Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mecânica nuclear. Por exemplo, qual é a força necessária para deformar o núcleo em uma célula? Quais são as contribuições dos componentes celulares e nucleares para a resistência nuclear à deformação?

Ou o acoplamento nuclear com estruturas celulares varia de acordo com o tipo de célula? A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite aplicar força de sondagem para deformar o nucleocitoesqueleto integrador em uma célula aderente viva. Embora esse método tenha sido usado para fornecer informações sobre as propriedades mecânicas nucleares em células NIH-3T3, ele também pode ser aplicado a qualquer tipo de célula aderente, como sondar propriedades mecânicas nucleares em células progeriais de Hutchinson-Gilford.

Para iniciar este procedimento, cubra um prato de fundo de vidro de 35 milímetros com 5 microgramas por mililitro de fibronectina. Em seguida, cultive as células de fibroblastos NIH 3T3 em DMEM suplementadas com 10% de soro bovino doador e 1% de penicilina-estreptomicina na placa revestida a 37 graus Celsius até a confluência desejada. Imediatamente antes do experimento, lave as células duas vezes com PBS, seguido de uma única lavagem com meio de crescimento completo.

Depois, adicione três mililitros de meio de crescimento completo a um prato com fundo de vidro. Neste procedimento, ligue o microinjetor. Usando um conta-gotas de óleo de imersão, aplique uma gota de óleo de imersão na lente objetiva.

Em seguida, prenda o prato firmemente no suporte do prato e carregue-o no stage. Observe que as células devem ser mantidas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante todo o experimento. Em seguida, ajuste a altura da objetiva para colocar as células em foco.

Mova o estágio do microscópio para encontrar uma célula de interesse. Usando o micromanipulador, mova o porta-pipetas para a posição mais alta. Em seguida, carregue a micropipeta com uma ponta de 0,5 micrômetro de diâmetro no porta-pipetas.

Em seguida, eleve o plano focal da objetiva acima do plano A e a parte superior da célula para o plano B, ajustando o controle fino. Em seguida, coloque o micromanipulador na posição de controle grosseiro. Lentamente, traga a micropipeta para o plano B, observando a silhueta da micropipeta até que a micropipeta entre totalmente em foco.

Quando a ponta da micropipeta estiver em foco, defina o micromanipulador para controle fino. Em seguida, abaixe a objetiva até o plano equatorial da célula e abaixe a micropipeta para cerca de 15 micrômetros acima disso. Defina a pressão de compensação no microinjetor para a pressão desejada.

Aguarde alguns segundos para que a pressão se estabilize. É importante verificar se a ponta da pipeta está quebrada ou entupida, caso contrário, a medição da força seria imprecisa. Certifique-se de que a micropipeta não esteja entupida usando a configuração limpa no painel do micromanipulador e certifique-se de que as bolhas de ar saiam da ponta da micropipeta.

Em seguida, insira a ponta da micropipeta na célula até que ela toque levemente a superfície nuclear. Crie uma vedação entre a ponta da micropipeta e a membrana nuclear desconectando o tubo de suprimento de pressão do sistema de microinjeção, abrindo assim a extremidade da micropipeta para a atmosfera. Esta etapa cria uma pressão negativa igual à pressão de compensação na superfície nuclear.

Em seguida, abra o software de coleta de imagens. Configure uma aquisição AVI para vídeo ou aquisição ND para imagens no software de coleta de imagens. Em seguida, alterne para o canal de imagem fluorescente correspondente e comece a criar imagens.

Afaste a ponta da micropipeta do corpo da célula até que o núcleo se desprenda da micropipeta. Esta figura mostra a força de um núcleo de fibroblasto de camundongo NIH 3T3. À medida que a ponta da micropipeta se move para a direita, o núcleo se deforma e, eventualmente, se desprende da ponta da micropipeta.

A deformação do comprimento do núcleo aumenta com o aumento da força de sucção. A borda frontal do núcleo forma uma protrusão nuclear e a borda de fuga é deslocada de sua posição original. O comprimento da protrusão é muito maior do que o deslocamento da borda de fuga, sugerindo uma forte integração entre o núcleo e o citoplasma circundante.

As escalas de tempo são curtas para o relaxamento da borda frontal nuclear e da borda traseira nuclear. A sonda de força direta foi usada para determinar a contribuição das estruturas intranucleares e do citoesqueleto para a resistência do núcleo à deformação. Imagens fluorescentes mostraram a sobreposição do núcleo antes e depois na condição indicada.

Embora não tenham sido encontradas diferenças significativas na deformação ou tradução nuclear após a ruptura da F-actina ou ruptura dos microtúbulos, a redução da expressão de menten por meio do knockdown baseado em siRNA resultou em tradução e deformação nuclear significativamente maiores. Isso sugere que os filamentos intermediários dos fibroblastos são o principal elemento do citoesqueleto que ajudou o núcleo a resistir à força local. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar uma força controlada e conhecida ao núcleo em uma célula aderente viva.