Rheometrie força-braçadeira para caracterizar hidrogel à base de proteínas

As principais vantagens dessa técnica são que ela utiliza um PID, que é um sistema derivado integral proporcional para aplicar protocolos de força controlada a amostras de hidrogel proteico, e utiliza um pequeno volume de amostra. Os protocolos para o grampo de forças permitem uma interpretação direta dos dados, enquanto baixos volumes são críticos ao trabalhar com proteínas de produção difícil que estão disponíveis apenas em pequenas quantidades. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento e caracterização de novos materiais biométricos com elasticidade durável, usando características de transição de dobramento para baixo e redobramento para proteínas.

Este método pode responder a perguntas em mecânica de tecidos e biomateriais, permitindo as medições de bilhões de moléculas de proteína em uma única puxada e simulando ambientes lotados específicos para tecidos biológicos. Comece este procedimento com a preparação de soluções reagentes, conforme descrito no protocolo de texto. Para sintetizar o hidrogel à base de proteína, primeiro fixe uma agulha de calibre 23 em uma seringa de um mililitro com um êmbolo pressionado.

Em seguida, corte um tubo de politetrafluoretileno de 10 centímetros, ou PTFE, usando uma lâmina de barbear. Encaixe a agulha e a seringa em uma extremidade do tubo de PTFE. Insira a segunda extremidade do tubo em uma solução de silano e encha o tubo retraindo o êmbolo da seringa.

Deixe o tubo por aproximadamente 30 minutos. Em seguida, remova a solução de silano e seque o tubo com ar comprimido. Agora, misture a solução de proteína com APS e cloreto de tris (bipiridina) rutênio (II) em um tubo de 1,5 mililitro usando uma proporção de volume constante.

Vortex a solução fotoativa até que esteja completamente misturada. Em seguida, centrifugue a mistura na velocidade máxima para remover quaisquer bolhas da solução. Bolhas podem se formar durante o carregamento da mistura fotoativa de hidrogel no tubo de Teflon, levando a danos à amostra.

Para evitar a formação de bolhas, mantenha a extremidade do tubo de Teflon na mistura de solução durante o processo de carregamento e retraia o êmbolo da seringa lentamente. Insira a extremidade aberta do tubo de PTFE tratado na mistura fotoativa e puxe a solução para dentro do tubo retraindo o êmbolo da seringa. Agora, coloque o tubo carregado a aproximadamente 10 centímetros de distância de uma lâmpada de mercúrio de 100 watts para evitar aquecê-la e mantenha-a lá por até 30 minutos em temperatura ambiente.

Remova o tubo da agulha e corte as bordas do tubo perto das extremidades do hidrogel com uma lâmina de barbear. Em seguida, use uma agulha embotada de calibre 24 para extrudar o hidrogel na solução Tris. Inspecione visualmente os géis quanto a defeitos que possam se formar durante a extrusão ou devido a bolhas e descarte quaisquer géis defeituosos.

Inicie o programa de controle do instrumento e ligue o motor da bobina de voz. Em seguida, defina a posição da bobina para um valor próximo ao final do intervalo. Desloque os ganchos na direção Z e alinhe-os na curva na direção X.

Em seguida, registre os valores dos parafusos do micrômetro para a direção X. Agora, dê um nó duplo solto no final do fio de sutura, de modo que o diâmetro do laço seja de cerca de quatro milímetros. Em seguida, corte o laço do fio.

Repita para formar um segundo loop. Em seguida, coloque os dois laços no gancho conectado ao sensor de força. Encha a câmara experimental com tampão Tris e transfira a amostra de hidrogel para a câmara cheia usando uma pinça médica.

Coloque a bobina de voz e os ganchos do sensor de força próximos à superfície da solução e alinhe os ganchos em todas as direções com os manipuladores de posicionamento XYZ. Usando uma pinça médica, pendure os dois lados da amostra de hidrogel de proteína nos ganchos conectados à bobina de voz e ao sensor de força. Um erro típico é um aperto excessivo das alças de sutura ao redor das amostras de hidrogel durante o processo de fixação.

Isso pode levar à formação de entalhes e corte da amostra de hidrogel. Aperte cuidadosamente um laço de sutura ao redor da amostra de hidrogel no gancho da bobina de voz, segurando ambas as extremidades do laço de sutura com uma pinça médica e puxando-as simultaneamente. Repita esta etapa para o loop conectado ao sensor de força.

Aperte as alças de sutura nas curvas de cada gancho para evitar qualquer deslizamento. Use essas dobras como pontos de referência para encontrar a separação zero entre os ganchos. Corte o excesso de comprimento das suturas usando uma tesoura médica.

Mova o hidrogel anexado usando manipuladores Z ao longo do eixo Z em direção à câmara experimental para imergir o hidrogel na solução experimental. Alinhe a amostra de hidrogel em YZ usando os manipuladores de forma que o gel não fique sob estresse. Zere o sensor de força e separe os dois ganchos usando os estágios do micrômetro X até que o gel comece a sentir força.

Quando isso acontecer, gire levemente o parafuso do micrômetro para trás na direção X. Registre a posição de ambos os manipuladores para o motor da bobina de voz e o sensor. Em seguida, use a diferença entre esses valores e os medidos anteriormente para calcular a separação exata entre os ganchos de amarração no início do experimento.

Para realizar um ciclo de rampa de força aumentando a força na taxa de carga desejada, insira os valores de força inicial e final, bem como a duração do protocolo, que aparece como um V invertido, seguido por uma força baixa constante por cerca de 200 segundos para permitir que os domínios da proteína se dobrem novamente antes do próximo ciclo. Execute um protocolo de força constante aplicando uma força baixa por 30 segundos. Em seguida, aumente a força para uma força constante por um período de tempo definido, seguido de extinguir a força de volta ao mesmo valor baixo por mais de 300 segundos para permitir que os domínios da proteína se redabobrem e a elasticidade do gel se recupere.

Por fim, execute a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto. Cada medição começa com uma curva de folga. Ao encaixar duas linhas, a força zero no sensor e o comprimento real do gel são determinados.

O comprimento real do gel é calculado a partir da interseção dos ajustes e da posição dos parafusos do micrômetro. O sistema de reometria de grampo de força pode aplicar dois tipos diferentes de protocolos. No modo de rampa de força, a amostra de hidrogel experimenta um protocolo de mudança de força com o tempo que se assemelha a um modo de força invertida V.In constante, a tensão aplicada muda em um padrão semelhante a uma etapa.

Durante as medições, o sistema PID ajusta a extensão do hidrogel alterando a posição da bobina para seguir o ponto de ajuste predefinido do protocolo de força. A deformação é então calculada dividindo a extensão medida pelo comprimento real do gel. A tensão é determinada dividindo a força aplicada à área da seção transversal da amostra de hidrogel.

Os traços da Rampa de Força são melhor representados como tensão versus deformação. O módulo de Young pode ser calculado a partir da medida de inclinação durante a fase de carregamento. A histerese dá a dissipação de energia proveniente do desdobramento e redobramento da proteína.

Os traços de força constante são melhor representados em função do tempo. A mudança na deformação pode ser usada para medir as taxas de desdobramento e redobramento ajustando um exponencial duplo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de secar qualquer silano do tubo antes de adicionar a proteína, centrifugar a mistura de proteínas para remover bolhas, verificar as bolhas após injetar a mistura de proteínas dentro do tubo e descartar quaisquer hidrogéis danificados mecanicamente após a extrusão do tubo.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade no início em prender os géis aos ganchos usando as suturas cirúrgicas sem causar danos à amostra de hidrogel. A extrusão do gel do tubo também pode danificar o hidrogel. Este método permite a aplicação de protocolos de força constante em amostras de hidrogel de baixo volume.

Esses experimentos permitem o desacoplamento dos comportamentos elástico e viscoelástico e o estudo da mecânica de desdobramento e dobramento de proteínas em uma abordagem em massa. Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisadores no campo das ciências dos materiais explorem novos biomateriais macios, como hidrogéis à base de poliproteínas projetadas que têm um excelente potencial para servir como andaimes de engenharia de tecidos, sistemas de entrega de medicamentos e tinta biológica para impressão 3D. Esse método não apenas fornece informações sobre a mecânica dos hidrogéis à base de proteínas, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como medir a resposta isométrica das fibras musculares ou a elasticidade dos tecidos, como a pele.