Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

O objetivo geral deste procedimento é criar matrizes compatíveis para modular e quantificar a contração celular. Isso é feito primeiro ativando uma lamínula para permitir a ancoragem da matriz. A segunda etapa do procedimento é polimerizar um gel de poliacrilamida na lamínula ativada.

A terceira etapa do procedimento é colocar as células no gel e permitir que elas adiram. A etapa final do procedimento é a geração de imagens do gel para gerar dados a serem analisados por protocolos de microscopia de força de tração. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram células aplicando forças de tração à sua matriz por meio de microscopia de força de tração.

Olá, sou Yvonne Eons do laboratório de Margaret ELL no Departamento de Física e no Instituto de Dinâmica Biofísica da Universidade de Chicago. Eu sou Steven Winter, também do laboratório da Guarda. Hoje gostaríamos de mostrar a você um procedimento para fazer matrizes compatíveis para medir a contração celular.

Usamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar redes contráteis de actina micina. Então vamos começar. Antes da ativação da lamínula, coloquei várias lamínulas de 22 por 40 milímetros número 1,5 anteriormente.

Enxágue com etanol a 70% em uma grade de aço inoxidável, de modo que as lamínulas fiquem espaçadas e não se toquem. Trabalhando em uma capela de exaustão química, prepare 2% de três ou menor solução de trimeth de perfil em isopropanol dentro de um prato de vidro quadrado. Use uma pipeta de macarrão de vidro para adicionar o perfil de três ou menor.

Trimeth oxy devido à reatividade com plástico, mergulhe completamente as lamínulas de cobertura nesta solução e incube por 10 minutos, mexendo em uma placa de agitação na hotte. Depois de molhar as lamínulas, lave-as mergulhando-as em água bidestilada Troque a água quatro vezes após a troca final.

Deixe 10 minutos de imersão com agitação. Em seguida, seque as lamínulas em uma incubadora a aproximadamente 37 graus Celsius por 10 minutos. Depois de secos, deixe-os esfriar até a temperatura ambiente.

Mergulhe as lamínulas em solução de glutaraldeído a 1% em água bidestilada Em um prato quadrado de vidro em um prato de agitação por 30 minutos. Certifique-se de usar um prato limpo.

Caso contrário, a solução pode parecer turva depois. Lavar as lamínulas com três voltas de água bidestilada durante 10 minutos por troca com agitação. Em seguida, cubra as lamínulas com papel alumínio para evitar poeira e seque-as em temperatura ambiente.

Depois de seco, guarde a capa em local seco, longe da poeira, por até dois meses. Para preparar a poliacrilamida ou gel PAA, primeiro faça soluções de estoque de acrilamida bis. Mistura de acrilamida de 40% de acrilamida e 2% de acrilamida bis, conforme descrito no protocolo RI.

DGAs a solução de acrilamida em uma câmara de vácuo por 20 minutos. Isso reduz o oxigênio dentro do gel, o que evita a polimerização. Enquanto isso, prepare uma solução de 10% de amônio por sulfato ou PS.

Em seguida, limpe as lâminas de vidro do microscópio de uma por três polegadas com lenços de chuva X para tornar a superfície da lâmina de vidro hidrofóbica. Remova qualquer poeira com um lenço Kim para garantir uma superfície de gel lisa. Cubra a lâmina com papel alumínio e reserve.

Em seguida, remova a solução de acrilamida da câmara de vácuo e adicione esferas fluorescentes. Para iniciar a polimerização em gel, adicione 0,75 microlitros de TM E e 2,5 microlitros de 10% a PS. Misture brevemente a solução pipetando para cima e para baixo. Em seguida, aplique 10 a 12 microlitros da solução de acrilamida na lâmina de microscópio hidrofóbica previamente preparada.

Coloque uma lamínula ativada de 22 por 40 milímetros no topo da gota. A solução de gel deve cobrir toda a lamínula. Alise quaisquer bolhas que possam aparecer dentro da solução.

Deixe a solução de gel polimerizar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Uma vez polimerizado, o gel se afastará da borda da lamínula. Usando a ponta fina de uma pinça, remova cuidadosamente a lamínula da superfície da lâmina do microscópio com o gel conectado.

Mergulhe o gel em uma placa de Petri contendo água bidestilada Para manter uma superfície de gel hidratada para reticular a matriz extracelular ou proteína ECM ao gel. Primeiro, prepare alíquotas de trabalho de 40 microlitros de enxofre san par dissolvendo o pó de SULF san par em óxido de dimetilsulf anidro ou DMSO. Em seguida, remova a água bidestilada da superfície do gel usando brevemente nosso girador de lamínula.

Tomando cuidado para não secar o gel imediatamente antes de usar. Diluir as alíquotas de enxofre sampa DMSO em água bidestilada e cobrir o centro da superfície do gel com cerca de 200 microlitros. Em seguida, exponha a superfície do gel à luz UV em um forno de reticulação UV.

Após a exposição aos raios UV, mergulhe as lamínulas num copo com água fresca bidestilada Remova qualquer solução da superfície do gel usando um centrifugador de lamínula. Em seguida, coloque o parâmetro em um recipiente de placa de Petri por um animal de estimação 50 microlitros de fibronectina fria no parâmetro.

Inverta a lamínula e coloque o lado do gel em cima da fibronectina. Deixe as lamínulas reagirem à temperatura ambiente por uma a duas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação em uma coifa ventilada para cultura de tecidos estéril.

Coloque as lamínulas em placas de cultura de tecidos de seis centímetros contendo PBS para revestir as lamínulas. Lave extensivamente as lamínulas com várias trocas de PBS em condições estéreis após a lavagem. Esterilize as lamínulas por tratamento UV por 30 minutos.

Em seguida, incube as lamínulas no meio celular por 30 a 45 minutos antes de plaquear as células. Em seguida, o carregador de 22 por 30 milímetros coloca a lamínula superior de uma câmara de imagem confocal da Warner Instruments usando graxa a vácuo para manter a lamínula no lugar. Coloque uma junta de borracha formadora de câmara no topo da lamínula, permitindo o acesso à tubulação de polietileno de entrada e saída.

Isso permitirá um espaçamento de 150 a 1000 mícrons entre a lamínula superior e a lamínula de cobertura revestida com gel de 22 por 40 milímetros, dependendo do tamanho da junta usada. Em seguida, carregue seringas contendo mídia de célula quente na tubulação de entrada por meio do kit de conectores e verifique se a mídia flui através da tubulação e na lamínula superior. Aplique graxa a vácuo na base da câmara e carregue uma célula de lamínula revestida com gel de 22 por 40 milímetros para cima.

Aplique o meio quente nas células. Coloque o suporte da lamínula superior na base da câmara com as juntas da câmara separando-o da lamínula revestida com gel. Certifique-se de que os pinos de localização dentro da base da câmara estejam dentro dos orifícios de localização na lamínula da tampa superior.

Aplique a placa de pressão na base da câmara e use a chave de placa de pressão para aparafusar e prender a placa de pressão. Verifique o fluxo de mídia através da tubulação e da câmara para monitorar possíveis vazamentos dentro da câmara. E para eliminar quaisquer zonas livres de mídia na superfície da célula.

Aplique a câmara de imagem confocal ao adaptador de platina situado dentro de um suporte de microscópio para imagem de imagem, proteína marcada com fluorescência e esferas fluorescentes embutidas no substrato de gel em um microscópio fluorescente confocal para obter uma imagem da posição do cordão não tensionado dentro do perfusível de gel. Viaja para separar as aderências celulares do gel e tirar uma imagem das esferas fluorescentes no mesmo campo de imagem onde as adegas são ousadas. Quando o protocolo é seguido corretamente, a superfície do gel será relativamente plana e lisa com esferas fluorescentes embutidas uniformemente por toda parte.

A MEC também pode ser visualizada por imunofluorescência de fibronectina. Se medir a contração do gel no local das aderências focais, a imagem do gel e das células deve ser feita no plano óptico confocal das aderências focais. Aqui, as aderências focais são visualizadas no experimento de força de atração em um osteossarcoma humano ou célula U2 OS marcada por GFP pxi.

A contração de um gel pode ser visualizada pelo deslocamento de grânulos fluorescentes embutidos Aderências focais subjacentes. A comparação de grânulos esticados em verde e posições de grânulos não esticados em vermelho permite a quantificação do deslocamento do substrato de gel sob contração, aqui está um resultado representativo de uma célula espalhada que se desprende da superfície do gel pela tripsina. Aqui está um resultado representativo ao comparar as posições do cordão tenso e não esticado.

O uso de algoritmos computacionais sofisticados pode produzir tensões de tração associadas ao deslocamento do cordão e ao módulo de elasticidade dos géis. Essas tensões são visualizadas aqui com um mapa de escala de calor e com vetores onde as cores mais quentes no mapa de calor e setas maiores denotam forças mais fortes. Acabamos de mostrar como fazer matrizes compatíveis para medir a contração celular ao fazer este procedimento.

É importante planejar com antecedência para que as etapas urgentes possam ser executadas rapidamente. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.