Name: Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a usar eletroforese bidimensional em gel de agarose semi-desnaturante para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras amiloides em células HT-29. Este método confiável ajuda a distinguir características nativas de artefatos experimentais.

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Este trabalho é apoiado por uma bolsa em S.H.-A. de NIH/NCATS (TL1TR001104), uma fundação de Welch conceder (I-1827), e uma concessão de R01 da NIGMS (RGM120502A) para Z.W. Z.W. é a Virginia Murchison Linthicum estudioso em pesquisas médicas e prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas estudioso (R1222).

1. preparar as amostras
<ol><li>Amiloide de cultura 2x106 produzindo células de câncer de cólon HT-29 em um prato de cultura de tecido de 10 cm em 10 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina. Células de cultura durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.<ol>
<li>Depois que as células crescem a confluência de 80%, lave as células com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 3 mL de solução de tripsina e incubar a 37 ° C por 3 min.</li>
		<li>Depois que as células são totalmente dissociadas do prato, adicionar 10 mL de meio de cultura e transferir as células com uma pipeta de 10 mL para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 1.000 x g, durante 3 min à temperatura ambiente. Aspire o meio, Ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura e contar as células usando um contador de célula. Placa de 2 x 106 células em cada um dos dois pratos de 10 cm.</li>
		<li>Permitir que as células de aderir e recuperar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2. Aplica o tratamento por um prato para induzir a formação de amiloides com fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), inibidor de 100 nM Smac-mimética e 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK11de 20 ng/mL. A combinação é abreviada como TZ. Trate o outro prato com veículo como um controle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o período adequado de tempo, geralmente de 6 h, colha o lisado celular.<ol>
<li>Raspe as células no prato com uma espátula de plástico e usar uma pipeta de 10 mL para transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 1.000 x g, durante 3 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar as células 2 vezes por resuspending em 10 mL de PBS frio gelo e centrifugação a 1.000 x g, durante 3 min a 4 ° C. Aspire a solução de PBS. Nota: O processo pode ser pausado aqui congelando o centrifugado em nitrogênio líquido e armazenando a ˗80 ° C por até 1 mês.</li>
		<li>Transfira o centrifugado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e incubar em 0,3 mL de tampão de Lise por 30 min no gelo. Centrifugar a 20.000 x g por 15 min a 4 ° C. O sobrenadante é o lisado celular. Nota: O processo pode ser pausado aqui armazenando a amostra a-20 º C por até diversos meses.</li>
		<li>Medir a concentração de proteína por um ensaio de Bradford, de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione 4 x amortecedor do carregamento do SDD-idade para preparar 20 µ l de 3 µ g / µ l de amostra e incubar a temperatura ambiente por 10 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparar e executar géis
<ol><li>Adicione 2 g de agarose para 200 mL de 1x Tris-Acetato tampão (TAE) num copo de vidro e calor no microondas para derreter o agarose. Adicione 1 mL de SDS 20% para uma concentração final de 0,1% SDS. Cuidadosamente agite para misturar. Tome cuidado para não gerar bolhas após a adição de SDS.</li>
	<li>Despeje a solução de agarose em uma laje de gel 15 cm x 14 cm. Utilize uma pipeta de 1 mL para eliminar quaisquer bolhas. Coloque um pente de 20-bem no topo.</li>
	<li>Primeira dimensão: pipeta 60 µ g de lisado na faixa da extrema-direita celular. Funcione o gel em 60 V para cerca de 4 h (até a frente do corante é cerca de ¾ através do gel) usando o TAE contendo SDS 0,1% como o buffer de execução.</li>
	<li>Segunda dimensão: Rode cuidadosamente o gel 90° no sentido horário(Figura 2). Funcione o gel em 60 V para cerca de 4 h. Nota: A condição de funcionamento geral é 4 V/cm de comprimento de gel. É importante que as condições de execução são exatamente o mesmo para as primeiras e segunda dimensões.</li>
</ol>3. transferência
<ol><li>Use o método capilar de transferência para transferir as proteínas para uma membrana de difluoreto (PVDF) do polyvinylidene (Figura 2B).<ol>
<li>Adicionar 500 mL de tampão de transferência para um contêiner de 20 x 20 cm aproximadamente. Fazer uma pilha alta de 5 cm de toalhas de papel ao lado do recipiente. A área de superfície da parte superior da pilha deve ser maior que as dimensões de gel.</li>
		<li>Mergulhe num filtro de papel 14 x 15 cm no buffer de transferência e coloque no topo da pilha de toalha de papel. Tome cuidado para colocar no papel sem rugas ou bolhas. Repita com outro pedaço de papel de filtro.</li>
		<li>Ativar uma membrana PVDF 14 x 15 cm em metanol por 30 s em seguida mergulhá-la sobre o papel de filtro, tendo o cuidado de usar um rolo para remover todas as bolhas. Enxaguar o gel com buffer de transferência e mergulhá-la em cima da membrana, lançando novamente quaisquer bolhas.</li>
		<li>Cobrir a borda as toalhas de papel mais próximas ao contêiner do buffer de transferência com o envoltório plástico. É importante que a ponte de papel construída na próxima etapa não entre em contato direto com a pilha de papel toalha.</li>
		<li>Mergulhe um pedaço de papel de filtro de 15 cm x 35 cm no buffer de transferência e colocá-lo para uma extremidade cobre a parte superior do gel e a outra extremidade é no recipiente do buffer de transferência. Repita com a outra ponte.</li>
		<li>Cubra o recipiente com filme plástico e deixe durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western mancha deteção
<ol><li>Lavar a membrana com 50 mL de PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBST) em um recipiente de 20 cm x 20 cm. Adicione 20 mL de leite de 5% em PBST. Rocha em temperatura ambiente por 30 min bloquear.</li>
	<li>Pipete 10 µ l de anticorpo anti-MLKL em 20 mL de leite de 5% em PBST e adicionar ao recipiente. Incubar em roqueiro durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave a membrana em 20 mL de PBST por 5 min. Repita 5 vezes.</li>
	<li>Pipete 4 µ l de anti-rabbit-HRP a 20 mL de leite de 5% em PBST e adicionar ao recipiente. Incube em balancim em temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Lave a membrana em 20 mL de PBST por 5 min. Repita 5 vezes.</li>
	<li>Adicione o substrato de quimioluminescência reforçada (ECL) e expor para películas de raio x, de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

O aspecto mais importante da 2D SDD-idade é que as condições de eletroforese são os mesmos para a primeira e segunda dimensão. A capacidade de detectar uma nítida linha diagonal a 45° (indicando que não há dissociação ou degradação ocorreu) depende das fibras migrando de forma idêntica durante os dois de electroforese. Usar diferentes condições, por exemplo, alterando a tensão ou o comprimento de tempo de execução, irá obscurecer estes resultados. Também, como é o caso de tradicional 1D SDD-idade, a amostra de ebulição d...

A formação de fibras amiloides devido ao enrolamento de proteínas tem sido conhecida para jogar um papel em condições patológicas como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e a doença de Huntington1. Mais recentemente, a formação de fibras amiloides ou amiloide-como foi mostrada para ser uma parte das vias de sinalização em humanos, incluindo durante anti-virais resposta imune inata2 e necroptosis3,4e em organismos inferiores como fermento5,6. Portanto, a capacidade de detectar essas fibras no laboratório é importante. Atualmente, existem três maneiras principais para detectar amiloide e fibras de amiloide, como: o uso de corantes e EM SDD-idade.
O uso de corantes, como o vermelho de Congo ou Thioflavin T, oferece a vantagem de ser rápida e facilmente detectável usando microscopia ou espectroscopia de7. No entanto, a detecção de pela microscopia, no caso de vermelho de Congo, não fornece nenhuma especificidade sobre quais proteínas compõem as fibras, ou o tamanho das fibras. Da mesma forma, o uso da espectroscopia para detectar a ligação vermelho Congo ou Thioflavin T de complexos de proteínas fornece somente um resultado positivo ou negativo.
EM fornece evidência conclusiva da presença de fibras e também informações quantitativas sobre a fibra comprimento e diâmetro8. No entanto, este método requer purificação muito rigorosa. Além disso, é uma técnica especializada que utiliza o equipamento caro.
SDD-idade tem sido usado para detectar SDS-resistente complexos de proteínas de Dalton mega incluindo amiloides ou amiloide-como fibras. Oferece muitas vantagens. Primeiro, ele não requer a purificação das fibras e é fácil de efetuar9. Em segundo lugar, fornece informações qualitativas sobre o tamanho das fibras, incluindo o tamanho relativo e a quantidade de heterogenicity de fibra. Por último, porque mancha ocidental pode ser realizada após eletroforese, é fácil detectar a presença de qualquer proteína para a qual existe um anticorpo, embora Note-se que porque SDD-idade é semi desnaturação, alguns resumos podem permanecer escondida que complica a deteção pelo anticorpo.
Recentemente, interação proteína quinase do receptor do 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) foram relatados à fibras de amiloides formulário para servir como plataformas de sinalização durante a necroptosis, uma forma programada de necrose3. Enquanto estudava estas fibras, nosso laboratório mostrou que outra proteína associada necroptosis, misturado a quinase de linhagem como domínio (MLKL), também formado de fibras de amiloide como4. No entanto, após um exame detalhado com SDD-idade, o tamanho das fibras MLKL apareceu distinto das fibras RIPK1 e RIPK3, que apareceu idênticas uns aos outros (Figura 1). Isso foi inesperado porque é sabido que MLKL vincula a RIPK1/RIPK3 para formar o necroptosis sinalização complexo chamado o necrosome10.
Existem pelo menos duas explicações. Primeiro, duas fibras de amiloide como totalmente distintas possam formar durante o necroptosis, um RIPK1 contendo/RIPK3 e o outro contendo MLKL. Em segundo lugar, apenas um tipo de amiloide-como fibras que contendo RIPK1/RIPK3/MLKL podem ser formado durante a necroptosis, mas a associação de MLKL com as outras proteínas é fraco suficiente que ele dissocia-se durante a idade do SDD.
Para resolver isso, propomos realizar uma bidimensional (2D) SDD-idade. SDD-idade-stable amiloide ou fibras de amiloide, como terá o mesmo padrão de migração durante a electroforese de primeira e segunda dimensão. Isto será detectável após a transferência das proteínas para uma membrana e realizar um Western blot. Fibras estáveis irão expor um padrão diagonal afiado. Qualquer desvio isto sugeriria que as fibras se submetem a mudanças devido a electroforese de SDS.

<table><tbody><tr><td>aparelho de eletroforese em gel</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus para corrida em gel.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Para gel de agarose.</td></tr><tr><td>torre de papel</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>para transferência de</td></tr><tr><td>papel de filtro</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>para transferência de</td></tr><tr><td>membrana PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>para transferência de</td></tr><tr><td>bloqueio de leite em pó</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>para bloqueio em Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo MLKL</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>anticorpo anti-MLKL de coelho</td></tr><tr><td>Anticorpo RIPK1</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>anticorpo anti-RIPK1 de camundongo</td></tr><tr><td>Presente de anticorpo RIPK3</td><td>do Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>coelho anti-RIPK3. Veja a referência 11.</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>anticorpo secundário</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td> Filme de raio-X <td>de substrato HRP quimioluminescente ocidental</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>para resultado de Western blot</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Solução de tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>PBS para cultura de tecidos</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>para TNF</td></tr><tr><td>recombinante</td> de cultura de células <td>feito em nosso laboratório</td><td></td><td>para induzir necroptose. Ver referência 11.</td></tr><tr><td>presente mimético smac</td><td>do Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>para induzir a necroptose. Ver referência 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>para induzir necroptose. Ver referência 11.</td></tr><tr><td>Contador</td><td>de Células Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Modelo TC20; para contagem de células</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Kit de Ensaio de Proteína BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>para medir a concentração de proteína em lisados celulares</td></tr><tr><td>Levantador de células</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>para remover células do prato</td></tr><tr><td>Tampão de lise (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL glicerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inibidores de protease e fosfatos conforme desejado)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48,4 g Tris base 11,42 mL ácido acético glacial 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE tampão de carga (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL glicerol 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% azul de bromofenol 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>Tampão de Transferência TBS (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem PBST (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot; 2H2O 24 g KH2PO4 adicionar ddH2O a 10 L</td></tr></tbody></table>

utilização de eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou amyloid-como

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Fibras de amiloides ou amiloide-como tem sido associadas com muitas doenças humanas e agora estão sendo descobertas importante para muitas vias de sinalização. A capacidade de detectar prontamente a formação destas fibras sob diferentes condições experimentais é essencial para a compreensão de sua função potencial. Muitos métodos têm sido utilizados para detectar as fibras, mas não sem alguns inconvenientes. Por exemplo, microscopia de elétron (EM), ou coloração com vermelho Congo ou Thioflavin T muitas vezes requer purificação das fibras. Por outro lado, eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação (SDD-idade) permite a detecção das fibras de amiloide como SDS-resistente em extratos de células sem purificação. Além disso, permite a comparação entre a diferença de tamanho das fibras. Mais importante, ele pode ser usado para identificar proteínas específicas dentro das fibras pela mancha ocidental. É menos demorado e mais facilmente acessível a um maior número de laboratórios. SDD-idade resultados muitas vezes mostram um grau variável de heterogeneidade. Levanta a questão se parte da heterogeneidade resulta da dissociação da proteína complexa durante a eletroforese na presença de SDS. Por esta razão, nós empregamos uma segunda dimensão de SDD-idade para determinar se a heterogeneidade de tamanho vista em SDD-idade verdadeiramente é um resultado de fibra heterogeneidade na vivo e não um resultado de degradação ou dissociação de algumas das proteínas durante eletroforese. Este método permite a confirmação rápida e qualitativa que as fibras de amiloide ou amiloide-como não são parcialmente dissociando durante o processo de SDD-idade.

Após a indução de necroptosis, RIPK1 e RIPK3 mostraram quase idênticos padrões como amiloide (faixas 2 e 4, Figura 1). No entanto, fibras MLKL foram mais heterogêneas e pareciam ser menor do que fibras RIPK1/RIPK3 (faixa 6, Figura 1). Que nos levou a desenvolver o método de SDD-idade 2D para abordar a possibilidade MLKL formam fibras de RIPK1/RIPK3-independente ou MLKL dissocia-se simplesmente partir de fibras de RIPK1/RIPK3/MLKL...

Aqui usamos a eletroforese em gel de agarose semi desnaturação bidimensional para confirmar a presença de amiloide-como fibras de tamanho heterogêneo e excluir a possibilidade de que a heterogeneidade de tamanho é devido à dissociação das fibras de amiloides durante o gel processo em execução.

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

O objetivo geral desta eletroforese em gel de agarose em detergente semidesnaturante bidimensional é confirmar a heterogeneidade de tamanho de fibras amilóides ou semelhantes a amilóides observadas durante o SDD-AGE tradicional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de agregação amilóide ou de proteínas, como se a heterogeneidade de tamanho observada durante o SDD-AGE tradicional é o estado nativo das fibras in vivo ou o resultado da degradação ou dissociação de proteínas durante a eletroforese em gel. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada facilmente em laboratório sem equipamentos especializados.Nenhum equipamento adicional é necessário além do que é usado no SDD-AGE tradicional. Primeiro, semeie as células de câncer de cólon HT-29 produtoras de amilóide em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros. Em seguida, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Quando as células atingirem 80% de confluência, use solução salina tamponada com fosfato para lavar as células. Em seguida, adicione três mililitros de tripsina às células e incube a 37 graus Celsius por três minutos. Depois que as células se desprenderem da placa de cultura, adicione 10 mililitros de meio de cultura à placa.Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão da célula a 1.000 vezes g durante três minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspirar o meio e ressuspender o sedimento celular em cinco mililitros de meio de cultura.Conte as células usando um contador de células. Em seguida, deixe duas placas de cultura a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, adicione reagentes TSZ a uma das placas de cultura como tratamento.Após cerca de seis horas, colha as células usando um raspador de plástico. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 1.000 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o pellet celular duas vezes com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado e repita o processo de centrifugação.Em seguida, aspire a solução de PBS e transfira o pellet celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 0,3 mililitros de tampão de lise ao pellet celular e incube no gelo por 30 minutos. Mais uma vez, centrifugue a 20.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.O sobrenadante obtido é o lisado de células inteiras. Ao sobrenadante, adicione 4X SDD-AGE tampão para preparar 20 microlitros de três microgramas por microlitro de amostra. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 10 minutos.Para preparar o gel, adicione dois gramas de pó de agarose a 200 mililitros de tampão TAE em um copo de vidro. Em seguida, aqueça o copo no micro-ondas para derreter a agarose. Em seguida, adicione um mililitro de 20% SDS a uma concentração final de 0,1% Gire suavemente o copo.Em seguida, despeje a agarose líquida em uma placa de gel de 15 por 14 centímetros. Para remover quaisquer bolhas de ar, use uma pipeta de um mililitro. Em seguida, coloque um pente de 20 poços em cima do gel.Em seguida, adicione aproximadamente 60 microgramas de lisado de células inteiras na faixa mais direita do gel. Execute o gel a 60 volts por cerca de quatro horas usando o tampão TAE contendo 0,1% SDS como tampão de funcionamento. Para executar o gel na segunda dimensão, gire cuidadosamente o gel em 90 graus no sentido anti-horário.Em seguida, execute o gel a 60 volts por cerca de quatro horas. Em um recipiente de 20 por 20 centímetros, adicione 500 mililitros de tampão de transferência. Imediatamente ao lado do recipiente, prepare uma pilha de toalhas de papel de cinco centímetros de altura.Em seguida, mergulhe dois papéis de filtro, cada um com dimensões de 14 por 15 centímetros, em tampão de transferência e coloque em cima da pilha de papel toalha. Ative uma membrana de PVDF de 14 por 15 centímetros em metanol por 30 segundos. Após a ativação, coloque a membrana em cima dos papéis de filtro e use um rolo para remover todas as bolhas.A parte mais importante da transferência é garantir que nenhuma bolha de ar seja formada entre o gel e a membrana. Enxágue o gel com tampão de transferência e coloque-o em cima da membrana. Estenda todas as bolhas formadas.Em seguida, use um filme plástico para cobrir a borda das toalhas de papel mais próximas do recipiente do tampão de transferência. Em seguida, mergulhe um pedaço de papel de filtro com dimensões de 15 por 35 centímetros no tampão de transferência. Coloque o papel de filtro de forma que uma extremidade cubra a parte superior do gel e a outra extremidade fique no recipiente do tampão de transferência.Cubra o recipiente com filme plástico e deixe durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, enxágue a membrana com 50 mililitros de PBST em um recipiente de 20 por 20 centímetros. Em seguida, adicione 20 mililitros de 5% de leite em PBST na membrana.Em seguida, deixe a membrana no balancim em temperatura ambiente por 30 minutos para bloquear. Pipete 10 microlitros de anticorpo anti-MLKL de coelho em 20 mililitros de leite a 5% em PBST. Em seguida, adicione a mistura de anticorpos na membrana.Incube a membrana em um balancim durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave a membrana com 20 mililitros de PBST por cinco minutos. Esta lavagem é repetida cinco vezes.Em seguida, pipete quatro microlitros de anticorpo anti-HRP de coelho para 20 mililitros de leite a 5% em PBST. Adicione o anticorpo na membrana. Deixe o recipiente com a membrana no balancim em temperatura ambiente por duas horas.Após duas horas, lave a membrana cinco vezes em 20 mililitros de PBST por cinco minutos cada. Finalmente, adicione substrato de quimioluminescência aprimorado na membrana. Em seguida, exponha a membrana ao filme de raios-X de acordo com as instruções do fabricante.Este estudo é feito para demonstrar a presença de fibras semelhantes a amilóides resistentes a SDS em lisados de células inteiras obtidos de células tratadas com fator de necrose tumoral alfa. Isso mostra aqui que RIPK1 e RIPK3 mostram padrões semelhantes semelhantes a amilóide idênticos. Curiosamente, as fibras MLKL parecem heterogêneas com um padrão de migração diferente das outras.Esta imagem mostra o possível padrão de migração de fibras amilóides ou semelhantes a amiloide. Na SDD-AGE de primeira dimensão, as fibras amilóides ou semelhantes a amilóides exibem um esfregaço característico. Nesta imagem, as fibras migram de forma idêntica na segunda corrida e exibem um padrão diagonal de migração na membrana a 45 graus.Isso mostra que as fibras não sofrem degradação ou dissociação durante o processo de execução do gel. Pelo contrário, se as fibras se dissociarem, há listras verticais abaixo da linha diagonal, indicando uma migração mais rápida das fibras menores durante a segunda eletroforese. Tanto o SDD-AGE de primeira quanto a segunda dimensão mostram que as fibras MLKL não se dissociam durante o processo SDD-AGE e são de fato distintas das fibras RIPK1 e RIPK3.Nesta imagem, as fibras MLKL mostram um esfregaço característico durante a primeira dimensão. No entanto, as mesmas fibras mostram uma linha diagonal nítida sem listras verticais na segunda dimensão SDD-AGE. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todas as condições, como tensão e duração da corrida, permanecem as mesmas entre a primeira e a segunda dimensões para garantir uma linha nítida em um ângulo de 45 graus.Após esse procedimento, outros métodos, como remoção da membrana e resondagem com outros anticorpos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a fibra contém outras proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como confirmar que nenhuma degradação ou dissociação de fibras amilóides ou semelhantes a amilóides está ocorrendo durante o SDD-AGE tradicional.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Este vídeo demonstra o procedimento de separação de sulfatos de heparano isolados de tecido pulmonar de camundongo usando eletroforese em gel de poliacrilamida.

Eletroforese em gel de poliacrilamida: uma técnica analítica para detectar sulfatos de heparano de diferentes comprimentos de cadeia isolados de tecido pulmonar de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica de separação desnaturante baseada em poliacrilamida para proteínas. Essa técnica auxilia na identificação preliminar de proteínas com base em seus pesos moleculares.

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Este vídeo demonstra a separação bidimensional semi-desnaturante de fibras amilóides em gel de agarose em gel de agarose. A técnica separa os agregados amilóides polimórficos com base em seu tamanho heterogêneo.

Eletroforese em gel de agarose semi-desnaturante bidimensional: uma técnica para separar fibras amilóides polimórficas com base na heterogeneidade de tamanho

Neste vídeo, demonstramos um método de eletroforese em gel bidimensional que separa proteínas individuais de uma mistura complexa de proteínas obtida de tecidos tumorais de adenoma hipofisário humano não funcional (NFPA). As proteínas são separadas com base em sua carga elétrica na primeira dimensão e posteriormente separadas com base em pesos moleculares na segunda dimensão.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.

Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

Este artigo descreve um protocolo simples e rápido para avaliar o estado oligomérico da proteína GTPase MxA semelhante à dinamina de lisados de células humanas usando uma combinação de PAGE não desnaturante com análise de western blot.

Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

Um protocolo é apresentado para a produção de tRNA (UUU) e a análise de tRNA (UUU) em complexo com a enzima TcdA por ensaios de retardamento de gel de agarose.

Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

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Aprenda a usar eletroforese bidimensional em gel de agarose semi-desnaturante para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras amiloides em células HT-29. Este método confiável ajuda a distinguir características nativas de artefatos experimentais.

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como (Vídeo) | JoVE Journal

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

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