Name: Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a preparar matrizes de poliacrilamida flexíveis para quantificar a contração celular usando microscopia de força de tração. Este método permite estudar como a rigidez da matriz extracelular influencia o comportamento celular.

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Agradecemos ao laboratório de Ulrich Schwarz para software de monitoramento computacional usado em quantificação das forças de tração celular (Sabass et al., 2008). Este trabalho foi financiado por um Prémio Carreira Burroughs Wellcome e Prêmio NIH Director da Pioneer (DP10D00354) para ML Gardel e cientista médico Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (5 GM07281 T32) para inverno SP.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O procedimento descrito aqui para a instalação de uma microscopia de força de tração (TFM) experimento, juntamente com a implementação de rotinas de monitoramento computacional (Sabass et al., 2008), permite a quantificação das forças celulares com resolução de micro-escala espacial. Para otimizar o protocolo experimental, é fundamental para formar um substrato de gel puro e uniforme, com revestimento uniforme do ligante ECM. Discutimos potenciais armadilhas abaixo: Não uniforme da sup...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropiltrimetoxissilano</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamida 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamida 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes de 40 nm</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de imagem confocal (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para lamínulas</td><td>Caseira</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada ultravioleta CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Grade de aço inoxidável</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acrilol-X, SE (6-((acrilol)amino)hexanoico)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hidrazina hidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Periodato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de matrizes reclamação para quantificar contração celular

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

A regulação da adesão celular à matriz extracelular (ECM) é essencial para a migração celular e remodelação ECM. Aderências focais são conjuntos macromoleculares que o casal o citoesqueleto de actina F-contrátil ao ECM. Esta conexão permite a transmissão de forças mecânicas intracelular através da membrana celular ao substrato subjacente. Trabalho recente mostrou as propriedades mecânicas do ECM regular de adesão focal e F-actina morfologia, bem como numerosos processos fisiológicos, incluindo a diferenciação celular, divisão, proliferação e migração. Assim, o uso de substratos de cultura de células tem se tornado um método cada vez mais prevalente para controlar com precisão e modular as propriedades mecânicas ECM. Para quantificar as forças de tração em aderências focal em uma célula aderente, compatível substratos são usados ​​em conjunto com imagens de alta resolução e técnicas computacionais em um método denominado microscopia de força de tração (TFM). Esta técnica se baseia em medições da magnitude local e direção de deformações do substrato induzida pela contração celular. Em combinação com alta resolução da microscopia de fluorescência de proteínas fluorescentes marcados, é possível correlacionar organização do citoesqueleto e remodelação com as forças de tração. Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para a preparação de duas dimensões, matrizes compatíveis com a finalidade de criar um substrato de cultura celular com um bem caracterizados, rigidez ajustável mecânica, que é adequado para medir a contração celular. Estes protocolos incluem a fabricação de hidrogéis de poliacrilamida, revestimento de proteínas em gel de ECM como, células de revestimento em gel, e de alta resolução da microscopia confocal usando uma câmara de perfusão. Além disso, oferecemos uma amostra representativa de dados demonstrando localização e magnitude das forças de celulares utilizando protocolos citados TFM.

Neste vídeo, demonstramos as técnicas experimentais usadas para fabricar compliant, matriz extracelular (ECM) substratos revestidos adequado para cultura de células, e que são passíveis de microscopia de força de tração e observando os efeitos da rigidez ECM no comportamento de células.

Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

A regulação da adesão celular à matriz extracelular (MEC) é essencial para a migração celular e a remodelação da MEC. As adesões focais são ...

O objetivo geral deste procedimento é criar matrizes compatíveis para modular e quantificar a contração celular. Isso é realizado primeiramente ativando uma lamínula para permitir a ancoragem da matriz. O segundo passo do procedimento consiste em polimerizar um gel de poliacrilamida à lamínula ativada.O terceiro passo do procedimento é semear as células sobre o gel e permitir que elas adiram. O passo final do procedimento é obter imagens do gel para gerar dados a serem analisados por protocolos de microscopia de força de tração. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as células aplicando forças de tração sobre sua matriz por meio da microscopia de força de tração.Olá, sou Yvonne Eons do laboratório de Margaret ELL do Departamento de Física e do Instituto de Dinâmica Biofísica da Universidade de Chicago. Sou Steven Winter, também do laboratório Guard. Hoje gostaríamos de mostrar a você um procedimento para fabricar matrizes flexíveis para medir a contração celular.Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar redes contráteis de actina e miosina. Então, vamos começar. Antes da ativação do lamínula, coloque várias lamínulas nº 1,5 de 22 por 40

preparation-of-complaint-matrices-for-quantifying-cellular-contraction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Este vídeo descreve a medição da contração da célula do músculo liso aórtico (SMC) usando detecção de impedância de substrato de célula elétrica, ou ECIS. O ECIS mede a locomoção das células e é um método confiável para medir as contrações.

Medindo a contração do SMC in vitro: um método não invasivo para avaliar a contração das células musculares lisas usando detecção de impedância de substrato de célula elétrica

Este protocolo descreve o uso de braços de suporte de silicone em micro-como as superfícies de cultura maleáveis ​​para a medição da contractilidade de células do músculo in vitro. Contração celular provoca flexão cantilever, que pode ser medido, registrado, e convertido em leituras de força, proporcionando um sistema não invasivo e escalável para medir a função contrátil in vitro.

Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil In Vitro

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

Apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos eletromecânicos da ativação do GtACR1 em cardiomiócitos de coelho. Fornecemos informações detalhadas sobre isolamento celular, cultivo e transdução adenoviral, e sobre experimentos funcionais com as técnicas de patch-clamp e fibra de carbono.

Avaliação eletromecânica da atividade cardiomiocito optogeneticamente modulada

Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.

Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

Este trabalho apresenta um protocolo flexível para utilizar a tecnologia de superfícies contraíveis elastoméricas rotuladas fluorescentes (FLECS) em formato de microwell para quantificação simplificada e prática de forças contraídas unicelulares com base em deslocamentos visualizados de micropatterns de proteína fluorescente.

Análise simplificada e de alto rendimento da contractilidade unicelular usando Elastômeros Micropatterned

A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.

Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco

Este protocolo descreve como medir a contratilidade em cardiomiócitos primários humanos adultos de corações doados com o sistema MyoBLAZER, uma plataforma confiável para avaliar mudanças na contratilidade induzidas por drogas durante o desenvolvimento pré-clínico.

Medida da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Primários Humanos Isolados

Aprenda a preparar matrizes de poliacrilamida flexíveis para quantificar a contração celular usando microscopia de força de tração. Este método permite estudar como a rigidez da matriz extracelular influencia o comportamento celular.

Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

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