Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma técnica para a introdução de micropartículas no sistema circulatório de peixes-zebra adultos por injeção no rim do peixe. As micropartículas introduzidas são visualizadas na vasculatura por uma técnica simples de imagem intravital nas brânquias dos peixes. Este procedimento pode ser usado, por exemplo, para realizar medições repetidas do pH do sangue de peixes in vivo pela introdução de sondas fluorescentes microencapsuladas para pH.

Para fazer isso, no primeiro estágio, o corante sensível ao pH SNARF-1 conjugado com dextrano é encapsulado no invólucro de polieletrólito semipermeável usando a abordagem camada por camada. O corante fluorescente é co-precipitado em micronúcleos porosos de carbonato de cálcio, e os núcleos são revestidos com várias camadas de polímeros não biodegradáveis de carga oposta e revestidos com um polímero biocompatível contendo polietilenoglicol. Em seguida, os núcleos de carbonato de cálcio são resolvidos para obter microcápsulas inteiras envolvendo SNARF-1.

No segundo estágio da anestesia e fixação do peixe, as microcápsulas preparadas são injetadas diretamente no rim do animal para fornecer corante encapsulado no sistema circulatório do peixe. Em seguida, é necessária uma cirurgia mínima para remover a cobertura branquial e desnudar os capilares das brânquias dos peixes. Em seguida, a visualização das microcápsulas no sangue e o registro do espectro fluorescente podem ser feitos in vivo por microscopia intravital para monitorar o pH do sangue.

Quando a injeção foi realizada corretamente, é possível observar microcápsulas fluorescentes nas brânquias dos peixes imediatamente após o procedimento. O espectro de florescência da sonda encapsulada pode ser registrado usando um espectrômetro acoplado a um microscópio fluorescente. O SNARF-1 tem dois picos de emissão, e a razão entre dois comprimentos de onda correspondentes a esses picos pode ser usada para medir o pH.

O procedimento proposto permite a entrega de microcápsulas fluorescentes no sistema circulatório de peixes e o monitoramento remoto da fluorescência no sangue de peixes in vivo. No caso de pesquisas fisiológicas, a principal vantagem desse método são as medições repetidas dos parâmetros sanguíneos em pequenos animais de laboratório, que geralmente são difíceis de realizar. Se for usada uma sonda fluorescente sensível à luz, é aconselhável realizar todo o procedimento em uma sala com luz reduzida.

Misture dois mililitros de solução de um corante fluorescente ligado a polímero escolhido aqui, SNARF-1-dextrano, com 0,6 mililitro de uma solução molar de cloreto de cálcio e 0,6 mililitro de uma solução molar de carbonato de sódio sob agitação rápida. Nesta etapa, micronúcleos porosos de carbonato de cálcio que envolvem o corante fluorescente são sintetizados. Após cinco, 10 segundos de agitação, transferir a suspensão para microtubos de dois mililitros e centrifugar por 15 segundos para peletizar micronúcleos de carbonato de cálcio.

Descarte o sobrenadante, lave os núcleos com cerca de dois mililitros de água deionizada e agite a suspensão. Repita o procedimento de centrifugação e lavagem três vezes. Incubar a suspensão durante um minuto num banho ultrassónico para reduzir a agregação dos micronúcleos.

Ressuspenda os micronúcleos de carbonato de cálcio em aproximadamente dois mililitros de uma solução de quatro microgramas por mililitro do polímero catiônico PAH para depositar a primeira camada polimérica nos moldes. Mantenha os micronúcleos na solução de pH por cerca de cinco minutos com agitação constante. Após 15 segundos de centrifugação, rejeitar o sobrenadante com HAP não ligado e lavar os micronúcleos com água três vezes por centrifugação múltipla e por etapas de lavagem.

Repita o mesmo procedimento com quatro miligramas por mililitro de solução de polímero aniônico PSS para depositar a segunda camada polimérica nos moldes. Logo antes de adicionar a próxima camada, é aconselhável aplicar um minuto de incubação em banho ultrassônico. Repita sequencialmente a deposição de polímeros catiônicos e aniônicos seis vezes para obter um invólucro de microcápsulas de 12 camadas.

Em seguida, incube micronúcleos com conchas na poli-L-lisina enxertada com polietilenoglicol por pelo menos duas horas. Em seguida, lave os micronúcleos cobertos uma vez com água por centrifugação sequencial e ressuspensão. Finalmente, dissolva os moldes de carbonato de cálcio em dois mililitros de solução de EDTA 0,1 molar, ajustada para pH próximo a 7,1, para obter microcápsulas ocas.

Rejeitar o sobrenadante após centrifugação de 45 segundos e repetir a lavagem com EDTA duas vezes. Descarte o sobrenadante após centrifugação de 45 segundos e adicione dois mililitros de solução salina. Repita as etapas de centrifugação de lavagem com solução salina três vezes.

Investigar a distribuição de tamanho e a concentração das microcápsulas preparadas em um hemocitômetro sob um microscópio fluorescente. Use o ImageJ ou software equivalente para análise de tamanho das partículas. Armazene a sonda encapsulada obtida no escuro.

Para preparar o sistema óptico, coloque o conjunto necessário de filtros fluorescentes no microscópio fluorescente de acordo com as características do corante fluorescente aplicado e ligue a lâmpada fluorescente. Puxe a alavanca para as oculares. Conecte a fibra óptica de uma extremidade ao espectrômetro e na outra extremidade a um colimador.

Usando adaptadores, toque o colimador no foco do tubo da câmera ou em outra porta disponível do microscópio fluorescente. Para calibração das microcápsulas preparadas, coloque cerca de cinco microlitros da suspensão da microcápsula em uma lâmina de microscópio e seque a gota em local escuro. Ligue o espectrômetro.

Execute o programa de controle do espectrômetro e prepare o espectrômetro para medições. Para calibrar as características espectrais do SNARF-1 microencapsulado, use uma série de tampões com pH diferente. Coloque cerca de 10 microlitros de tampão de sódio nas microcápsulas secas com SNARF-1 e cubra-as com uma lamínula.

Coloque uma lâmina de vidro no microscópio stage. Localize as microcápsulas usando uma ampliação de cerca de 400. Gire a alavanca do microscópio para a porta da câmera.

Registar a fluorescência com o espectrómetro. Certifique-se de que o sinal espectral esteja muito além do nível de fundo e observe que as microcápsulas não estão em uma bolha. Evite a iluminação prolongada das mesmas microcápsulas, pois o SNARF-1 é sensível ao fotobranqueamento.

Gire a alavanca de volta para as oculares. Calcular a razão entre a intensidade de fluorescência do SNARF-1 encapsulado no comprimento de onda correspondente aos picos de emissão do corante protonado e desprotonado. Construa uma curva de calibração da dependência da razão com o pH do meio.

Colete cerca de 10 microlitros de sangue de peixes sacrificados. Determine seu pH por medidor de pH com um microeletrodo. Em seguida, coloque o sangue na lâmina com microcápsulas secas e registre a proporção da intensidade de fluorescência conforme descrito para tampões de calibração.

Como você deve levar em consideração a influência dos componentes sanguíneos na leitura do SNARF-1 encapsulado, ajuste o coeficiente linear da curva de calibração para fazer com que a curva corresponda às medições no sangue de peixe. Para preparar a agulha para a injeção, solte uma agulha de aço da ponta da seringa de insulina, removendo o plástico com uma lanceta afiada. Insira a agulha até a metade no microcapilar de vidro.

Solde-o rápida e suavemente com uma tocha a gás. Conecte o microcapilar de vidro ao microinjetor e lave-o com água estéril por três vezes. Certifique-se de que o líquido flui através da agulha.

Encha o sistema com água. Certifique-se de que não haja bolhas no sistema. No dia do experimento, tome a suspensão preparada de microcápsulas em solução salina estéril contendo de metade a seis milhões de microcápsulas por microlitro.

Ressuspendê-lo pelo banho ultrassônico por um minuto. Durante a injeção seguinte, agite o frasco periodicamente para ressuspender as microcápsulas e evitar sua agregação. Usando uma colher, retire o peixe do anestésico e coloque-o suavemente sobre uma esponja úmida em posição lateral com a cabeça voltada para a esquerda se você for destro ou para a direita se for canhoto.

Pouco antes da injeção, aspire um a dois milímetros de ar para o capilar de vidro conectado ao microinjetor. Em seguida, carregue-o com aproximadamente dois microlitros das microcápsulas dispersas. Estabilize suavemente o corpo do peixe na esponja com a mão não dominante.

Encontre a linha lateral do peixe. Coloque a agulha um mililitro abaixo do ponto médio de um segmento abdominal da linha lateral. Em seguida, com um movimento de raspagem, mova a escama de peixe para o lado e faça um furo.

Insira a agulha no corpo em um ângulo de 45 graus em relação à superfície da mesa. Empurre a agulha em direção à coluna até que ela se encoste cuidadosamente na coluna. Em seguida, libere lentamente cerca de um microlitro da suspensão da microcápsula no rim e retire lentamente a agulha.

Lave o peixe da cabeça à cauda com um jato de água para remover as microcápsulas derramadas no local da injeção. Use uma tesoura de dissecação para remover a cobertura branquial da cabeça do peixe e desnudar as guelras dos peixes. Enxágue as guelras com água.

Usando uma colher, transfira o peixe para uma lâmina de microscópio e coloque-o no palco de um microscópio fluorescente. Ao realizar os procedimentos a seguir, certifique-se de que as guelras do peixe não sequem. Para fazer isso, umedeça-os periodicamente com água usando uma pipeta Pasteur.

Escureça a sala e, usando baixa ampliação, inspecione as brânquias para encontrar microcápsulas fluorescentes. Ao encontrá-lo, mude a lente para uma magnitude maior e posicione-a no centro do campo de visão. Gire a alavanca para a porta com um espectrômetro conectado.

Registre o sinal espectral. Gire a alavanca de volta para as oculares. Repita as medições para diferentes microcápsulas várias vezes.

Transfira os peixes para o aquário com aeração adequada para recuperação. O procedimento de medição pode ser repetido para um indivíduo por várias vezes com o uso de anestesia repetida ou outro método de fixação. A imagem mostra um exemplo representativo de medições in vivo de sangue de peixe-zebra e hipercapnia por corante fluorescente encapsulado SNARF-1.

Em condições de controle, o pH do sangue permanece estável durante quatro horas após a injeção de microcápsulas, enquanto cinco minutos de exposição sob dióxido de carbono elevado causa acidificação do sangue dos peixes. Ao realizar o procedimento, é importante minimizar o estresse animal causado pelo manuseio e cirurgia. Com alguma prática, tanto a injeção quanto o registro do sinal levam em média cerca de dois, três minutos, portanto, este protocolo permite concluir as manipulações antes que o peixe acorde da anestesia leve.

Durante o procedimento, certifique-se de que as guelras do peixe estejam sempre umedecidas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a implantação simples e eficaz de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos. Como demonstrado, esta técnica é muito conveniente para registros in vivo repetidos do pH do sangue em peixes-zebra adultos usando microcápsulas preenchidas com uma sonda fluorescente.