Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

O protocolo automatizado MeshAndCollect foi desenvolvido para combinar cristalografia serial com coleta de dados de rotação padrão para medir pequenos cristais de amostras de discos. O método identifica primeiro a posição dos cristais montados no mesmo suporte de amostra para, em seguida, direcionar a coleta de conjunto de dados parciais que será posteriormente mesclado e utilizado para a solução da estrutura. MeshAndCollect é convincente, pois permite que você faça experimentos rapidamente e com a mesma configuração, solução de estrutura, triagem de ligantes, e tudo isso com cristais minúsculos.

O método é compatível com o VMX do feixe síncrotron idealmente equipado com alto fóton flex, um pequeno diâmetro de feixe e um detector de recarga rápida. Primeiro, conecte-se ao sistema de informações estendida para o banco de dados da linha de fundo de cristalografia de proteínas e escolha MX.Log in com o número do experimento e a senha do formulário A. Em seguida, selecione Adicionar novo e preencha as informações solicitadas.

Selecione Adicionar parcial e preencha os dados relevantes. Selecione Adicionar recipiente, escolha um disco SC3 e preencha as informações necessárias, incluindo as posições dos titulares de amostra no disco. Na cabana experimental, carregue o disco no divisor de amostras e observe sua posição.

Em seguida, faça login no sistema de informações para o banco de dados da linha de dados da linha de fundo de cristalografia de proteínas. Selecione Preparar experimento, encontrar o Envio, selecionar Próximo e indicar a posição de feixe e disco no trocador de amostras. Faça login no software de controle de linha de feixe com o número experimental e senha fornecidos no formulário A.

Pressione o Sync para sincronizar o software de controle de feixe com o sistema de informações para o banco de dados da linha de fundo de cristalografia de proteínas. Use o software de controle de linha de vigas para montar o suporte de amostra no goniômetro. Em seguida, clique com o botão direito de clicar em uma posição na área do trocador de amostras e selecione Amostra de Montagem.

Selecione o botão central e, em seguida, três cliques central no meio da borda da ponta do loop. Salve a posição centralada selecionando Salvar. Em Advanced, adicione a reorientação visual do fluxo de trabalho à fila de coleta de dados.

Em seguida, inicie o fluxo de trabalho clicando em Coletar fila. Em seguida, selecione uma das posições de centro salvas clicando nela. Clique novamente no botão central e, em seguida, um centro de três cliques no meio do início da haste do loop.

Salve a segunda posição clicando em Salvar. E, em seguida, clique em Continuar. Após o fluxo de trabalho alinhar o plano do suporte de amostra com o eixo de rotação do goniômetro, centralize novamente o suporte da amostra em algum lugar no meio da malha.

Oriente o suporte amostral de modo que a face da malha seja perpendicular à direção do feixe de raios-X girando o eixo ômega usando o software de controle de linha de vigas. No software de controle de linha de feixe, clique no menu suspenso da abertura e selecione um valor. Em seguida, clique no ícone da ferramenta de malha para trazer a janela da ferramenta de malha.

Na visão amostral do software de controle de linha de vigas, desenhe a malha clicando à esquerda e arrastando o mouse sobre a área que contém cristais no suporte da amostra. Para salvar a malha, clique no botão plus na janela da ferramenta de malha. No campo de resolução do software de controle de linha de luz, digite a resolução na qual as imagens de difração devem ser coletadas.

Se não se sabe nenhuma informação prévia sobre a qualidade da difração dos cristais, recomenda-se um valor entre dois e 2,5. Selecione MeshAndCollect na guia de coleta de dados Avançado. Adicione-o à fila e clique em Coletar a Fila.

Na janela do parâmetro, use os parâmetros padrão dependentes da linha de trave. No experimento descrito aqui, os parâmetros padrão são 0,037 segundo tempo de exposição por ponto de varredura de malha, transmissão de 100% e oscilação de um grau por linha de varredura de malha. Clique em Continuar.

As varreduras de malha e as imagens de difração coletadas em cada ponto de grade são analisadas e classificadas de acordo com a força de difração com o software Dozer. Após a análise do Dozer, um mapa de calor é gerado e a ordem para coletas parciais subsequentes de dados é atribuída automaticamente com base na força de difração. Por fim, clique em Continuar para iniciar as coletas parciais de dados.

O MeshAndCollect, implementado no MXCuBE, foi utilizado para a coleta de conjuntos de dados de difração parcial de pequenos cristais de Cerulean localizados no mesmo suporte de amostra em que a identificação visual dos cristais era difícil. Para testar o suporte da amostra, uma grade foi desenhada sobre o centro do loop de malha e, com base no mapa de calor de pontuação do Dozer, foram coletados automaticamente 85 conjuntos de dados de difração parcial. Estes foram integrados individualmente e fundidos para produzir um conjunto de dados com 99,8% de completude em uma resolução de 1,7 angstroms.

Como esperado, a estrutura cristalina de Cerulean poderia ser resolvida por substituição molecular usando o conjunto de dados gerado. Após o refinamento, foram obtidos R trabalho de 22,8% e R livre de 25,4%. A super posição da estrutura previamente determinada mostra um RMSD global em posições c-alfa de 0,1 angstroms.

Para projetos onde a otimização da fase de crescimento do cristal, o MeshAndCollect oferece a possibilidade de obter um conjunto completo de dados com base na combinação desses conjuntos de dados parciais amorfos obtidos a partir de cristais menores. Esta técnica abriu caminho para biólogos estruturais resolverem uma estrutura a partir de amostras de peças onde apenas alguns décimos de micro cristais não puderam ser produzidos.