Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver uma estratégia simples e eficiente para imobilizar qualquer proteína de interesse em hidrogéis de poliacrilamida, a fim de controlar independentemente vários parâmetros do microambiente celular. Isso é feito espalhando primeiro a solução de proteína pela superfície do carimbo PDMS. O segundo passo é secar cuidadosamente a superfície estruturada do carimbo PDMS com um fluxo constante de gás nitrogênio de alta pureza.

Em seguida, o carimbo revestido de proteína é colocado com uma superfície estruturada em contato com a superfície do hidrogel seco e breves pontos de pressão são aplicados na parte superior do carimbo PDMS para garantir um bom contato entre as microcaracterísticas do carimbo e a superfície do hidrogel, a etapa final é remover suavemente o carimbo PDMS da superfície do hidrogel e limpar o carimbo Após a ação das zonas não impressas. Com BSA, as células podem ser assentadas na superfície do hidrogel de micro padrão. Em última análise, um microscópio de fluorescência invertida é usado para observar as microcaracterísticas da proteína.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da transdução mecânica, como a contribuição relativa das propriedades da matriz extracelular, por exemplo, rigidez, densidade de ligons celulares ou natureza da proteína. No processo de transação ano, recomenda-se que este procedimento seja realizado em uma capela química. Comece colocando lamínulas de vidro circulares de 25 milímetros de diâmetro em uma placa de Petri e espalhando solução de hidróxido de sódio 0,1 molar sobre elas por cinco minutos.

Remova a solução de hidróxido de sódio e mergulhe totalmente as lamínulas em DD H2O estéril, agite suavemente por 20 minutos em uma placa de balanço, drene o DDH estéril dois O, adicione mais DDH estéril dois O para mergulhar totalmente as lamínulas e balance suavemente por mais 20 minutos. Remova as lamínulas com uma pinça estéril e coloque-as em uma nova placa de Petri. Com o lado ativado voltado para cima, seco, a cobertura desliza com um fluxo constante de gás nitrogênio de alta pureza.

Quando as lamínulas estiverem secas, leve-as de volta à capa de cultura estéril e espalhe uma fina camada de três trimetil propila acrl no lado ativado de cada tampa. Deslize por uma hora após uma hora. Lave extensivamente as lamínulas de vidro com DD H2O estéril.

Em seguida, mergulhe as lamínulas em DD H2O estéril em uma nova placa de Petri. Sele a placa de Petri com filme e coloque-a em uma placa de balanço sob agitação suave por 10 minutos. Por fim, use uma pinça estéril com pontas finas para transferir as lamínulas do DDH dois O para uma nova placa de Petri.

Com a face ativada para cima. Cubra o prato com papel alumínio para evitar que a poeira grude nas lamínulas e guarde em temperatura ambiente em local seco. Para iniciar este procedimento, prepare cinco mililitros de uma solução estéril de hidrogel hidroxi poliacrilamida e 100 microlitros de uma solução fresca de 10% de amônio por sulfato.

Conforme descrito no texto do protocolo, adicione 2,5 microlitros de tetrametilenodiamina e 25 microlitros de solução de amônio por sulfato à solução de hidrogel de hidroxipoliacrilamida. Para iniciar a polimerização, misture a solução por três pipetas sucessivas sem introdução de bolhas em condições estéreis sob uma capa estéril, coloque uma gota de 25 microlitros da solução de hidrogel de hidroxipoliacrilamida em uma lamínula circular de 25 milímetros e imediatamente coloque uma lamínula de vidro circular de 22 milímetros no topo da gota para espremer a solução de hidrogel de hidroxipoliacrilamida A lamínula de vidro de 22 milímetros foi ativada anteriormente por uma exposição de sete minutos em um limpador de ozônio UV.

Centralize a lamínula de vidro com uma pinça estéril e alise as bolhas. Deixe o hidrogel hidroxipoliacrilamida polipolimerizar em temperatura ambiente por 15 minutos. Inverta manualmente a solução de hidrogel hidroxipoliacrilamida restante no tubo.

Para acompanhar a conclusão do processo de polimerização, mergulhe totalmente as lamínulas com D DH estéril dois o. Separe cuidadosamente a lamínula de vidro de 22 milímetros inserindo a borda de uma lâmina de barbear entre a lamínula de vidro de 22 milímetros e a camada de hidrogel de hidroxi poliacrilamida. Lave o hidrogel de hidroxipoliacrilamida três vezes com PBS estéril e deixe o gel totalmente imerso em PBS estéril para manter a hidratação.

Os micro selos de polidimetil soano ou PDMS usados neste procedimento foram fabricados conforme descrito no protocolo de texto. Coloque os micro carimbos PDMS em uma solução aquosa de etanol 50 a 50 e sonice por 15 minutos. Seque os selos com um fluxo de vapor de nitrogênio e coloque-os em um limpador de ozônio UV por sete minutos.

Sob um capuz estéril, coloque uma gota de 150 microlitros de uma solução de proteína desejada na superfície microestruturada do APDS. O nin FI do selo é usado nesta demonstração. Espalhe a solução de proteína pela superfície do carimbo, movendo-a com uma ponta de pipeta estéril em direção a cada canto do selo.

Deixar a solução proteica absorver no carimbo PDMS durante 60 minutos. Sob este capuz estéril, desligue as lâmpadas para evitar danos às proteínas. Em seguida, transfira as lamínulas revestidas com hidrogel de hidroxipoliacrilamida para uma nova placa de Petri.

Remova o excesso de PBS da superfície dos substratos de hidrogel de hidroxipoliacrilamida com o baixo fluxo de nitrogênio em condições estéreis. Interrompa o procedimento. Assim que nenhuma evidência de água parada na superfície do gel for observada.

O gel não deve ser completamente seco nesta fase. Seque cuidadosamente a superfície estruturada do carimbo PDMS com um fluxo constante de gás nitrogênio de alta pureza. Segure o carimbo revestido de proteína com uma pinça de tecido de curativo e coloque uma superfície estruturada em contato com a superfície do hidrogel seco.

Aplique breves pontos de pressão com a ponta da pinça na parte superior do carimbo PDMS para garantir um bom contato entre as microcaracterísticas do carimbo e a superfície do hidrogel, deixe o carimbo PDMS na superfície do hidrogel por uma hora em temperatura ambiente após uma hora. Remova suavemente o carimbo PDMS do hidrogel de hidroxipoliacrilamida com pinça de curativo e limpe o carimbo fornicando em uma solução de água de etanol por 15 minutos. Lavar extensivamente o hidrogel hidroxipoliacrilamida estampado com três trocas de PBS em condições estéreis durante 10 minutos por troca.

Após a última lavagem do PBS, adicione uma solução estéril de BSA e incube durante a noite a quatro graus Celsius sob agitação suave em uma placa de balanço. Isso comeu as zonas não impressas no dia seguinte. Lavar extensivamente o hidrogel hidroxipoliacrilamida estampado com três trocas de PBS em condições estéreis durante 10 minutos por troca.

Os hidrogéis de hidroxipoliacrilamida estampados podem ser armazenados a quatro graus Celsius por até uma semana. Os resultados mostram uma correlação linear entre a evolução da rigidez dos hidrogéis de hidroxipoliacrilamida e a quantidade de reticulador de acrilamida bis, imagens epifluorescentes de micropadrões retangulares laminados depositados em hidroxipoliacrilamida Hidrogéis de três rigidezes diferentes demonstram o ajuste independente da geometria do micropadrão e da rigidez da matriz. A densidade do ligante celular pode ser modulada variando a concentração da solução proteica usada para incubar os selos PDMS.

Aqui são mostradas duas imagens fluorescentes de impressões sequenciais de microcontato. Listras de fibronectina em vermelho e laminina em verde, cruzadas a 90 graus e listras de fibrina laminina e colágeno micro impressas sequencialmente em um substrato de hidrogel de poliacrilamida hidroxi pascal de 25 quilos. Quando as células primárias foram plaqueadas em superfícies de hidrogel hidroxi poliacrilamida de micro padrão homogeneamente revestidas, a viabilidade celular foi de pelo menos 80% até três dias após o plaqueamento.

Também foi observado que as células proliferam mais em substratos rígidos em comparação com substratos moles. Quando banhado em micro padrões retangulares revestidos de fibronectina depositados em hidrogéis de hidroxipoliacrilamida de três rigidezes diferentes. As células endoteliais primárias exibem baixa densidade de fibras de actina e um núcleo arredondado no mole.

Os substratos em substratos mais rígidos, as fibras de actina são mais retas e espessas e o núcleo é deformado após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da transdução mecânica explorarem o papel individual dos parâmetros dos microambientes celulares em uma ampla gama de sistemas celulares, como células primárias ou estaminais, nível de tecido, organismo modelo, moda, demografia ou sistemas de órgãos.