Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

O objetivo geral desta eletroforese em gel de agarose em detergente semidesnaturante bidimensional é confirmar a heterogeneidade de tamanho de fibras amilóides ou semelhantes a amilóides observadas durante o SDD-AGE tradicional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de agregação amilóide ou de proteínas, como se a heterogeneidade de tamanho observada durante o SDD-AGE tradicional é o estado nativo das fibras in vivo ou o resultado da degradação ou dissociação de proteínas durante a eletroforese em gel. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada facilmente em laboratório sem equipamentos especializados.

Nenhum equipamento adicional é necessário além do que é usado no SDD-AGE tradicional. Primeiro, semeie as células de câncer de cólon HT-29 produtoras de amilóide em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros. Em seguida, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Quando as células atingirem 80% de confluência, use solução salina tamponada com fosfato para lavar as células. Em seguida, adicione três mililitros de tripsina às células e incube a 37 graus Celsius por três minutos. Depois que as células se desprenderem da placa de cultura, adicione 10 mililitros de meio de cultura à placa.

Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão da célula a 1.000 vezes g durante três minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspirar o meio e ressuspender o sedimento celular em cinco mililitros de meio de cultura.

Conte as células usando um contador de células. Em seguida, deixe duas placas de cultura a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, adicione reagentes TSZ a uma das placas de cultura como tratamento.

Após cerca de seis horas, colha as células usando um raspador de plástico. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 1.000 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o pellet celular duas vezes com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado e repita o processo de centrifugação.

Em seguida, aspire a solução de PBS e transfira o pellet celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 0,3 mililitros de tampão de lise ao pellet celular e incube no gelo por 30 minutos. Mais uma vez, centrifugue a 20.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.

O sobrenadante obtido é o lisado de células inteiras. Ao sobrenadante, adicione 4X SDD-AGE tampão para preparar 20 microlitros de três microgramas por microlitro de amostra. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 10 minutos.

Para preparar o gel, adicione dois gramas de pó de agarose a 200 mililitros de tampão TAE em um copo de vidro. Em seguida, aqueça o copo no micro-ondas para derreter a agarose. Em seguida, adicione um mililitro de 20% SDS a uma concentração final de 0,1% Gire suavemente o copo.

Em seguida, despeje a agarose líquida em uma placa de gel de 15 por 14 centímetros. Para remover quaisquer bolhas de ar, use uma pipeta de um mililitro. Em seguida, coloque um pente de 20 poços em cima do gel.

Em seguida, adicione aproximadamente 60 microgramas de lisado de células inteiras na faixa mais direita do gel. Execute o gel a 60 volts por cerca de quatro horas usando o tampão TAE contendo 0,1% SDS como tampão de funcionamento. Para executar o gel na segunda dimensão, gire cuidadosamente o gel em 90 graus no sentido anti-horário.

Em seguida, execute o gel a 60 volts por cerca de quatro horas. Em um recipiente de 20 por 20 centímetros, adicione 500 mililitros de tampão de transferência. Imediatamente ao lado do recipiente, prepare uma pilha de toalhas de papel de cinco centímetros de altura.

Em seguida, mergulhe dois papéis de filtro, cada um com dimensões de 14 por 15 centímetros, em tampão de transferência e coloque em cima da pilha de papel toalha. Ative uma membrana de PVDF de 14 por 15 centímetros em metanol por 30 segundos. Após a ativação, coloque a membrana em cima dos papéis de filtro e use um rolo para remover todas as bolhas.

A parte mais importante da transferência é garantir que nenhuma bolha de ar seja formada entre o gel e a membrana. Enxágue o gel com tampão de transferência e coloque-o em cima da membrana. Estenda todas as bolhas formadas.

Em seguida, use um filme plástico para cobrir a borda das toalhas de papel mais próximas do recipiente do tampão de transferência. Em seguida, mergulhe um pedaço de papel de filtro com dimensões de 15 por 35 centímetros no tampão de transferência. Coloque o papel de filtro de forma que uma extremidade cubra a parte superior do gel e a outra extremidade fique no recipiente do tampão de transferência.

Cubra o recipiente com filme plástico e deixe durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, enxágue a membrana com 50 mililitros de PBST em um recipiente de 20 por 20 centímetros. Em seguida, adicione 20 mililitros de 5% de leite em PBST na membrana.

Em seguida, deixe a membrana no balancim em temperatura ambiente por 30 minutos para bloquear. Pipete 10 microlitros de anticorpo anti-MLKL de coelho em 20 mililitros de leite a 5% em PBST. Em seguida, adicione a mistura de anticorpos na membrana.

Incube a membrana em um balancim durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave a membrana com 20 mililitros de PBST por cinco minutos. Esta lavagem é repetida cinco vezes.

Em seguida, pipete quatro microlitros de anticorpo anti-HRP de coelho para 20 mililitros de leite a 5% em PBST. Adicione o anticorpo na membrana. Deixe o recipiente com a membrana no balancim em temperatura ambiente por duas horas.

Após duas horas, lave a membrana cinco vezes em 20 mililitros de PBST por cinco minutos cada. Finalmente, adicione substrato de quimioluminescência aprimorado na membrana. Em seguida, exponha a membrana ao filme de raios-X de acordo com as instruções do fabricante.

Este estudo é feito para demonstrar a presença de fibras semelhantes a amilóides resistentes a SDS em lisados de células inteiras obtidos de células tratadas com fator de necrose tumoral alfa. Isso mostra aqui que RIPK1 e RIPK3 mostram padrões semelhantes semelhantes a amilóide idênticos. Curiosamente, as fibras MLKL parecem heterogêneas com um padrão de migração diferente das outras.

Esta imagem mostra o possível padrão de migração de fibras amilóides ou semelhantes a amiloide. Na SDD-AGE de primeira dimensão, as fibras amilóides ou semelhantes a amilóides exibem um esfregaço característico. Nesta imagem, as fibras migram de forma idêntica na segunda corrida e exibem um padrão diagonal de migração na membrana a 45 graus.

Isso mostra que as fibras não sofrem degradação ou dissociação durante o processo de execução do gel. Pelo contrário, se as fibras se dissociarem, há listras verticais abaixo da linha diagonal, indicando uma migração mais rápida das fibras menores durante a segunda eletroforese. Tanto o SDD-AGE de primeira quanto a segunda dimensão mostram que as fibras MLKL não se dissociam durante o processo SDD-AGE e são de fato distintas das fibras RIPK1 e RIPK3.

Nesta imagem, as fibras MLKL mostram um esfregaço característico durante a primeira dimensão. No entanto, as mesmas fibras mostram uma linha diagonal nítida sem listras verticais na segunda dimensão SDD-AGE. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todas as condições, como tensão e duração da corrida, permanecem as mesmas entre a primeira e a segunda dimensões para garantir uma linha nítida em um ângulo de 45 graus.

Após esse procedimento, outros métodos, como remoção da membrana e resondagem com outros anticorpos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a fibra contém outras proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como confirmar que nenhuma degradação ou dissociação de fibras amilóides ou semelhantes a amilóides está ocorrendo durante o SDD-AGE tradicional.