Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

O objetivo geral deste procedimento é identificar pequenas moléculas capazes de interromper a interação entre os canais TRIP8b e HCN. Este método identifica moléculas candidatas que podem ser desenvolvidas em novos tratamentos para a depressão. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser concluída de maneira de alto rendimento.

Essa técnica tem implicações para o desenvolvimento de uma nova terapia para transtorno depressivo maior porque nosso laboratório mostrou que interromper a ligação de TRIP8b ao HCN pode ser um benefício terapêutico. Embora este método tenha sido desenvolvido com a depressão em mente, interromper a interação entre TRIP8b e HCN pode ser um benefício terapêutico em outros distúrbios, como dor crônica. A demonstração visual deste protocolo é importante porque ilustra os benefícios do uso de instrumentos automatizados de alto rendimento para avançar na pesquisa básica e translacional em instalações abertas, como o laboratório de análise de alto rendimento da Northwestern University.

Depois de purificar o fragmento de proteína TRIP8b 241-602 e examinar as interações proteína-proteína com um controle positivo de acordo com o protocolo de texto, descongele as alíquotas de TRIP8b e HCN1-FITC e mantenha-as no gelo. Use o FP Buffer para preparar 20 mililitros de 2 micromolares TRIP8b e 50 nanomolares HCN1-FITC. Em seguida, dispense 25 microlitros da mistura em cada poço de uma placa de microtitulação preta de 384 poços de baixa ligação.

Para triagem na biblioteca, use um manipulador de líquido acústico para dispensar 100 nanolitros de compostos em cada poço das colunas 3 a 22 para uma concentração final de 40 micromoles. Dispensar 100 nanolitros de DMSO em cada poço das colunas 1 e 23 como controlos negativos. Dispense 100 nanolitros de peptídeo HCN1 não marcado em cada poço das colunas 2 e 24 como controles positivos com uma concentração final de 10 micromoles.

Incube as placas em temperatura ambiente por duas horas. Usando um leitor de placas, meça a polarização de fluorescência. Alternativamente, as placas podem ser armazenadas por 16 horas a 4 graus Celsius antes da leitura.

Usando a equação a seguir, calcule a porcentagem de inibição, onde XN é a porcentagem normalizada de inibição correspondente ao sinal X.X positivo é o sinal médio dos poços de controle positivo e X negativo é o sinal médio dos poços de controle negativo. Para validar Hits com mais de 50% de inibição, prepare uma mistura mestre de 20 mililitros de 2 micromolares TRIP8b e 50 nanomolares HCN1 TAMRA em tampão FP. Dispense 25 microlitros da mistura principal em cada poço de uma placa preta de microtitulação de 384 poços.

Em seguida, adicione 100 nanolitros de compostos de uma placa contendo diluições seriais duplas de cada composto ativo nos respectivos poços. Para os poços de controle negativo, adicione 100 nanolitros de DMSO. Para um controle positivo, adicione 100 nanolitros de peptídeo HCN1 não marcado diluído em série com concentrações finais variando de 200 micromoles a 0,1 micromoles.

Incube a placa em temperatura ambiente por duas horas ou a 4 graus Celsius por 16 horas. Usando um leitor de placas, meça a polarização de fluorescência. Calcule os valores IC50 ajustando os dados FP dependentes da concentração de cada composto usando um modelo de regressão não linear de 4 parâmetros.

Descongele uma alíquota de cada proteína de fusão TRIP8b marcada com HIS e HCN1 marcada com GST e mantenha-as no gelo. Prepare 1 mililitro de 200 nanomolares HIS TRIP8b e 20 nanomoles de GST-HCN1C40 em tampão de ensaio para cada composto a ser testado. Use uma pipeta de 16 canais para adicionar 7 microlitros da mistura HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 a três poços por fileira de fileiras de A a N para testar cada composto em triplicata.

Centrifugue brevemente a placa para garantir que os líquidos estejam no fundo de cada poço e para remover quaisquer bolhas. Em seguida, dispense os compostos Hit a serem testados na placa para atingir uma concentração final de 200 micromoles na linha A e terminando com 0,1 micromoles na linha L.Adicione o mesmo volume de DMSO na linha M.Em seguida, dispense o peptídeo HCN1 não marcado até uma concentração final de 10 micromoles na linha N.Agite a placa por dois minutos e incube por 2,5 horas em temperatura ambiente. Usando tampão de ensaio, dilua as esferas aceitadoras Anti-GST de 1 a 50.

Com uma pipeta de 16 canais, adicione 3,5 microlitros de esferas aceitadoras diluídas a cada poço da placa e misture pipetando suavemente para evitar a criação de bolhas. Incube a placa no escuro em temperatura ambiente por uma hora. Dilua os grânulos doadores de níquel-quelato de 1 a 50 com tampão de ensaio, sem expor a mistura à luz.

Adicione 3,5 microlitros das esferas doadoras diluídas a cada poço da placa e misture suavemente, evitando bolhas de ar. Feche a placa e incube-a no escuro em temperatura ambiente por 1,5 horas. Em seguida, use um leitor de placas para ler a placa com os parâmetros de medição listados aqui.

Por fim, calcule os valores de IC50 ajustando os dados para cada composto usando um modelo de regressão não linear de 4 parâmetros. Para avaliar a interação com HCN1, TAMRA TRIP8b foi titulado em uma concentração fixa de HCN1 TAMRA. Este gráfico mostra que, à medida que a concentração de TRIP8b aumenta, mais moléculas de HCN1 TAMRA se ligam e a polarização aumenta.

Neste experimento, como HCN1 não marcado foi titulado em uma concentração fixa de TRIP8b e HCN1 TAMRA, o peptídeo marcado foi deslocado e o sinal diminuiu. Uma triagem de alto rendimento mostra a porcentagem de inibição de cada composto representada por pontos únicos no gráfico. Os resultados desta triagem são plotados com controles positivos e negativos, e cada um com a porcentagem média de inibição de cada composto em duas execuções do ensaio.

Compostos com mais de 50% de inibição foram então validados neste experimento. As coordenadas X e Y foram determinadas pela porcentagem de inibição em duas execuções do ensaio. Neste experimento, HCN1C40 contém uma tag GST de terminal final que liga contas aceitadoras.

A interação dos domínios TPR de TRIP8b e o tripeptídeo terminal C de HCN1 excitam o grânulo doador com luz de comprimento de onda de 680 nanômetros para produzir oxigênio Singlete. Finalmente, como mostrado neste gráfico, a titulação de concentrações crescentes do composto hit NUCC-5953 em uma concentração fixa de TRIP8b e HCN1C40 aumentou a inibição da interação TRIP8b HCN1. Antes de iniciar a triagem de alto rendimento, valide a preparação da proteína e a polarização de fluorescência em ensaios de proximidade baseados em esferas.

Certifique-se de que a proteína seja de alta pureza. Alíquota da proteína para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento. É importante usar reagentes de alta qualidade, incluindo DMSO e Triton frescos.

Não se esqueça de que trabalhar com o DMSO pode ser perigoso, e as precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento. Após este procedimento, outros métodos como eletrofisiologia e citometria de fluxo podem ser realizados para determinar se os compostos hit têm atividade nas células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma tela de alto rendimento com um ensaio baseado em polarização de fluorescência.