Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver uma estratégia simples e eficiente para imobilizar qualquer proteína de interesse em hidrogéis de poliacrilamida, a fim de controlar independentemente diversos parâmetros do microambiente celular. Isso é realizado primeiramente espalhando a solução proteica sobre a superfície do carimbo de PDMS. O segundo passo consiste em secar cuidadosamente a superfície estruturada do carimbo de PDMS com um fluxo constante de gás nitrogênio de alta pureza.

Em seguida, o carimbo revestido com proteína é posicionado com a superfície estruturada em contato com a superfície do hidrogel seco, e pontos de pressão breves são aplicados na parte superior do carimbo de PDMS para garantir um bom contato entre as microestruturas do carimbo e a superfície do hidrogel; o passo final consiste em remover suavemente o carimbo de PDMS da superfície do hidrogel e limpar o carimbo após a remoção das zonas não impressas. Com BSA, as células podem aderir à superfície do hidrogel com microestruturas. Por fim, utiliza-se um microscópio de fluorescência invertido para observar as microestruturas proteicas.

Este método pode ajudar a responder questões-chave no campo da transdução mecano, como a contribuição relativa das propriedades da matriz extracelular, por exemplo, rigidez, densidade de ligantes celulares ou natureza proteica. No processo de ano transação, recomenda-se que este procedimento seja realizado em uma cabine de segurança química. Comece colocando lamínulas circulares de vidro com diâmetro de 25 milímetros em uma placa de Petri e espalhe sobre elas uma solução de hidróxido de sódio 0,1 molar por cinco minutos.

Remova a solução de hidróxido de sódio e imerja completamente as lamínulas em água estéril DD H2O, agitando suavemente por 20 minutos em uma placa agitadora. Descarte a água estéril DDH₂O, adicione mais água estéril DDH₂O para imergir completamente as lamínulas e agite suavemente por mais 20 minutos. Remova as lamínulas com pinças estéreis e coloque-as em uma nova placa de Petri. Com o lado ativado voltado para cima, seque as lamínulas com um fluxo contínuo de gás nitrogênio de alta pureza.

Uma vez que as lamínulas estejam secas, leve-as de volta à capela de cultura estéril e espalhe uma camada fina de três trimetil propil acrl no lado ativado de cada lâmina. Deixe repousar por uma hora após uma hora. Lave extensivamente as lamínulas de vidro com H2O estéril DD.

Em seguida, mergulhe as lamínulas em água destilada estéril (DD H2O) em uma nova placa de Petri. Sobreponha a placa de Petri com filme aderente e coloque-a em uma placa agitadora sob agitação suave por 10 minutos. Por fim, utilize pinças estéreis de pontas finas para transferir as lamínulas da DDH dois O para uma nova placa de Petri.

Com a face ativada voltada para cima. Cubra a placa com papel alumínio para evitar que poeira adere aos lamínulas e armazene em temperatura ambiente em local seco. Para iniciar este procedimento, prepare cinco mililitros de uma solução estéril de hidrogel de hidroxipoliacrilamida e 100 microlitros de uma solução fresca de persulfato de amônio a 10%.

Conforme descrito no texto do protocolo, adicione 2,5 microlitros de tetra metileno diamina e 25 microlitros da solução de persulfato de amônio à solução de hidrogel de hidroxi poliacrilamida. Para iniciar a polimerização, misture a solução por meio de pipetagem sucessiva três vezes, sem introduzir bolhas, em condições estéreis sob uma capela estéril, coloque uma gota de 25 microlitros da solução de hidrogel de hidroxi poliacrilamida sobre uma lamínula circular de 25 milímetros e imediatamente posicione uma lamínula de vidro circular de 22 milímetros sobre a gota, comprimindo a solução de hidrogel de hidroxi poliacrilamida. A lamínula de vidro de 22 milímetros foi previamente ativada por exposição de sete minutos em um limpador de ozônio com UV.

Centralize a lamínula de vidro com pinças estéreis e alise quaisquer bolhas. Deixe o hidrogel de hidroxipoliacrilmida polimerizar à temperatura ambiente por 15 minutos. Inverta manualmente a solução restante de hidrogel de hidroxipoliacrilmida no tubo.

Para acompanhar a conclusão do processo de polimerização, imergir completamente as lamínulas em D DH estéril dois o. Separar cuidadosamente a lamínula de vidro de 22 milímetros inserindo a borda de uma lâmina de barbear entre a lamínula de vidro de 22 milímetros e a camada de hidrogel de hidroxi poliacrilamida. Lavar o hidrogel de hidroxi poliacrilamida três vezes com PBS estéril e deixar o gel completamente imerso em PBS estéril para manter a hidratação.

Os microcarimbos de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS utilizados neste procedimento foram fabricados conforme descrito no protocolo textual. Coloque os microcarimbos de PDMS em uma solução de etanol e água na proporção de 50 para 50 e submeta-os à sonicação por 15 minutos. Seque os carimbos com um fluxo de nitrogênio e posicione-os com o padrão voltado para cima em um limpador de ozônio UV por sete minutos.

Sob uma capela estéril, coloque uma gota de 150 microlitros de uma solução proteica desejada sobre a superfície microestruturada de A-P-D-M-S. O carimbo FI nin é utilizado nesta demonstração. Espalhe a solução proteica sobre a superfície do carimbo movendo-a com a ponta estéril de uma pipeta em direção a cada canto do carimbo.

Deixe a solução proteica absorver no carimbo de PDMS por 60 minutos. Sob essa câmara estéril, desligue as lâmpadas para evitar danos à proteína. Em seguida, transfira as lamínulas revestidas com hidrogel de hidroxi poliacrilamida para um novo recipiente de Petri.

Remova o excesso de PBS da superfície dos substratos de hidrogel de hidroxipoliacrilmida com um fluxo baixo de nitrogênio em condições estéreis. Interrompa o procedimento assim que não houver mais evidência de água parada na superfície do gel.

O gel não deve ser secado completamente nesta etapa. Seque cuidadosamente a superfície estruturada do carimbo de PDMS com um fluxo constante de gás nitrogênio de alta pureza. Segure o carimbo revestido com proteína usando pinças de gaze e posicione a superfície estruturada em contato com a superfície do hidrogel seca.

Aplicar pontos de pressão breves com a ponta da pinça na parte superior do carimbo de PDMS para garantir um bom contato entre as microestruturas do carimbo e a superfície do hidrogel; deixe o carimbo de PDMS sobre a superfície do hidrogel por uma hora à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o carimbo de PDMS do hidrogel de hidroxi poliacrilamida usando pinça de curativo e limpe o carimbo agitando-o em uma solução aquosa de etanol por 15 minutos. Lave extensivamente o hidrogel de hidroxi poliacrilamida carimbado com três trocas de PBS em condições estéreis, sendo 10 minutos por troca.

Após a última lavagem com PBS, adicione uma solução estéril de BSA e incube durante a noite a quatro graus Celsius sob agitação suave em uma placa oscilante. Isso irá ate as zonas não impressas no dia seguinte. Lave extensivamente o hidrogel de hidróxi poliacrilamida carimbado mediante três trocas de PBS em condições estéreis, com 10 minutos por troca.

Os hidrogéis de hidroxi poli acrilamida gravados podem ser armazenados a quatro graus Celsius por até uma semana. Os resultados mostram uma correlação linear entre a evolução da rigidez dos hidrogéis de hidroxi poli acrilamida e a quantidade de agente de reticulação bis acrilamida. Imagens epi fluorescentes de microestruturas retangulares laminadas depositadas em hidrogéis de hidroxi poli acrilamida com três rigidezes diferentes demonstram o ajuste independente da geometria da micropadrão e da rigidez da matriz. A densidade de ligantes celulares pode ser modulada variando a concentração da solução proteica utilizada para incubar os carimbos de PDMS.

Mostradas aqui estão duas imagens fluorescentes de impressões por microcontato sequenciais. Listras de fibronectina em vermelho e laminina em verde, cruzadas a 90 graus, e listras de laminina fibrina e colágeno impressas por microimpressão sequencial em um substrato de hidrogel de hidroxipoliacrilmida de 25 quilopascal. Quando células primárias foram semeadas em superfícies de hidrogel de hidroxipoliacrilmida revestidas homogeneamente e com microdesenho, a viabilidade celular foi de pelo menos 80% até três dias após a semeadura.

Também foi observado que as células proliferam mais em substratos rígidos do que em substratos macios. Quando cultivadas em microdesenhos retangulares recobertos com fibronectina depositados em hidrogéis de hidroxi poliacrilamida com três rigidezes diferentes, as células endoteliais primárias exibem baixa densidade de fibras de actina e um núcleo arredondado no substrato macio.

Em substratos mais rígidos, as fibras de actina são mais retas e espessas e o núcleo é deformado após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de transdução mecânica explorarem o papel individual dos parâmetros dos microambientes celulares em uma ampla gama de sistemas celulares, como células primárias ou células-tronco, nível tecidual, organismo modelo, moda, demografia ou sistemas de órgãos.