Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

O objetivo geral deste procedimento é criar matrizes compatíveis para modular e quantificar a contração celular. Isso é realizado primeiramente ativando uma lamínula para permitir a ancoragem da matriz. O segundo passo do procedimento consiste em polimerizar um gel de poliacrilamida à lamínula ativada.

O terceiro passo do procedimento é semear as células sobre o gel e permitir que elas adiram. O passo final do procedimento é obter imagens do gel para gerar dados a serem analisados por protocolos de microscopia de força de tração. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as células aplicando forças de tração sobre sua matriz por meio da microscopia de força de tração.

Olá, sou Yvonne Eons do laboratório de Margaret ELL do Departamento de Física e do Instituto de Dinâmica Biofísica da Universidade de Chicago. Sou Steven Winter, também do laboratório Guard. Hoje gostaríamos de mostrar a você um procedimento para fabricar matrizes flexíveis para medir a contração celular.

Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar redes contráteis de actina e miosina. Então, vamos começar. Antes da ativação do lamínula, coloque várias lamínulas nº 1,5 de 22 por 40 milímetros previamente.

Lave com etanol 70% em uma grade de aço inoxidável, de modo que as lamínulas fiquem espaçadas e sem se tocarem. Trabalhando em uma capela de exaustão química, prepare uma solução de três ou perfil trimetano a 2% em isopropanol dentro de um recipiente de vidro quadrado. Use uma pipeta de vidro tipo espaguete para adicionar o três ou perfil menor.

Trimeth oxy devido à reatividade com plástico, mergulhe completamente as lamínulas nesta solução e incube por 10 minutos sob agitação em um agitador magnético na capela. Após a imersão, lave as lamínulas mergulhando-as em água destilada duplamente. Troque a água quatro vezes, após a troca final.

Deixe agir por 10 minutos com agitação. Em seguida, seque as lamínulas em uma incubadora a aproximadamente 37 graus Celsius por 10 minutos. Após secas, deixe esfriar até a temperatura ambiente.

Mergulhe as lamínulas em solução de glutaraldeído 1% em água bidestilada. Em um recipiente de vidro quadrado sobre uma placa de agitação durante 30 minutos. Certifique-se de usar um recipiente limpo.

Caso contrário, a solução pode ficar turva posteriormente. Lave as lamínulas com três trocas de água duplamente destilada, durante 10 minutos por troca, sob agitação. Em seguida, cubra as lamínulas com papel alumínio para evitar poeira e seque-as à temperatura ambiente.

Uma vez secos, armazene os lamínulas em local seco e protegido da poeira por até dois meses. Para preparar o gel de poliacrilamida ou PAA, prepare primeiro soluções estoque de Acrylamide bis. Acrylamide Mix a partir de acrilamida 40% e bis-acrilamida 2%, conforme descrito no protocolo RI.

Deixe a solução de acrilamida em uma câmara de vácuo por 20 minutos. Isso reduz o oxigênio dentro do gel, o que impede a polimerização. Enquanto isso, prepare uma solução de persulfato de amônio a 10% ou uma solução de PS.

Em seguida, limpe lâminas de vidro para microscópio de uma por três polegadas com lenços Rain X para tornar a superfície da lâmina hidrofóbica. Remova qualquer poeira com um lenço Kim para garantir uma superfície de gel lisa. Cubra a lâmina com folha de alumínio e reserve.

Em seguida, remova a solução de acrilamida da câmara de vácuo e adicione microesferas fluorescentes. Para iniciar a polimerização do gel, adicione 0,75 microlitros de TM E e 2,5 microlitros de PS a 10%. Misture brevemente a solução pipetando para cima e para baixo. A seguir, aplique de 10 a 12 microlitros da solução de acrilamida na lâmina de microscópio hidrofóbica previamente preparada.

Coloque um lamínula ativado de 22 por 40 milímetros sobre a gota. A solução de gel deve revestir completamente o lamínula. Remova qualquer bolha que possa aparecer na solução.

Deixe a solução do gel polimerizar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Após a polimerização, o gel se afastará da borda da lamínula. Usando a ponta fina de uma pinça, remova cuidadosamente a lamínula da superfície da lâmina de microscópio com o gel aderido.

Imersa o gel em uma placa de Petri contendo água destilada e redestilada para manter uma superfície hidratada do gel para a ligação cruzada da matriz extracelular ou proteína da ECM ao gel. Primeiro, prepare alíquotas de trabalho de 40 microlitros de sulfur san par dissolvendo o pó de SULF san par em óxido de dimetila anidro ou DMSO. Em seguida, remova a água destilada e redestilada da superfície do gel usando brevemente o spinner de lamínula.

Tendo o cuidado de não secar o gel imediatamente antes do uso. Dilua as alíquotas de enxofre sampa em DMSO em água bidestilada e recubra o centro da superfície do gel com cerca de 200 microlitros. Em seguida, exponha a superfície do gel à luz UV em um forno de reticulação UV.

Após a exposição à UV, mergulhe as lamínulas em um béquer com água destilada duplamente fresca. Remova qualquer solução da superfície do gel utilizando um centrífugo para lamínulas. Em seguida, coloque o param em uma placa de Petri e adicione 50 microlitros de fibronectina fria sobre o param.

Inverta a lamínula e coloque o lado do gel sobre a fibronectina. Deixe as lamínulas reagirem à temperatura ambiente por uma a duas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação em capela estéril de cultura de tecidos ventilada.

Coloque as lamínulas em placas de cultura de tecidos de seis centímetros contendo PBS para revestir as lamínulas. Lave extensivamente as lamínulas com várias trocas de PBS em condições estéreis após a lavagem. Esterilize as lamínulas por tratamento com UV durante 30 minutos.

Em seguida, incubar as lamínulas em meio celular por 30 a 45 minutos antes de semear as células. Em seguida, colocar uma lamínula de 22 por 30 milímetros no suporte superior da lamínula de uma câmara de imagem confocal da Warner Instruments, utilizando graxa de vácuo para manter a lamínula no lugar. Colocar uma junta de borracha formadora de câmara sobre a lamínula, permitindo acesso aos tubos de polietileno da entrada e da saída.

Isso permitirá um espaçamento de 150 a 1000 mícrons entre a lamínula superior e a lamínula de 22 por 40 milímetros revestida com gel, dependendo do tamanho da junta utilizada. Em seguida, carregue as seringas contendo meio celular aquecido nos tubos de entrada por meio do kit de conectores e verifique se o meio flui através dos tubos e até a lamínula superior. Aplique graxa de vácuo na base da câmara e posicione uma lamínula de 22 por 40 milímetros revestida com gel com o lado celular voltado para cima.

Adicione o meio aquecido às células. Coloque o suporte superior da lamínula sobre a base da câmara, com as juntas da câmara separando-o da lamínula revestida com gel. Certifique-se de que os pinos de posicionamento dentro da base da câmara estejam inseridos nos orifícios de posicionamento do suporte superior da lamínula.

Aplicar a placa de pressão à base da câmara e usar a chave da placa de pressão para parafusar e fixar a placa de pressão. Verificar o fluxo do meio através da tubulação e da câmara para monitorar possíveis vazamentos dentro da câmara. E eliminar quaisquer zonas livres de meio na superfície celular.

Aplicar a câmara de imagem confocal ao adaptador de platina situado dentro de um suporte de microscópio para obter imagens, em um microscópio confocal fluorescente, de proteínas marcadas com fluorescência e microesferas fluorescentes embutidas no substrato gelatinoso, a fim de visualizar a posição das microesferas não deformadas dentro do gel perfundido. Realizar repetições para destacar as adesões celulares do gel e capturar uma imagem das microesferas fluorescentes no mesmo campo de imagem onde as células estão localizadas. Quando o protocolo é seguido corretamente, a superfície do gel será relativamente plana e lisa, com microesferas fluorescentes distribuídas uniformemente por todo o material.

A MEC também pode ser visualizada por imunofluorescência de fibronectina. Se for medir a contração do gel na localização das adesões focais, a obtenção de imagens do gel e das células deve ser realizada no plano óptico confocal das adesões focais. Aqui, as adesões focais são visualizadas no experimento de força de atração em uma célula de osteossarcoma humano ou célula U2 OS marcada com GFP pxi.

A contração de um gel pode ser visualizada pelo deslocamento de microesferas fluorescentes embutidas nas adesões focais subjacentes. A comparação das microesferas sob tensão em verde com as posições das microesferas sem tensão em vermelho permite a quantificação do deslocamento do substrato gelificado sob contração. Este é um resultado representativo de uma célula espalhada que se desprende da superfície do gel por ação da tripsina. Abaixo, há um resultado representativo da comparação entre as posições das microesferas sob tensão e sem tensão.

O uso de algoritmos computacionais sofisticados pode gerar tensões de tração associadas ao deslocamento de microesferas e ao módulo de elasticidade dos géis. Essas tensões são visualizadas aqui por meio de um mapa de cores térmicas e com vetores, em que as cores mais quentes no mapa térmico e as setas maiores indicam forças mais intensas. Acabamos de mostrar como preparar matrizes flexíveis para medir a contração celular ao realizar este procedimento.

É importante planejar com antecedência para que os passos sensíveis ao tempo possam ser realizados rapidamente. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.