinas guia RNA foram transformadas em bactérias e plasmídeo minipreps foram preparados no dia seguinte. Figura 2D mostra resultados de um experimento de dissecação potenciador, onde múltiplos potenciadores nas proximidades de MMP17 são direcionados em paz e em combinação usando Enhancer-i. Sites direcionados por Enhancer-i são indicados com um hexágono preto. Plasmídeos de RNA guia a indicada em sítios foram transfectados em uma linhagem de células de Ishikawa privado de estrogênio estàvel expressando SID4X-dCas9-CASCUDO. Dois dias depois, a mídia foi alterada e puromicina foi adicionada para enriquecer para células transfectadas. No dia seguinte, as células foram colhidas após um tratamento de estradiol 8 h 10 nM. RNA foi isolado, e um One-Step qPCR foi realizada. Neste exemplo, sites 1 e 2 são necessários para uma completa resposta estrogênica de MMP17, enquanto o site 3 não contribui sob essas condições (Figura 2D, pistas ii-iv). Quando apenas sites de 2 ou 3 são ativos (vi e vii), a resposta de estrogênio é semelhante a quando não locais são ativos (viii), sugerindo que esses sites não podem contribuir de forma independente. Local 1 pode contribuir alguma expressão por si só (v), mas a maior atividade é vista quando sites 1 e 2 são ativos (iv).
Para manipular 10 potenciadores perto de 4 genes diferentes simultaneamente (Figura 3A), complexas piscinas de guia RNAs foram gerados contendo 42 potenciador de guias e 16 guias de promotor. Guia do RNA oligos foram agrupados antes o guia inicial extensão RNA PCR (passo 3.3), e produtos resultantes da PCR foram purificados e combinados com o vetor de clonagem puromicina vazio U6 usando assembly de Gibson. Após a montagem de Gibson, várias transformações independentes foram realizadas e chapeadas. As placas foram raspadas em LB e permitiu a crescer para 2-4 h antes de maxiprep. Figura 3B mostra representativas reduções na expressão gênica por qPCR quando esses pools de RNA guia foram transfectadas em uma linhagem de células de Ishikawa privado de estrogênio estàvel expressando SID4X-dCas9-CASCUDO e tratados conforme descrito acima (Figura 2D). Reduções de Enhancer-i são semelhantes aos obtidos pela segmentação do promotor do gene alvo putativo. A Figura 3 mostra os efeitos de diluição de guia RNAs na redução da resposta estrogênio usando Enhancer-i. Um 01:50 diluição de um pool de guia RNA visando o realçador perto G0S2 ainda produz redução significativa na expressão gênica, sugerindo que o Enhancer-i pode ser usado para atingir até 50 sites de uma só vez. No entanto, a desativação pode ser diluída, indicando que centenas de sites não podem ser alvo simultaneamente, a menos que os métodos de deteção mais sensíveis são empregados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Figura 1. Protocolo esquemático para dissecação potenciador multiplex usando Enhancer-i. Guia de RNAs (vermelhos e azuis) são projetados usando e-batata frita e selecionado usando o UCSC genome browser. Guia quatro RNAs são escolhidos que abrangem as regiões de interesse (transcrição locais obrigatórios do fator conforme definido pelo ChIP-seq). Oligonucleotídeos de RNA guia que têm sido colocados em pool pela região de interesse (vermelho e azul) passam por um PCR para adicionar regiões de homologia (laranja) antes da montagem de Gibson e transformação. Piscinas de plasmídeo resultante são transfectadas através de lipofection em linhagens celulares expressando estàvel CASCUDO-SID4X-dCas9 ou em células de tipo selvagem, em conjunto com o plasmídeo SID4X-dCas9-CASCUDO. Guia do RNA do plasmídeo piscinas podem transfected individualmente para um site de destino de cada vez, ou em combinação para atingir vários sites simultaneamente. Células transfectadas são tratadas com antibióticos para enriquecer para células contendo guia de RNAs. A transfeccao de post ~ 72 h, as células são colhidas. Os ácidos nucleicos podem ser extraídos para qPCR, RNA-seq ou ChIP-Seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Figura 2. Guia de dissecação de design e potenciador de RNA para MMP17. (A) genoma navegador screenshot dos realçadores alfa-limite ER (cinza) ser alvo perto MMP17. Esta figura foi modificada de Carleton, et al 18. (B) guia de RNA projeta para o 3 vinculação sites18. O sítio de ligação para ER, conforme definido pelo ChIP-seq é o alvo e a telha de RNAs 4 guia em toda esta região. O sinal de sensibilidade DNaseI, que atravessa o sítio de ligação, também pode ser usado para definir a sequência de destino para o guia de design de RNA. Tanto ChIP-seq e dados DNaseI HS foram obtidos de Ishikawa células tratadas com estradiol de nM 10 para sequências de RNA de guia representante (C) h. 1 que estão prontos para a montagem de Gibson, tendo sofrido uma PCR curto para adicionar regiões de homologia. (D) expressão relativa da MMP17 medido através de qPCR seguindo o direcionamento de regiões específicas com Enhancer-i e um tratamento de estradiol h10-8 nM. Expressão é em relação ao nível de MMP17 em células não tratadas com estradiol CTCF e expressão. Guia de controle RNAs alvo o promotor da IL1RN. Todas as barras de erro representam SEM, asteriscos duplos indicam p &lt; 0,01 e único asteriscos indicam p &lt; 0.05 em um teste t pareado. Esta figura foi modificada de Carleton, et al. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Figura 3. Como alvo múltiplas potenciadores perto genes diferentes simultaneamente com pool Enhancer-i. (A) diagrama esquemático dos sítios de ligação e promotores para ser alvo de Enhancer-i em pool. (B) os efeitos na expressão medida pelo qPCR após tratamento E2 em Ishikawa células transfectadas com piscina de plasmídeo Enhancer-i (verde), piscina de plasmídeo de promotor-i (azul) ou controle gRNAs (branco)18. Observa-se uma redução significativa em todos os genes com Enhancer-i. Esta figura foi modificada de Carleton, et al. 18. (C) os efeitos sobre os níveis de expressão de G0S2 após o tratamento de E2 em Ishikawa células transfectados com diferentes quantidades de guia RNAs segmentação G0S2. Uma redução significativa pode ser vista mesmo com pequenas quantidades de guia do RNA (01:50 diluição), sugerindo que até 50 sites pode alvo simultaneamente. Todas as barras de erro representam SEM, asteriscos duplos indicam p &lt; 0,01 e único asteriscos indicam p &lt; 0.05 em um teste t pareado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Sequência de</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Primers utilizados para extensão de RNA guia e sequenciamento, qPCR e a detecção da proteína de fusão.

Este protocolo descreve as etapas necessárias para projetar e executar a segmentação multiplexada de realçadores com a proteína de fusão desativação CASCUDO-SID4X-dCas9, também conhecido como interferência de realçador (Enhancer-i). Este protocolo permite a identificação de potenciadores que regulam a expressão gênica e facilita a dissecação das relações entre potenciadores de regulação de um gene alvo comum.

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica e regulação gênica, como como várias regiões reguladoras de genes, também conhecidas como intensificadores, trabalham juntas para controlar a transcrição. A principal vantagem dessa técnica é que vários intensificadores próximos a vários genes diferentes podem ser testados simultaneamente para identificar rapidamente as regiões envolvidas na regulação gênica. Para iniciar o projeto do RNA guia, primeiro gere sequências de DNA conforme descrito no protocolo de texto.Use um programa como o E-CRISP nas sequências de DNA geradas para encontrar RNAs guia com baixos alvos fora dos alvos. Os RNAs guia consistem em 20 nucleotídeos a montante de um motivo adjacente ao protoespaçador, que assume a forma de NGG para o dCas9 de S. pyogenes. No site do E-CRISP, selecione o organismo de interesse usando o menu suspenso.A montagem do genoma aparece à direita do nome da espécie. Selecione o botão de opção Entrada é sequência FASTA. Copie as sequências FASTA de cima e cole-as na caixa de diálogo.Certifique-se de que um cabeçalho FASTA esteja incluído para cada sequência. Selecione o botão de opção médio e Design único no menu suspenso. Clique no botão Iniciar pesquisa de gRNA único.Uma nova guia do navegador será aberta e os resultados serão exibidos. Baixe as sequências candidatas clicando no botão Baixar um relatório tabular formulado pelo Excel para todas as sequências de consulta juntas. Em seguida, use o navegador de genoma UCSC para BLAT candidato a sequências de RNA guia de comprimento total para o genoma.Em um navegador, navegue até o site do navegador do genoma da UCSC. Na seção Nossas ferramentas, localize a palavra BLAT e clique nela. A ferramenta de pesquisa BLAT será aberta.Use os menus suspensos localizados sob o texto do genoma de pesquisa BLAT para selecionar o organismo e o conjunto do genoma de interesse. Copie as sequências de RNA guia do relatório tabular gerado pelo E-CRISP e cole-as na caixa de diálogo. Certifique-se de que cada sequência tenha um cabeçalho FASTA exclusivo e clique em enviar na parte inferior da caixa de diálogo.Na página de resultados da pesquisa BLAT, os alinhamentos de cada sequência de RNA guia aparecerão, com cada linha representando um alinhamento. Idealmente, deve haver um alinhamento para cada RNA guia, indicando a singularidade desse RNA guia. Evite guias que mapeiam para vários locais no genoma, se possível.Para examinar a localização e distribuição do RNA-guia na região de interesse, clique no link do navegador na seção Ações para um dos RNAs-guia consultados. O navegador do genoma aparecerá e será centralizado no RNA guia selecionado. Use os botões de zoom out na parte superior da página para visualizar a distribuição de outros RNAs guia identificados pelo E-CRISP na região de interesse.Selecione quatro, de preferência não sobrepostos, RNAs guia que estão distribuídos por toda a região de interesse. Se a região de interesse exceder 600 pares de bases, considere adicionar uma ou duas guias adicionais. Evite RNAs guia com trechos homopoliméricos e conteúdo extremo de GC, pois esses recursos podem dificultar o processo de clonagem do RNA guia e reduzir a eficiência do direcionamento do RNA guia.Reconstituir oligos de RNA guia a uma concentração final de 100 micromolares em água ultrapura. Deve haver pelo menos quatro oligos de RNA guia separados para cada região de interesse. Para cada região regulatória de interesse, crie um pool de todos os oligos correspondentes à região de interesse.Em um tubo Eppendorf, combine cinco microlitros de cada oligo de RNA guia reconstituído individual para cada região. Misture bem a piscina por vórtice, remova um microlitro e dilua este eloquat 1 a 200 em água ultrapura. Realize uma PCR curta com os primers USICS para anexar regiões de homologia aos oligos, conforme detalhado no protocolo de texto.Cerca de 40 bases serão adicionadas a cada oligo, produzindo um produto de aproximadamente 100 pares de bases que contém homologia suficiente para o espectro USIC em ambas as extremidades. Em seguida, configure as reações do Gibson Assembly no gelo. Use 50 nanogramas do vetor digerido e sete nanogramas da inserção em uma reação de 20 microlitros.Além disso, configure uma reação de montagem Gibson somente de vetor digerido usando 50 nanogramas do vetor e substituindo o inserto por água. Incube as reações do conjunto Gibson por 15 minutos a 50 graus Celsius, seguido por uma retenção a 4 graus Celsius. Depois de transferir os produtos montados para o gelo, dilua-os de 1 a 4 em água ultrapura sobre gelo.Por exemplo, adicione cinco microlitros de produto Gibson Assembly a 15 microlitros de água ultrapura. Em seguida, transforme os produtos Gibson Assembly diluídos. Coloque células competentes de alta eficiência no gelo e faça 25 eloquats de microlitro para cada transformação.Se um pool complexo direcionado a vários locais for desejado, coloque células suficientes em tubos diferentes para realizar várias transformações independentes. Coloque 50 microlitros das células transformadas e coloque as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite. Para mini-preparações das piscinas direcionadas a locais individuais, coloque as células diretamente em três a cinco mililitros de caldo LB contendo ampicilina ou carbenicilina.Incube as células durante a noite com agitação a 250 rpm e 37 graus Celsius. Para grandes bibliotecas, use um raspador de placas para coletar todas as colônias de cada placa individual em uma maxi-preparação. Isso pode ser facilitado despejando aproximadamente cinco mililitros de LB com o antibiótico apropriado em um tubo Falcon de 15 mililitros e raspando as colônias no tubo.No dia anterior à transfecção, coloque as células em uma placa de 24 poços, a 30 a 50% de confluência. Plaquear células suficientes para que as transfecções possam ser realizadas em duplicata e incluir poços a serem transfectados com RNAs guia de controle. Certifique-se de que as células estejam distribuídas uniformemente pelo poço, agitando suavemente a placa após o revestimento das células.Agite a cada cinco minutos nos primeiros 15 minutos. No dia seguinte, prepare as transfecções de acordo com as instruções do reagente de transfecção de sua escolha. Para células de Ishikawa, use 550 nanogramas de plasmídeo total para cada poço de uma placa de 24 poços.Diluir os plasmídeos até uma concentração final de 020 microgramas por mililitro em meio isento de soro. Use três microlitros de reagente de transfecção para cada micrograma de DNA, vortex suavemente e incube por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione 25 microlitros da mistura final a cada poço.Prepare um volume suficiente de tampão de lise com beta-mercaptoetanol a 1%. Aspire o meio usando um aspirador a vácuo. Lave as células uma vez com um volume igual de 1x PBS e aspire para remover o máximo de PBS possível.Adicione 300 microlitros da solução BME de lise a cada poço, usando uma pipeta multicanal. Pipete a solução de lise para cima e para baixo oito a dez vezes e transfira para uma placa de poço profundo ou tubos Eppendorf de 1,7 mililitro no gelo. O RNA pode ser extraído imediatamente ou os lisados podem ser congelados a 80 graus Celsius negativos para processamento futuro.Os desenhos de RNA guia são mostrados para os três locais de ligação do fator de transcrição próximos ao MMP17. A região alvo é o local de ligação para ER alfa, conforme definido por ChiP-seq, e os quatro RNAs guia se encaixam nessa região. Aqui é mostrado o produto de RNA guia esperado após uma PCR curta, usando os primers internos do USIC.A reação adicionará 20 pares de bases de sequência a cada extremidade do fragmento de RNA guia de 59 pares de bases, resultando em uma sequência aproximada de 100 pares de bases. Os resultados qualitativos de PCR de um experimento Enhancer-I em MMP17 são mostrados. Os locais visados pelo Enhancer-I são indicados com um hexágono preto.Os locais 1 e 2 são necessários para a resposta estrogênica completa da MMP17, enquanto o local 3 não contribui. O site 1 pode contribuir com alguma expressão por si só, mas a maior atividade é vista quando os sites 1 e 2 estão ativos. Uma vez otimizada para a linhagem celular de interesse, essa técnica pode ser feita em cinco a sete dias, se for realizada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar RNAs guia para o Enhancer-I, criar e transfectar pools complexos de RNAs guia e colher células transfectadas. Ao tentar este procedimento, é importante manter um ambiente de cultura de tecidos estéril e usar materiais livres de RNase e DNase. Após esse procedimento, outros métodos, como ChiP-seq e RNA-seq, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como onde no genoma o Enhancer-I está se ligando e como ele está afetando a expressão gênica global.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a regulação gênica induzida por estrogênio em loci endógenos no genoma humano, em vez de usar repórteres epissómicos. Não se esqueça de que trabalhar em ambientes de cultura de tecidos de mamíferos pode ser perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

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Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

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Edição de Epigenoma CRISPR em Células Humanas usando Transfecção de DNA de Plasmídeo e Entrega de Nucleofecção de mRNA

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aprenda a dissecar funções de enhancers usando CRISPR multiplexado em linhas celulares. Este método permite identificar regiões reguladoras que controlam a expressão gênica simultaneamente.

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

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