Name: Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a imobilização covalente de proteínas em superfícies de óxido de silício usando agentes de acoplamento silano para espectroscopia de força de molécula única por microscopia de força atômica.

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TB e HG reconhecem apoio financeiro através do Conselho Europeu de investigação "Cellufuel, avançado Grant n. º 294438". HCS reconhece o apoio financeiro do Ministério Federal de educação e investigação através da proteína de Technofunktionale de Innovationsallianz (TeFuProt), SS reconhece financeira apoio do Ministério do estado da Baviera para a ciência e a educação através do foco de investigação "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Agradecemos a Conny Hasselberg-Christoph e Martina Hörig para suporte técnico

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Os autores não têm nada para divulgar.

Desde a introdução do AFM baseado SMFS, evoluiu para uma técnica amplamente utilizada para sondar diretamente intra e intermoleculares forças de individuais de proteínas, ácidos nucleicos e outras biomoléculas3,4,5. Para experiências bem sucedidas de SMFS, uma superfície adequada estratégia de acoplamento é um pré-requisito. Para sondar as forças intramoleculares em polímeros naturais e sintéticos, os polímeros podem ser acoplados diretamente à superfície do substrato e AFM dica36,38,39,40,41. Para a investigação de interações inter moleculares, tais como ligações moleculares, no entanto, é aconselhável a utilização de moléculas de vinculador flexível como hetero-bifuncional PEG linkers, ou as correntes do polypeptide, anexar os parceiros de interação para a ponta AFM e o superfície do substrato, para permitir a orientação correta dos parceiros vinculação, para superar as forças de superfície de curto alcance e evitar a desnaturação e desdobramento de proteínas21,22,23, 24,25,26,,27,42. Portanto, descrevemos um protocolo simples e direta para a imobilização covalente de proteínas através de suas aminas primárias acessíveis usando espaçadores de PEG hétero-bifuncional.
Temos demonstrado sua aplicabilidade com a investigação da interação forças entre adesina RrgA de S. pneumoniae e a proteína da matriz extracelular Fn, como recentemente descrito em detalhe em outro lugar13.
A química de superfície é bem estabelecida e abordagens analisadas e similares têm sido utilizadas com sucesso em vários SMFS experimentos19,42,,43,44,45. O silylether utilizado para acoplamento do polímero de silano na superfície, está sujeita a hidrólise. O grau de hidrólise depende da quantidade de títulos de siloxano formado, o que pode ser controlado durante o processo de silanização. Se forças de interação alta (≥ 1000 pN) são esperadas durante as medições de SMFS, a silanização deve ser realizada através do vapor-fase deposição30 que resulta na formação de uma camada contínua de siloxanos. Quanto a muitas experiências (por exemplo, muitas proteínas – interações da proteína), as forças de interação estão na faixa de uns cem pN e o procedimento descrito, na qual siloxano formação é realizada pela deposição de uma fase aquosa e desassociada organo-silanos são cuidadosamente lavado com etanol (etapa 1.1.7), seguido de fotopolimerização com calor (etapa 1.1.8), é suficientes.
Outro passo crítico é para lavar o restante EDC e moléculas de NHS fora da superfície (etapa 1.2.3), como as sobras conduzirá à ativação de grupos carboxila sobre as proteínas. Isto pode de qualquer resultado na reticulação de proteínas na mesma superfície, que pode alterar a sua funcionalidade ou covalentemente casal ativado proteínas a outras proteínas na superfície oposta. Isso pode levar à fixação das proteínas entre a superfície e a ponta AFM, que resulta em ruptura alta forças eventualmente acompanhadas de desdobramento do domínio (ver Figura 3b, rastreamento de 1, 4 e 5, desdobramento de domínios Fn)46. O mesmo problema pode ocorrer, se os ésteres de NHS ativos do espaçador de PEG são deixados insaturados. Portanto, a incubação com soro fisiológico Tris em buffer é recomendável (etapa 1.2.6), como a amina primária de Tris sacia os grupos restantes de aminoácidos reativos.
Seguindo o protocolo gradual leva a uma distribuição homogénea das Fn no vidro silanizadas de superfície (ver Figura 2), deixando uma forma dimérica da proteína. Isto assemelha-se a estrutura de Fn´s em solução e é consistente com os dados anteriores AFM em outras superfícies de amostra37. Além disso, uma concentração adequada de RrgA na ponta AFM é obtida, o que gera um valor-alvo de ~ 20% dos eventos de interação bem definidas durante as medições de SMFS (Figura 3 e Figura 4). Outra maneira elegante para controlar a quantidade de moléculas acoplado à ponta de substrato e cantilever com amostra além variando os tempos de concentração e/ou incubação de proteína, é a combinação de silano-agentes com diferentes grupos de funcionais secundários. Alterando a proporção dos grupos reativo proteína, estendendo-se desde o PEG-polímero, o número de proteínas imobilizadas pode ser controlada15,16,17,18.
O protocolo descrito aqui também pode ser usado para imobilizar outras moléculas contendo de2 -NH ou ser ajustados às proteínas par a outra superfície de óxido de silício, além de nitreto de vidro e silicone. Dependendo do design de proteína, o grupo carboxila reativas amina pode ser alterado para um grupo sulfidrila reativos (por exemplo, maleimide ou orto-pyridyl dissulfeto) para acoplar a proteína através de seu livre – grupos SH. Para Fn, isso resulta em uma orientação predefinida13,17,20.
Em resumo, este protocolo pode ser ajustado para atender diferentes necessidades e é adequado para outras aplicações biofísicas além de experimentos de espectroscopia de força única molécula.

Ao lado da pinça óptica e magnética, a força atômica (AFM) de microscópio1,2 surgiu como uma ferramenta útil para analisar e manipular moléculas e suas propriedades e funções, incluindo a sua resposta à força externa3 da sonda ,4. Em contraste aos métodos como o ensaio de imunoabsorção ligado de enzima (ELISA), surface ressonância plasmon (SPR) ou configurações de cristal de quartzo micro-balança (QCM), AFM permite medir interações sobre a única molécula (SMFS)5 e o nível de célula única (SCFS)6 . Estas tecnologias renderam insights valiosos sobre mecanismos de ligação como os laços de capturas para a interação de Escherichia coli pilus proteína que fimh com manose7, ou o conjunto β-zíper repete formada por proteínas obrigatórias do Fn de S. aureus sobre vinculação a Fn8. Fomos recentemente capazes de mostrar que a adesina pilus-1 RrgA9,10 de bactéria Gram-positiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 é capaz de ligar a fibronectina12 com seus dois domínios terminais. Isto revelou um novo mecanismo de ligação de dois domínios que difere o β-zíper em tandem e pode permitir que piliated pneumococos formar e manter um transiente anfitrião contato para fibronectina contendo superfícies13.
O sucesso das experiências SMFS depende criticamente a imobilização funcional e nativa das biomoléculas sobre superfícies sólidas e AFM dicas. Como forças elevadas podem ocorrer durante as medições de SMFS, as proteínas de preferência devem ser covalentemente acopladas à superfície. Há um grande número de métodos diferentes de acoplamento para a imobilização de proteínas e outras biomoléculas, bem como células toda sobre superfícies sólidas (inorgânicas), nano-partículas e outros dispositivos descritos na literatura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Estes protocolos, muitas vezes fazem uso de substâncias perigosas, são difíceis de realizar e/ou exigir equipamento especial (por exemplo, plasma líquido de limpeza). Uma maneira simples de moléculas de casal para vidro é anexar uma espessa camada de polímero de heterobifunctional crosslinkers com um silano-reativo de um lado e um grupo amina-reativa seu outro lado. Dependendo da aplicação, os agentes de acoplamento podem incluir flexíveis cadeias de hidrocarbonetos de comprimento variável, por exemplo., polyethylenglycol (PEG). Eles suprimem interacções não-específicas das superfícies modificadas (por exemplo, hidrofóbicas, eletrostáticas e as interações de van-der-Waals) e podem fornecer a liberdade rotacional da molécula acoplado.
Aqui, descrevemos um protocolo geral para o acoplamento covalente de proteínas contendo um ou mais grupos aminoácidos livres (-NH2) de vidro, superfícies e nitreto de silício AFM dicas através de um heterobifunctional etoxi silano-PEG-carboxila (-COOH). Este protocolo pode ser usado em experimentos SMFS, que é exemplificado com base na interação de RrgA e proteínas da matriz extracelular Fn (ver Figura 1 para obter uma visão geral).
O primeiro passo é a silanização da superfície28,29,30,31. Envolve a hidrólise dos grupos etoxi do agente de acoplamento para formar grupos de SiOH altamente reativos. Estas podem reagir com grupos de SiOH no substrato. Em uma condensação primária passo, estas ligações de hidrogênio de forma silanols e espalhe sobre o substrato. Em uma reação de condensação secundária (que geralmente requer calor ou vácuo para remover a água), siloxano ligações são formadas. Isso resulta em uma camada de organo-silano covalentemente ligados.
O segundo passo é o acoplamento das proteínas para o funcional (-COOH) grupos que se estendem da polímero32. Primeiro, o ácido é convertido em um éster de N-hydroxysuccinimid (NHS) reativo intermediário, que é adquirido através do NHS/EDC bem estabelecida (1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimid química33 e sofre substituição nucleofílica Finalmente formar um vínculo de Amida com aminas primárias sobre as proteínas.
Desta forma, RrgA foi acoplado ao dicas AFM de nitreto de silício e Fn humana para substratos de vidro em uma orientação aleatória e suas forças de interação foram analisadas ao nível da molécula. Nossos resultados mostram que a química de superfície descrita conduz a uma distribuição homogénea de Fn na superfície de vidro e a uma concentração adequada de RrgA na ponta, aparente pelo valor alvo de até 20% dos eventos de interação durante as medições de SMFS. Esta química reduz as interações de fundo específico, está sujeita a alteração pouco durante a aquisição de dados e, portanto, é excelentemente adequada para experimentos SMFS precisos.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; pureza analítica</td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td>bidestilada</tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&ge; 99,8%; pureza analítica</td></tr><tr><td>Ácido de polietilenoglicol etoxi silano</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32</td></tr>% <tr><td>N-Hidroxisuccinimida</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; para síntese</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>Molécula de</td></tr><tr><td>sonda PBS e.g. Fibronectina, plasma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Molécula de sonda e.g. RrgA</td><td></td><td></td><td>Produzido em laboratório</td></tr><tr><td>Clorido de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %; TRIS; Grau de buffer</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr>Copos <tr><td>Cortador</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr> <tr><td>Corrediças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de vidro</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador de gás inerte</td><td>Microscópio</td> invertido Sicco <td></td><td></td></tr><tr><td>- Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard Software SPM e DP</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno de laboratório</td><td>Aglutinante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro espátula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrífuga</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Marca</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>placas</td><td></td><td></td><td></td>de Petri</tr> medidor <tr><td>de pH</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 &micro; l, 50-200 e micro; l, 100-1000&nbsp; &micro; l</td></tr><tr><td>Balança de precisão</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantilever de nitreto de silício - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>Constante de mola &le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Banho de sonicação</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td><td></td>de coloração</tr><tr><td>Microscópio estéreo - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td><td></td> de agitação</tr><tr><td>Kimtech science limpa com precisão</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Espectro de mercúrio com a energia primária em 254&nbsp; Nm</td></tr><tr><td>Dessecador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a vácuo Bomba</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>vácuo Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de pesagem</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Nos últimos anos, microscopia de força atômica (AFM) com base em espectroscopia de força única molécula (SMFS) estendida a nossa compreensão das funções e propriedades moleculares. Deu-na oportunidade de explorar uma multiplicidade de mecanismos biofísicos, por exemplo, como bacteriana adesinas se ligam a receptores de superfície de acolhimento mais detalhadamente. Entre outros fatores, o sucesso das experiências SMFS depende a imobilização funcional e nativa das biomoléculas de interesse sobre superfícies sólidas e AFM dicas. Aqui, descrevemos um protocolo simples para o acoplamento covalente de proteínas a superfícies de silício usando silano-PEG-carboxyls e a química N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (CED/NHS) bem estabelecida na ordem para explorar a interação de adesina pilus-1 RrgA de bactéria Gram-positiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), com a matriz extracelular da proteína fibronectina (Fn). Nossos resultados mostram que a superfície functionalization conduz a uma distribuição homogénea de Fn na superfície de vidro e a uma concentração adequada de RrgA na ponta do modilhão AFM, aparente pelo valor alvo de até 20% dos eventos de interação durante SMFS medições e revelou que RrgA vincula a Fn com uma força média de 52 pN. O protocolo pode ser ajustado para o casal através de site específico livre grupos tiol. Isso resulta em uma orientação predefinida de proteína ou molécula e é adequado para outras aplicações biofísicas além as SMFS.

O protocolo descrito aqui resulta em uma imobilização covalente de proteínas através de suas aminas primárias acessíveis com orientação aleatória (Figura 1). A Figura 2 mostra uma imagem AFM de uma superfície de vidro silanizadas com (esquerda) e sem (à direita) Fn imobilizada, gravado após a desidratação das amostras sob uma ligeira corrente de nitrogênio. A camada de polímero de silano mostra apenas corrugações superfície pequenas com uma altura de aproximadamente 2-5 nm (Figura 2, direita), enquanto na superfície acrescida com Fn, aproximadamente 10 nm alta Fn moléculas são aparente (Figura 2, à esquerda). Em close-ups, a estrutura dimérica do Fn pode ser reconhecida. As moléculas de Fn parecem ser compacto, com uma altura de 4-5 nm acima o revestimento de superfície de PEG e um comprimento de ~ 120 nm (ver inserções).
Para investigar as forças de interação de RrgA com Fn, que recentemente foi descrito detalhadamente por nosso grupo13, RrgA foi acoplado a uma ponta AFM de nitreto de silício e Fn humana ao substrato de vidro (Figura 3a). A Figura 3 mostra representativa ponta curvas de separação de amostra da interação do RrgA com Fn gravado a uma velocidade puxa de 1 µm s-1. A química de superfície utilizada levada a uma interação de baixo fundo e eventos de interação individual (ou duplo) bem formados (Figura 3a), que foram instalados usando um verme extensível como modelo de cadeia (eWLC) (curvas de vermelhos). Plotar os resultados do ajuste (força de ruptura e - comprimento, ver Figura 4) mostra que, após superar a superfície inespecificas entre ponta AFM e substrato e os linkers PEG (&gt; 70 nm), estendendo-se até ~ 19% das curvas força mostrou ruptura eventos com uma ruptura significa forçar para o RrgA - interação de Fn de ~ 52 pN em uma distâncias de ponta-amostra de cerca de 100 nm. Em contraste, uma química de superfície inaplicável (aqui, extinguendo omitido com Tris tamponada salina Figura 3b) apresentará uma avaliação clara dos eventos de interação única devido às interações inespecíficas, múltiplos proteína de ligação (traço 2 e 3) e/ou acoplamento covalente de proteínas entre a superfície da amostra e a ponta do modilhão AFM. Este leva a ruptura alta forças (traço 1) eventualmente acompanhadas de desdobramento dos domínios da proteína (Fn) (traço 4 e 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figura 1: visão geral sobre a química de superfície. A hidrólise de etoxi silano-PEG-carboxila é seguida pela sua condensação na superfície de vidro hidratado e a formação de ligações cruzadas de siloxano. A reação de EDC com os grupos carboxila resulta em um reativo o- acylisourea, um intermediário reativo-amina com uma meia-vida extremamente curta em solução aquosa (hidrólise). O intermediário é estabilizado pela formação de um éster de NHS que sofre substituição nucleofílica para finalmente formar uma ligação Amida com aminas primárias sobre as proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figura 2: Imobilização de fibronectina em um vidro substrato através de heterobifunctional etoxi silano PEG agente de acoplamento de carboxila. Imagens AFM de vidro funcionalizado superfícies com (esquerda) e sem (direita), nota de rodapé números indicam moléculas individuais de Fn, que são distribuídas homogeneamente na superfície do substrato (inserções). As moléculas adotam uma estrutura dimérica e compacta, com uma altura de 4-5 nm acima o PEG revestimento e um comprimento de &gt; 100 nm. Isto assemelha-se a estrutura da Fn em solução e é consistente com os dados anteriores AFM em outras superfícies, por exemplo, mica (barra de escala de embutimentos = 500 nm)37. Abaixo o AFM imagens são perfis de altura ao longo das linhas indicadas nas imagens de AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figura 3: ilustração de um experimento SMFS e representante forçar curvas de distância da RrgA - interação de Fn. (a) RrgA e Fn foram ligados covalentemente através de silano etoxi heterobifunctional PEG agente de acoplamento carboxila de um AFM de nitreto de silício do modilhão dica e uma superfície de vidro, respectivamente. Representante SMFS forçar distância curvas obtidas para RrgA - interação de Fn a uma velocidade de retração de 1 µm s-1 com a imobilização descrita de RrgA e Fn são mostradas. As curvas vermelhas representam o fits extensível tipo worm cadeia aplicado para obter forças de ruptura e comprimentos. A figura foi modificada de Becke, et al, 2018 ACSnano13. (b) representante SMFS forçar curvas distância obtidas para o RrgA - interação de Fn sem têmpera com Tris-buffered salina. Neste caso, a amina primária de Tris estava ausente para que o restante ativo ésteres NHS foram deixados insaturados durante o experimento. Isto levou à proteína multi ligação (traço 2 e 3) e a fixação de proteínas entre a superfície e a ponta AFM que resultou na ruptura alta força domínio acompanhados (Fn-) desdobramento (rastreamento 1, 4 e 5; Observe as diferentes escalas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figura 4: distribuição de força e comprimento de RrgA único - interações Fn. Ruptura força e correspondente histogramas de comprimento de ruptura obtidas de RrgA - medições de interação Fn SMFS (n = 1400) a uma velocidade de retração de 1 µm s-1. Os histogramas revelam um mais provável ruptura força fMP de 51.6 pN (Gauss caber, linha preta) e um acúmulo de comprimentos de ruptura em torno de 100 nm. A figura foi modificada de Becke, et al, ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biofísico, como a força de uma única proteína nas interações proteicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para imobilizar uma ampla gama de biomoléculas diferentes. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque o manuseio da sonda cantilever do microscópio de força atômica e a operação do próprio microscópio de força atômica podem ser desafiadores.Para começar, coloque luvas resistentes a ácidos, óculos de segurança e um jaleco de laboratório. Sob uma coifa, use isopropanol em lenços de precisão sem fiapos. Remova qualquer poeira grossa e contaminação de várias lâminas de vidro.Transfira as lâminas limpas para um frasco cheio de ácido clorídrico diluído em água bidestilada Feche o frasco com uma tampa apropriada e coloque-o em um banho ultrassônico por 90 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira as sondas cantilever AFM de nitreto de silício para uma corrediça de vidro limpa com a ponta voltada para cima.Transfira a lâmina para uma câmara impermeável à luz UV e irradie a lâmina com luz ultravioleta de cima por pelo menos 90 minutos. Depois disso, substitua o ácido clorídrico no frasco de coloração por água duplamente destilada, tomando cuidado para não deixar a superfície do vidro secar. Feche o frasco com a tampa e coloque-o de volta no banho ultrassônico por mais 10 minutos.Enquanto isso, dissolva o ácido etoxi silano polietilenoglicol em uma mistura de etanol e água duplamente destilada até uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro. Selar hermeticamente esta solução para evitar a evaporação do etanol. Quando estiver pronto, despeje a solução de silano em duas placas de Petri separadas.Coloque as lâminas de vidro limpas em uma placa de Petri e o cantilever na outra. Usando parafilme, sele hermeticamente ambas as placas para evitar que o etanol evapore. Incube as placas estacionárias por 90 minutos em temperatura ambiente.Depois disso, use três copos consecutivos contendo etanol puro para lavar o cantilever e as lâminas de vidro. Coloque o cantilever lavado em uma lâmina de vidro limpa. Transfira as lâminas de vidro funcionalizadas para o frasco de coloração.Catalise ambos em forno a 110 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, armazene as amostras de vidro silanizado e o cantilever em um dessecador a vácuo por até uma semana. Quando estiver pronto para iniciar a imobilização aleatória de proteínas, prepare uma solução contendo EDC e NHS em solução salina tamponada com fosfato padrão, conforme descrito no protocolo de texto.Cubra as lâminas de vidro revestidas de silano com esta solução. Coloque as sondas cantilever silanizadas em uma gota da solução ECD/NHS. Incube ambos por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, enxágue o cantilever e as lâminas em três copos consecutivos para lavar completamente qualquer excesso de EDC / NHS. Transfira as lâminas de vidro ativado para uma placa de Petri equipada com um lenço de papel úmido. Adicione uma gota da solução proteica desejada à área ativada por EDC/NHS das lâminas de vidro e sele a placa de Petri usando parafilme e incube as sondas à temperatura ambiente.Adicione uma gota da solução proteica desejada à caixa cantilever equipada com um lenço de papel úmido. Em seguida, lave bem as sondas cantilever com PBS. Coloque as sondas na gota na caixa e feche a caixa.Incube as sondas à temperatura ambiente. Depois disso, marque a área da gota de proteína na parte de trás das lâminas de vidro. Lave bem as lâminas de vidro e as sondas cantilever usando três copos consecutivos cheios de PBS.Coloque as sondas lavadas em um recipiente contendo solução salina tamponada com Tris por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave bem as lâminas de vidro e as sondas cantilever com PBS. Armazene-os em placas de Petri separadas cobertas com PBS até a hora de usar.Fixe uma lâmina de vidro recém-limpa no suporte de amostra AFM e cubra-o com tampão PBS. Em seguida, fixe a sonda cantilever preparada no suporte cantilever e coloque-a na cabeça do AFM. Molhe cuidadosamente o cantilever com uma gota de tampão PBS.Mova lentamente o cantilever em direção à superfície de calibração até que o cantilever esteja completamente imerso no tampão PBS, mas ainda longe da superfície de calibração. Use o microscópio ótico da vista superior ou o microscópio invertido do AFM para posicionar o laser na parte traseira do cantilever. Coloque o ponto do laser perto da extremidade do modilhão perto de onde a ponta está localizada e ajuste a posição no fotodiodo detector de quatro quadrantes do AFM de modo que o feixe de laser refletido seja posicionado no centro do fotodiodo.Em seguida, abra o gerenciador de calibração no software AFM. Para começar a calibrar a sensibilidade do cantilever e a constante da mola, aproxime-se cuidadosamente da superfície do substrato e registre uma curva de distância de força. Encaixe uma linha reta na parte mais íngreme da curva de força de retração, onde a ponta está em contato com a superfície do substrato, para determinar a sensibilidade da alavanca óptica.Retraia o cantilever da superfície da amostra e registre vários espectros de ruído térmico com o cantilever a pelo menos 100 mícrons da superfície e encaixe um oscilador harmônico, fornecido pelo software AFM, aos espectros de ruído térmico para determinar a constante de mola do cantilever. Depois disso, retraia lentamente o cantilever e retire-o da solução. Remova a superfície de vidro usada para a calibração do cantilever e substitua-a pela superfície da amostra contendo as proteínas imobilizadas.Mova lentamente o cantilever úmido em direção à superfície da amostra até que o cantilever esteja completamente coberto pelo tampão PBS, mas ainda longe da superfície do substrato. Aproxime-se da superfície e registre várias curvas de distância de força em diferentes locais na superfície da amostra com uma força de contato de 250 piconewtons, um tempo de contato de um segundo, um comprimento de retração de dois micrômetros e uma velocidade de retração de um micrômetro por segundo. No software de processamento de dados, selecione o ícone Abrir lote de Force Scan para abrir os arquivos da curva de força medida.Selecione o ícone Recalibrar a deflexão V ajustando a sensibilidade na constante de mola para converter a deflexão do cantilever para a força diretamente proporcional. Em seguida, selecione o ícone Subtração da linha de base para subtrair a linha de base do canal de retração em uma região da curva de força distante da superfície, que também define o nível de força zero. Selecione o ícone Determinação do ponto de contato para definir o ponto onde a ponta faz contato com a amostra.Selecione o ícone Separação de amostra de ponta para converter o sinal de altura em separação de amostra de ponta. Além de subtrair a posição do ponto de contato, isso subtrai a flexão do cantilever para calcular a distância entre a superfície do substrato e a ponta do AFM. Selecione o ícone Ajustar um modelo de cadeia de polímero e escolha o modelo de cadeia extensível semelhante a um sem-fim para rastrear os traços de distância de força para picos de força que ocorrem em comprimentos de ruptura acima de 70 nanômetros.Classifique as interações não específicas e aplique o modelo de cadeia extensível semelhante a um worm aos picos selecionados. Neste estudo, as proteínas são imobilizadas covalentemente com orientação aleatória por meio de suas aminas primárias acessíveis. Uma imagem do AFM da camada silanizada do polímero mostra somente ondulações de superfície pequenas com as alturas que variam entre aproximadamente dois e cinco nanômetros.No entanto, a superfície funcionalizada com fibronectina possui moléculas de fibronectina com cerca de 10 nanômetros de altura. Uma inspeção mais detalhada revela que a estrutura dimérica das moléculas pode ser reconhecida. Essas moléculas parecem ser compactas, com uma altura de quatro a cinco nanômetros acima do revestimento da superfície do PEG e um comprimento de cerca de 120 nanômetros.As forças de interação da RRGA com a fibronectina são então investigadas. As curvas representativas de separação da amostra de ponta registradas a uma velocidade polarizada de um mícron por segundo mostraram baixa interação de fundo e eventos de interação bem formados, que são então ajustados, usando um modelo extensível de cadeia semelhante a um verme. A plotagem dos resultados desse ajuste mostra que, após a superação de interações superficiais não específicas no alongamento dos ligantes PEG, até 19% das curvas de força têm eventos de ruptura com uma força de ruptura média de 52 piconewtons para a interação da fibronectina RRGA e a uma distância de amostra de ponta de cerca de 100 nanômetros.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, dependendo de configurações como o tempo de contato ou a velocidade de retração, os dados da espectroscopia de força de molécula única contêm várias informações e que este protocolo só pode ser um primeiro passo para a análise completa dos dados. Embora esse método possa fornecer informações sobre interações de molécula única, ele também pode ser usado para estudar interações no nível de célula única. Após este procedimento, outros métodos, como espectroscopia de força de célula única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como células inteiras interagem com superfícies revestidas de proteínas.Não se esqueça de que trabalhar com ácidos e luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso e que precauções como luvas resistentes a ácidos e uma câmara impermeável à luz ultravioleta devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Aprenda a imobilização covalente de proteínas em superfícies de óxido de silício usando agentes de acoplamento silano para espectroscopia de força de molécula única por microscopia de força atômica.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

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