ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

O objetivo geral do ODELAY é medir os fenótipos de crescimento de células individuais que crescem em colônias de maneira de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em microbiologia, genética e biologia de sistemas, como os efeitos de perturbações genéticas e interações medicamentosas nos fenótipos de crescimento de qualquer microrganismo formador de colônias. A principal vantagem do ODELAY é que ele permite ao pesquisador observar e quantificar diretamente a heterogeneidade da população entre um grande número de indivíduos.

Antes de montar o molde de ágar, limpe os moldes de acrílico com 70% de etanol e seque-os com ar forçado. Existem três peças inferiores e duas peças verticais. Para iniciar a montagem do molde de ágar, pegue as três peças inferiores e monte-as de forma que as duas peças idênticas ensanduichem a terceira peça.

Use dois pequenos clipes de fichário para prender as peças de base de cada lado. Coloque os montantes no molde, certificando-se de que a curva do laser esteja posicionada corretamente. Coloque uma lâmina de vidro limpa e seca no molde e segure-a no lugar enquanto coloca uma segunda lâmina de vidro do outro lado.

Prenda o conjunto com um clipe de fichário maior. Prenda ambas as lâminas com clipes de fichário maiores, certificando-se de que cada clipe de fichário superior esteja em contato com a lâmina de vidro que se sobrepõe ao acrílico. Antes de encher o molde montado com ágar fundido, certifique-se de que as bordas estejam seladas pipetando cerca de 70 microlitros de meio de ágar fundido ao longo do lado interno do molde.

Encha o molde sem prender as bolhas de ar no interior, pipetando lentamente o ágar fundido ao longo da borda do molde. Depois que o molde estiver cheio, deixe-o esfriar a cerca de 23 graus Celsius de temperatura ambiente por 40-60 minutos. O próximo passo é a separação do molde.

Comece removendo o clipe de fichário inferior. Em seguida, remova a parte inferior do molde que consiste nas três peças imprensadas. Segure as lâminas comprimindo-as e, em seguida, remova os clipes de fichário com cuidado.

Coloque o molde na borda da bancada de forma que o lado do molde com o ponto azul fique voltado para cima. Coloque os dois polegares embaixo do acrílico e os primeiros dedos na parte superior em direção à borda interna do molde e empurre lenta e cuidadosamente para cima com os polegares contra o molde como se estivesse girando o espaçador do molde em torno de sua borda inferior. Aplique pressão constante, mas aumentando lentamente.

Uma quebra e uma bolha de ar devem aparecer ao longo de uma linha onde o vidro superior cobre o espaçador do molde. Depois de ver a linha de quebra inicial, continue empurrando para cima com os dois polegares e aplique pressão constante. O ágar deve começar a se soltar do vidro.

Continue a girar o molde para cima. Como o vidro vem completamente livre, agarre-o e retire-o completamente do molde. Em seguida, remova a outra peça do molde usando um movimento semelhante para levantar a peça sem mover o ágar.

Coloque as lâminas em uma caixa de ponta estéril com um pouco de água estéril de alta pureza no fundo. Feche a caixa e guarde a 4 graus Celsius durante a noite para uso no dia seguinte. Inicie este procedimento preparando as deformações em uma placa de 96 poços, conforme descrito no protocolo de texto.

Usando um leitor de placas para medir a densidade óptica a 600 nanômetros de cada cultura. Em seguida, use um protocolo de diluição automatizado para diluir as culturas na placa para uma densidade óptica de 600 nanômetros de aproximadamente 0,1. Uma vez que o programa de diluição é configurado, coloque placas, tubos e pontas de carga no convés do robô de manuseio de líquidos, conforme indicado pelo layout do convés.

Clique no botão play para executar o programa de diluição. Selecione o número correto de pontas de 50 microlitros e o número correto de pontas de 300 microlitros. Quando a diluição estiver concluída, remova a placa de diluição do robô e cultive a placa a 30 graus Celsius, mantendo a umidade para evitar que a placa seque por cinco a seis horas.

Cerca de uma a duas horas antes da incubação da placa de cultura estar completa, ligue as câmaras de incubação para o microscópio e deixe-as equilibrar a 30 graus Celsius. Diluir a cultura uma segunda vez até obter uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,01 a 0,02, usando o mesmo protocolo de diluição automatizado. Cobrir a placa de diluição com um selo metálico do congelador e sonicar num banho de gelo durante 30 segundos com a placa a flutuar em água gelada.

Rotule quatro placas de fundo plano de 96 poços como uma, duas, três e quatro. Transferir 150 microlitros de cada cultura sonicada da placa de diluição para as placas de fundo plano, seguindo este padrão. Poços A1 a D6 nos poços C4 a F9 da Placa Um.

Poços A7 a D12 nos poços C4 a F9 da Placa Dois. Poços E1 a H6 nos poços C4 a F9 da Placa Três. E os poços E7 a H12 nos poços C4 a F9 da Placa Quatro.

Para iniciar este procedimento, coloque a lâmina de agarose corretamente na câmara da lâmina. Em seguida, coloque as placas de fundo plano de 96 poços na mesa na ordem de seu quadrante. Placas Um, Dois, Três e Quatro da esquerda para a direita.

Disponha as pontas em quatro caixas de pontas vazias de modo que os 24 poços internos de cada caixa de ponta fiquem ocupados com pontas. Em uma quinta caixa, coloque uma ponta na posição C10 e pontas com a extremidade cortada nas posições A1, A12, H1 e H12. Essas quatro pontas cortadas fornecerão estabilidade para a braçadeira da placa da ponta.

Coloque o primeiro punção de ponta no local inicial do programa de detecção de controle do robô para fazer um furo na agarose a ser usado posteriormente para alinhar a coordenada de origem. Coloque a Placa Um no robô de manuseio de líquidos para localizar o primeiro quadrante. Remova a tampa e continue o programa de manchas.

Verifique se todos os pontos estão presentes. Esvazie as pontas usadas no recipiente de risco biológico E coloque novas pontas no robô. Aguarde cerca de 30 segundos para que as manchas sequem até cerca de um milímetro de diâmetro e continue o programa.

Troque a Placa Um pela Placa Dois e continue o programa de spotting. Quando todos os quatro quadrantes tiverem sido detectados e as manchas estiverem secas, recoloque a tampa da câmara deslizante e vire o aparelho. Coloque uma lâmina de vidro na parte superior da câmara da corrediça.

Primeiro carregue a câmara de lâminas no microscópio. A microscopia de lapso de tempo é realizada executando um script personalizado. Clique no obturador para abrir o obturador de luz transmitida e, em seguida, no botão de foco para iniciar a alta taxa de câmera.

Clique em Go Origin"e mova o palco para encontrar a marca de origem que foi perfurada no ágar e, em seguida, mova ligeiramente para a direita para focar nas células localizadas na área E7. Volte para o punção de origem e centralize-o no campo de visão. Defina a origem para este valor pressionando o botão Definir". Vá para a posição H18 e foque usando o parafuso sextavado mais próximo desse local.

Em seguida, mova para a posição L7 e foque usando o parafuso sextavado mais próximo desse local. Por fim, mova para a posição E7 e foque usando o parafuso sextavado mais próximo desse local. Verifique o foco no centro e nas bordas nos pontos E12, H12 e L12 ajuste a faixa de foco automático se os valores z do foco, conforme indicado pelo valor z, forem maiores que mais ou menos o alcance do foco automático.

Pressione o botão Reset" e, em seguida, pressione ODELAY. Escolha o diretório para salvar os dados. O microscópio coletará dados por 48 horas ou até que o programa seja fechado.

Essas imagens representativas de lapso de tempo mostram células de levedura crescendo em meio sólido como zero hora, três horas, seis horas e nove horas após a mancha. Aqui é mostrado um conjunto de dados representativo comparando duas cepas de levedura após o processamento das imagens de lapso de tempo. Os tempos de duplicação relativamente uniformes refletem o slide de agarose bem preparado, no entanto, os tempos de atraso variam consideravelmente devido às configurações de foco automático que não são ideais.

Um conjunto de dados mais consistente é mostrado aqui, no qual todos os tempos de duplicação parecem se sobrepor bem e os tempos de atraso parecem ser consistentes. Uma vez dominado, a configuração do ODELAY pode ser feita em três a quatro horas, se for executada corretamente. As etapas mais críticas para medições ODELAY repetíveis são preparar o meio de forma consistente e evitar a deformação mecânica do meio ao separar as lâminas.

ODELAY é um ensaio muito sensível. Por exemplo, ele pode observar defeitos de crescimento em cepas de levedura sensíveis à temperatura à temperatura ambiente, onde os ensaios baseados em pontos comumente usados requerem a cultura de levedura a 37 graus centígrados para revelar um defeito de crescimento. Embora o ODELAY tenha sido desenvolvido em leveduras, o método é aplicável a qualquer organismo formador de colônias, incluindo patógenos, para explorar uma ampla gama de condições ambientais e genéticas para entender o comportamento dos microrganismos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o ODELAY para medir fenótipos de crescimento de microrganismos unicelulares formando colônias em meio sólido. Não se esqueça de que trabalhar com microrganismos pode ser perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual adequados aos organismos estudados devem sempre ser tomadas.