Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biofísico, como a força de uma única proteína nas interações proteicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para imobilizar uma ampla gama de biomoléculas diferentes. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque o manuseio da sonda cantilever do microscópio de força atômica e a operação do próprio microscópio de força atômica podem ser desafiadores.

Para começar, coloque luvas resistentes a ácidos, óculos de segurança e um jaleco de laboratório. Sob uma coifa, use isopropanol em lenços de precisão sem fiapos. Remova qualquer poeira grossa e contaminação de várias lâminas de vidro.

Transfira as lâminas limpas para um frasco cheio de ácido clorídrico diluído em água bidestilada Feche o frasco com uma tampa apropriada e coloque-o em um banho ultrassônico por 90 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira as sondas cantilever AFM de nitreto de silício para uma corrediça de vidro limpa com a ponta voltada para cima.

Transfira a lâmina para uma câmara impermeável à luz UV e irradie a lâmina com luz ultravioleta de cima por pelo menos 90 minutos. Depois disso, substitua o ácido clorídrico no frasco de coloração por água duplamente destilada, tomando cuidado para não deixar a superfície do vidro secar. Feche o frasco com a tampa e coloque-o de volta no banho ultrassônico por mais 10 minutos.

Enquanto isso, dissolva o ácido etoxi silano polietilenoglicol em uma mistura de etanol e água duplamente destilada até uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro. Selar hermeticamente esta solução para evitar a evaporação do etanol. Quando estiver pronto, despeje a solução de silano em duas placas de Petri separadas.

Coloque as lâminas de vidro limpas em uma placa de Petri e o cantilever na outra. Usando parafilme, sele hermeticamente ambas as placas para evitar que o etanol evapore. Incube as placas estacionárias por 90 minutos em temperatura ambiente.

Depois disso, use três copos consecutivos contendo etanol puro para lavar o cantilever e as lâminas de vidro. Coloque o cantilever lavado em uma lâmina de vidro limpa. Transfira as lâminas de vidro funcionalizadas para o frasco de coloração.

Catalise ambos em forno a 110 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, armazene as amostras de vidro silanizado e o cantilever em um dessecador a vácuo por até uma semana. Quando estiver pronto para iniciar a imobilização aleatória de proteínas, prepare uma solução contendo EDC e NHS em solução salina tamponada com fosfato padrão, conforme descrito no protocolo de texto.

Cubra as lâminas de vidro revestidas de silano com esta solução. Coloque as sondas cantilever silanizadas em uma gota da solução ECD/NHS. Incube ambos por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, enxágue o cantilever e as lâminas em três copos consecutivos para lavar completamente qualquer excesso de EDC / NHS. Transfira as lâminas de vidro ativado para uma placa de Petri equipada com um lenço de papel úmido. Adicione uma gota da solução proteica desejada à área ativada por EDC/NHS das lâminas de vidro e sele a placa de Petri usando parafilme e incube as sondas à temperatura ambiente.

Adicione uma gota da solução proteica desejada à caixa cantilever equipada com um lenço de papel úmido. Em seguida, lave bem as sondas cantilever com PBS. Coloque as sondas na gota na caixa e feche a caixa.

Incube as sondas à temperatura ambiente. Depois disso, marque a área da gota de proteína na parte de trás das lâminas de vidro. Lave bem as lâminas de vidro e as sondas cantilever usando três copos consecutivos cheios de PBS.

Coloque as sondas lavadas em um recipiente contendo solução salina tamponada com Tris por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave bem as lâminas de vidro e as sondas cantilever com PBS. Armazene-os em placas de Petri separadas cobertas com PBS até a hora de usar.

Fixe uma lâmina de vidro recém-limpa no suporte de amostra AFM e cubra-o com tampão PBS. Em seguida, fixe a sonda cantilever preparada no suporte cantilever e coloque-a na cabeça do AFM. Molhe cuidadosamente o cantilever com uma gota de tampão PBS.

Mova lentamente o cantilever em direção à superfície de calibração até que o cantilever esteja completamente imerso no tampão PBS, mas ainda longe da superfície de calibração. Use o microscópio ótico da vista superior ou o microscópio invertido do AFM para posicionar o laser na parte traseira do cantilever. Coloque o ponto do laser perto da extremidade do modilhão perto de onde a ponta está localizada e ajuste a posição no fotodiodo detector de quatro quadrantes do AFM de modo que o feixe de laser refletido seja posicionado no centro do fotodiodo.

Em seguida, abra o gerenciador de calibração no software AFM. Para começar a calibrar a sensibilidade do cantilever e a constante da mola, aproxime-se cuidadosamente da superfície do substrato e registre uma curva de distância de força. Encaixe uma linha reta na parte mais íngreme da curva de força de retração, onde a ponta está em contato com a superfície do substrato, para determinar a sensibilidade da alavanca óptica.

Retraia o cantilever da superfície da amostra e registre vários espectros de ruído térmico com o cantilever a pelo menos 100 mícrons da superfície e encaixe um oscilador harmônico, fornecido pelo software AFM, aos espectros de ruído térmico para determinar a constante de mola do cantilever. Depois disso, retraia lentamente o cantilever e retire-o da solução. Remova a superfície de vidro usada para a calibração do cantilever e substitua-a pela superfície da amostra contendo as proteínas imobilizadas.

Mova lentamente o cantilever úmido em direção à superfície da amostra até que o cantilever esteja completamente coberto pelo tampão PBS, mas ainda longe da superfície do substrato. Aproxime-se da superfície e registre várias curvas de distância de força em diferentes locais na superfície da amostra com uma força de contato de 250 piconewtons, um tempo de contato de um segundo, um comprimento de retração de dois micrômetros e uma velocidade de retração de um micrômetro por segundo. No software de processamento de dados, selecione o ícone Abrir lote de Force Scan para abrir os arquivos da curva de força medida.

Selecione o ícone Recalibrar a deflexão V ajustando a sensibilidade na constante de mola para converter a deflexão do cantilever para a força diretamente proporcional. Em seguida, selecione o ícone Subtração da linha de base para subtrair a linha de base do canal de retração em uma região da curva de força distante da superfície, que também define o nível de força zero. Selecione o ícone Determinação do ponto de contato para definir o ponto onde a ponta faz contato com a amostra.

Selecione o ícone Separação de amostra de ponta para converter o sinal de altura em separação de amostra de ponta. Além de subtrair a posição do ponto de contato, isso subtrai a flexão do cantilever para calcular a distância entre a superfície do substrato e a ponta do AFM. Selecione o ícone Ajustar um modelo de cadeia de polímero e escolha o modelo de cadeia extensível semelhante a um sem-fim para rastrear os traços de distância de força para picos de força que ocorrem em comprimentos de ruptura acima de 70 nanômetros.

Classifique as interações não específicas e aplique o modelo de cadeia extensível semelhante a um worm aos picos selecionados. Neste estudo, as proteínas são imobilizadas covalentemente com orientação aleatória por meio de suas aminas primárias acessíveis. Uma imagem do AFM da camada silanizada do polímero mostra somente ondulações de superfície pequenas com as alturas que variam entre aproximadamente dois e cinco nanômetros.

No entanto, a superfície funcionalizada com fibronectina possui moléculas de fibronectina com cerca de 10 nanômetros de altura. Uma inspeção mais detalhada revela que a estrutura dimérica das moléculas pode ser reconhecida. Essas moléculas parecem ser compactas, com uma altura de quatro a cinco nanômetros acima do revestimento da superfície do PEG e um comprimento de cerca de 120 nanômetros.

As forças de interação da RRGA com a fibronectina são então investigadas. As curvas representativas de separação da amostra de ponta registradas a uma velocidade polarizada de um mícron por segundo mostraram baixa interação de fundo e eventos de interação bem formados, que são então ajustados, usando um modelo extensível de cadeia semelhante a um verme. A plotagem dos resultados desse ajuste mostra que, após a superação de interações superficiais não específicas no alongamento dos ligantes PEG, até 19% das curvas de força têm eventos de ruptura com uma força de ruptura média de 52 piconewtons para a interação da fibronectina RRGA e a uma distância de amostra de ponta de cerca de 100 nanômetros.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, dependendo de configurações como o tempo de contato ou a velocidade de retração, os dados da espectroscopia de força de molécula única contêm várias informações e que este protocolo só pode ser um primeiro passo para a análise completa dos dados. Embora esse método possa fornecer informações sobre interações de molécula única, ele também pode ser usado para estudar interações no nível de célula única. Após este procedimento, outros métodos, como espectroscopia de força de célula única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como células inteiras interagem com superfícies revestidas de proteínas.

Não se esqueça de que trabalhar com ácidos e luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso e que precauções como luvas resistentes a ácidos e uma câmara impermeável à luz ultravioleta devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.