Name: ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda o método ODELAY para quantificar fenótipos de crescimento em leveduras usando microscopia de lapso temporal. Esta técnica permite observar e medir a heterogeneidade populacional em células geneticamente idênticas.

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Os autores reconhecem o apoio a este trabalho através das subvenções U54 RR022220 e P50 GM076547 à JDA dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA. FDM é um colega pós-doutorado dos Institutos canadenses de pesquisa em saúde. Também agradecemos o apoio do Centro Luxemburgo para Sistemas de Biomedicina e da Universidade do Luxemburgo.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O teste ODELAY tem vários pontos críticos para garantir medições fenotípicas reprodutíveis e confiáveis. O primeiro ponto crítico é a preparação consistente das culturas de fermento. Deve-se ter cuidado para colher as células de levedura do crescimento logarítmico. Se as culturas estiverem saturadas, então a sua heterogeneidade populacional aumentará, o que pode ofuscar a heterogeneidade causada por fatores genéticos ou ambientais ( por exemplo, fontes de carbono) 11 . O segundo ponto crítico é a preparação consistente da mídia. Em geral, um grande volume de solução de mídia de estoque 10X deve ser gerado e, em seguida, usado ao longo do tempo para minimizar os efeitos do lote. Formular meios de comunicação, em peso, sempre que possível, ajuda a melhorar a consistência do meio ao longo do tempo, assegurando a densidade de ágar e o teor global de água da agarose podem ser monitorados de perto. O terceiro ponto crítico envolve minimizar ou eliminar qualquer deformação mecânica da agarose meDia. A deformação mecânica da mídia geralmente ocorrerá durante a separação da agarose das lâminas de vidro. Tal como acontece com muitas técnicas de laboratório, a prática é necessária para dominar esta etapa. A variação no tempo de atraso, conforme ilustrado na Figura 4 , está frequentemente relacionada a um dos três fatores: deformação mecânica do meio de agarose, variação na espessura de ágar moldada ou fonte de luz instável. Se o meio de agarose variar em altura Z em toda a matriz manchada, a variação de altura pode sobrecarregar o alcance da rotina de focagem automática, fazendo com que as imagens iniciais estejam ligeiramente fora de foco. Por esse motivo, verifique a altura do foco em vários pontos no centro e ao longo das bordas da matriz manchada para garantir que a rotina de focagem automática tenha alcance Z suficiente para encontrar o foco. Se necessário, use o painel Autofocus para aumentar o alcance de foco e aumentar o número de etapas de focagem. Uma terceira condição possívelO íon que pode levar a um foco fraco é uma fonte de luz instável ou cintilante, que pode interromper a pontuação de foco calculada para uma altura Z específica. As lâmpadas de halogéneo de tungstênio tendem a cintilar bem antes que as lâmpadas se queimem. O efeito do foco fraco é observado em um exemplo em que as curvas de crescimento mergulham entre o primeiro e o segundo tempo ( Figura 5 A ), enquanto o ponto adjacente não tem o mesmo mergulho ( Figura 5 B ). Neste caso, a má condição de foco foi atenuada pela substituição da fonte de luz de halogênio de tungstênio. Na prática, os autores descobriram que, para reduzir a cintilação de 100W de lâmpadas halógenas de tungstênio, as lâmpadas precisam ser substituídas a cada 500 h ou aproximadamente a cada 2 meses quando os microscópios estão em uso intenso. Para evitar problemas de focagem fracos de uma lâmpada cintilante, substitua a fonte de luz halógena de tungstênio frequentemente ou substitua a lâmpada halógena por uma fonte de luz de diodo. AO exemplo de um conjunto de dados que mostra pouca variação nos tempos de duplicação bem como tempos de atraso mais uniformes é mostrado na Figura 6 . Este conjunto de dados foi tomado com um iluminador de diodo que fornece uma iluminação mais estável ao longo do tempo enquanto executa o autofoco. Embora muitos dos pontos mencionados aqui para otimizar a preparação da mídia possam parecer óbvios, na literatura as telas de maior escala não se replicam bem umas com as outras 8 , 11 . Portanto, descrevemos cuidadosamente a preparação de culturas e meios de agarose para que possam ser geradas telas fenotípicas mais reprodutíveis. O ensaio ODELAY está atualmente limitado em termos de produção quando comparado aos ensaios baseados em fixação, tais como matrizes genéticas sintéticas ou o ensaio Scan-O-Matic. Embora esses métodos aumentem o número de cepas que são medidas, eles não possuem capacidade para resolver células individuais.Nd, portanto, não pode medir a heterogeneidade da população que observamos dentro das cepas de fermento clonal. A origem dessa heterogeneidade populacional não é atualmente compreendida, mas a fusão de tecnologia e computação, como demonstrado aqui, oferece uma oportunidade para abordar objetivamente os mecanismos celulares subjacentes 12 . Os autores desejam notar que o ODELAY atualmente é otimizado apenas para uma marca específica de microscópio e tipo de corpo. Modificar o ODELAY para outros sistemas de microscópio é direto, mas exigirá conhecimento da API 13 de código aberto. No entanto, tanto a API como os scripts ODELAY são escritos para serem facilmente adaptados a diferentes sistemas e ensaios experimentais. Embora o ODELAY tenha sido originalmente desenvolvido para fermento, conseguimos utilizá-lo sem modificações para observar o crescimento de Mycobacterium smegmatis . A observação dos outros microrganismos formadores de colônias éPossível com alterações no código fonte fornecido 11 . Em geral, a ODELAY é uma ferramenta poderosa e flexível para comparar microorganismos cultivados sob diferentes condições ambientais e perturbações genéticas.

Os fenótipos de crescimento de microorganismos são um forte indicador de sua aptidão genética subjacente a uma determinada condição ambiental. O crescimento é classicamente segregado em 3 regimes de crescimento diferentes: fase retardada, fase logarítmica e crescimento da fase estacionária 1 . Cada fase de crescimento pode revelar diferentes aspectos da aptidão que dependem de várias condições ambientais e genéticas. Por exemplo, o tempo de atraso ou o período de tempo que um organismo gasta em fase de atraso antes do início do crescimento exponencial, pode ser indicativo da capacidade de um organismo responder a condições ambientais alteradas 2 . O tempo de duplicação durante o crescimento da fase logarítmica, a métrica mais comum da aptidão celular, revela a eficiência geral da capacidade de divisão de um organismo ao metabolizar e utilizar materiais ambientais para replicação. A fase estacionária, onde o crescimento após a fase logarítmica é rapidamente reduzida, é outro indicador de aptidão, que é regularUsado como um ponto final de crescimento em testes de crescimento de leveduras baseados em manchas. Vários ensaios de crescimento de levedura estão atualmente disponíveis e considerados métodos padrão para avaliação de fenótipos de crescimento em leveduras 3 , 4 , 5 . Estes ensaios baseiam-se principalmente em métodos de crescimento de fermento quer em meios sólidos quer em meios líquidos. Em meios sólidos, os ensaios de fixação de colônia transferem um pequeno número de células em agar sólido com um pino e as células de fermento podem crescer por um período de tempo definido. As colônias são então formadas e os seus tamanhos são comparados em um terminal terminal 6 . Esses ensaios de fixação de colônias provaram ser robustos e escaláveis ​​para gerar telas genômicas. Mais recentemente, imagens periódicas usando escaneadores de cama plana e câmeras de reflexão de lente única (SLR) foram incorporadas nestes ensaios para registrar o crescimento de colônias ao longo do tempo 7 , 8, 9 . No entanto, a resolução desses dispositivos os impede de detectar células únicas e, portanto, esses ensaios de fixação de colônia não observam diretamente o tempo de latência e não podem observar variações entre as células individuais que crescem em colônias. Os ensaios de crescimento baseados em líquidos também foram utilizados para realizar telas 3 do genoma. O acoplamento de um teste de crescimento líquido com microscopia em lapso de tempo revelou heterogeneidade populacional no tempo de duplicação de células individuais geneticamente idênticas, o que oferece uma perspectiva importante para a compreensão da regulação genética e da adaptação ambiental. No entanto, este ensaio não mede outros aspectos do crescimento, como tempo de atraso e capacidade de carga 10 . Aqui, apresentamos um método para caracterizar as três fases de crescimento de microorganismos formadores de colônias em meio sólido utilizando um ensaio que denominamos ODELAY 11 . ODELAY é composto por utiliMicroscópio de lapso de tempo de alto rendimento zing para registrar imagens de células únicas que crescem em colônias em mídia sólida. Esta população de células individuais que crescem em colônias revela a heterogeneidade da população subjacente, que não é detectada por outras medidas menos sensíveis, como a pontuação terminal final. Nós demonstramos o método em levedura, mas ODELAY pode ser aplicado a qualquer organismo que mostre contraste em microscopia de campo brilhante.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Força do Gel (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura Peptona (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Mistura Completa de Suplement (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de Levedura BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de levedura BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 caixa</td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 15 mL Corning</td><td></td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 polegadas Lâminas de 1,0 mm de espessura 1/2 bruto</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços fundo plano</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robô de manuseio de líquidos 353072 Hydra</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handling Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL pontas DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Leitor de placas</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscópio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetiva Leica 10X/0.3NA Câmera</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB com caixa de ferramentas de processamento de imagem</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY Microscope Control (scripts MATLAB e GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY para scripts e software Matlab</td></tr><tr><td>Câmara de microscópio</td><td></td><td></td><td>ODELAY www.aitchisonlab.com\ODELAY para desenhos mecânicos</td></tr><tr>Moldes <td></td><td></td> de<td>ágar ODELAY</td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY para desenhos de moldes</td></tr></tbody></table>

odelay: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Os fenótipos de crescimento de microorganismos são um forte indicador de sua condição genética subjacente e podem ser segregados em 3 regimes de crescimento: fase de desfase, fase logarítmica e fase estacionária. Cada fase de crescimento pode revelar diferentes aspectos da aptidão que estão relacionados a várias condições ambientais e genéticas. Medições de alta resolução e quantitativas de todas as 3 fases de crescimento geralmente são difíceis de obter. Aqui, apresentamos um método detalhado para caracterizar todas as 3 fases de crescimento em meios sólidos usando um ensaio chamado Avaliação de Duplicação de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifica fenótipos de crescimento de células individuais crescendo em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo. Este método pode observar diretamente a heterogeneidade da população com cada parâmetro de crescimento em células geneticamente idênticas que crescem em colônias. Essa heterogeneidade de população oferece uma perspectiva única para a compreensão da regulação genética e epigenética e respostas aPerturbações genéticas e ambientais. Embora o método ODELAY seja demonstrado com levedura, ele pode ser utilizado em qualquer microrganismo formador de colônias que seja visível por microscopia de campo brilhante.

<html> As imagens de exemplo de crescimento de fermento em microscopia de lapso de tempo são mostradas na Figura 3B . Após o processamento das imagens de lapso de tempo, um conjunto de dados representativo que compara as tensões de levedura BY4741 e BY4742 é mostrado na Figura 4 . Neste conjunto de dados de exemplo, há muito pouca variação no tempo de duplicação entre diferentes posições na placa. Se o meio de agarose for bem preparado, então um desvio óbvio em tempo de duplicação e tempo de atraso seria aparente nas posições de mancha que coincidem com a região deformada do gel de agarose. Enquanto os tempos de duplicação parecem ser relativamente uniformes, este exemplo mostra variações nas medidas do tempo de atraso. Um conjunto de dados mais consistente é mostrado na Figura 6 . Neste conjunto de dados, o tempo de atraso e o tempo de duplicação são uniformes. Arquivos / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Montagem do molde Agar. Os componentes do molde de ágar são mostrados em ( A ). Monte a base como mostrado em ( B ) e, em seguida, prenda a base com pequenos grampos de pasta. Coloque os pedaços verticais mais longos na cavidade da base ( C ) e acampe as lâminas para o molde conforme mostrado em ( D ). Uma vista lateral mostrando o ângulo do molde e a orientação do molde kerf necessário para a separação consistente do ágar da lâmina de vidro ( E ). Observe a posição do polegar e dos dedos da frente, bem como a linha reta do ágar que se separa do slide ( F ) e observe a seta horizontal. A linha de separação deve se mover uniformemente na direção das setas verticais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Método de Sonicação e Spotting. Sonicate a placa na água gelada e use um suporte de balde centrífugo para ajudar a suportar a placa ( A ). Coloque as placas dos passos 3.8.1 para a mancha na placa de agarose ( B ). Além disso, organize as dicas para que a caixa de ponta mais à esquerda tenha uma dica na posição C10 e, em seguida, outras quatro pontas com as extremidades cortadas para que não colam o suporte da placa ( C ). Coloque as dicas restantes em quatro caixas para que as posições internas de 24 pontas estejam ocupadas ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interface gráfica de usuário ODELAY. Uma captura de tela da Interface Gráfica do Usuário para &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Esta interface permite o monitoramento da câmera e para ajustar as configurações de iluminação do microscópio para modos de campo epifluorescente e brilhante. As setas vermelhas apontam para os botões Foco e Transmissão que ativam a câmera para adquirir imagens rapidamente e abre o obturador leve transmitido, respectivamente. As setas azuis são usadas para mover o palco para a origem e depois definir a origem com o botão &quot;Go Origin&quot; e o botão &quot;Set&quot;. As setas verdes apontam para &quot;Redefinir&quot; e &quot;ODELAY !!!&quot; Botões que reiniciam os modos de imagem ODELAY nas condições atuais e iniciam a coleta de imagens ODELAY. Imagens de lapso de tempo de crescimento de fermento em meio sólido a 0, 3, 6 e 9 h após a mancha ( B ). Uma captura de tela da interface gráfica do usuário para &quot;ODELAY_IPT.m&quot; ou th<html> E ODELAY Ferramenta de processamento de imagem ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Exemplo de saída ODELAY. Este conjunto de dados compara as tensões BY4741 e BY4742 na mídia YPD. Esta figura é um exemplo de um slide de agarose bem preparado; No entanto, as configurações de focagem automática não são otimizadas. Os dados apresentados em cada coluna, da esquerda para a direita, são: a capacidade de carga no Log 2 da área da colônia; Tempo de duplicação, dado em min; E tempo de atraso, dado em min. Neste exemplo, o tempo de duplicação de todos os pontos na corrediça de ágar se alinha bem com uma pequena quantidade de tempo de duplicação aumentado em direção à coluna. No entanto, os tempos de atraso variam consideravelmente neste conjunto de dados._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Exemplos de curva de crescimento. Este exemplo demonstra como o foco inicial fraco pode causar o tempo de atraso estimado (t lag ) para aumentar ( A ), enquanto a posição adjacente mostra um tempo de latência menor ( B ). T d é o tempo de duplicação em min, e t lag é o tempo de atraso em min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Exemplo de experiência de teste bem executada. Um eXample da estirpe BY4742 testada depois de substituir uma lâmpada de halogéneo de tungstênio por um iluminador de diodo e garantir que o foco automático esteja configurado corretamente. Todos os tempos de duplicação parecem se sobrepor bem e os tempos de atraso parecem ser consistentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

Apresentamos um método para quantificar fenótipos de crescimento de células de levedura individuais à medida que crescem em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo denominada, avaliação de dobramento de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). A heterogeneidade da população de células geneticamente idênticas que crescem em colônias pode ser observada e quantificada diretamente.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

O objetivo geral do ODELAY é medir fenótipos de crescimento de células individuais que se desenvolvem em colônias de forma de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em microbiologia, genética e biologia de sistemas, como os efeitos de perturbações genéticas e interações de fármacos sobre os fenótipos de crescimento de qualquer microrganismo formador de colônias. A principal vantagem do ODELAY é que ele permite ao pesquisador observar e quantificar diretamente a heterogeneidade populacional entre um grande número de indivíduos.Antes de montar o molde de ágar, limpe os moldes acrílicos com etanol 70% e seque-os usando ar forçado. Existem três peças inferiores e duas peças verticais. Para iniciar a montagem do molde de ágar, pegue as três peças inferiores e monte-as de modo que as duas peças idênticas encaixem a terceira peça no meio.Use dois clipes de papel pequenos para prender as peças da base em cada lado. Coloque os suportes verticais na fôrma, certificando-se de que a curva do laser esteja corretamente posicionada. Coloque uma lâmina de vidro limpa e seca sobre a fôrma e segure-a no lugar enquanto coloca uma segunda lâmina de vidro no outro lado.Prenda o conjunto com um clipe de papel grande. Prenda ambos os lâminas com clipes de papel maiores, garantindo que cada clipe superior esteja em contato com o lâmina de vidro, sobrepondo o acrílico. Antes de preencher o molde montado com ágar fundido, certifique-se de que as bordas estejam seladas pipetando cerca de 70 microlitros de meio de ágar fundido ao longo do lado interno do molde.Encha o molde sem aprisionar bolhas de ar, pipetando lentamente o ágar fundido ao longo da borda do molde. Após preencher o molde, deixe esfriar a aproximadamente 23 graus Celsius em temperatura ambiente por 40 a 60 minutos. O próximo passo é a separação do molde.Inicie removendo o clipe de papel inferior. Em seguida, remova a parte inferior do molde, que consiste nas três peças sobrepostas. Segure as lâminas comprimindo-as e, depois, remova os clipes de papel cuidadosamente.Coloque o molde na borda da bancada de forma que o lado do molde com o ponto azul fique voltado para cima. Coloque os dois polegares por baixo do acrílico e os primeiros dedos por cima, em direção à borda interna do molde, e empurre lentamente e com cuidado para cima com os polegares contra o molde, como se estivesse girando o espaçador do molde em torno de sua borda inferior. Aplique pressão constante, mas gradualmente crescente.Deve surgir uma rachadura e uma bolha de ar ao longo da linha onde o vidro superior cobre o espaçador do molde. Após observar a linha inicial de ruptura, continue empurrando para cima com os dois polegares e aplique pressão constante. O ágar deve começar a se desprender do vidro.Continue a girar o molde para cima. Quando o vidro se soltar completamente, segure-o e remova-o totalmente do molde. Em seguida, remova a outra peça do molde usando um movimento semelhante para levantar a peça sem mover o ágar.Coloque as lâminas em uma caixa estéril para ponteiras com um pouco de água estéril de alta pureza no fundo. Feche a caixa e armazene a 4 graus Celsius durante a noite para uso no dia seguinte. Inicie este procedimento preparando as cepas em uma placa de 96 poços conforme descrito no protocolo textual.Utilizando um leitor de placas para medir a densidade óptica a 600 nanômetros de cada cultura. Em seguida, utilize um protocolo automatizado de diluição para diluir as culturas na placa até uma densidade óptica a 600 nanômetros de aproximadamente 0,1. Uma vez que o programa de diluição esteja configurado, carregue as placas, tubos e ponteiras no deck do robô de manipulação líquida conforme indicado pelo layout do deck.Clique no botão de reprodução para executar o programa de diluição. Selecione o número correto de ponteiras de 50 microlitros e o número correto de ponteiras de 300 microlitros. Quando a diluição estiver concluída, remova a placa de diluição do robô e cultive a placa a 30 graus Celsius, mantendo a umidade para evitar que a placa seque por cinco a seis horas.Aproximadamente uma a duas horas antes de o cultivo em placa terminar a incubação, ligue as câmaras de incubação do microscópio e deixe-as equilibrar a 30 graus Celsius. Dilua o cultivo uma segunda vez até uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,01 a 0,02, utilizando o mesmo protocolo automatizado de diluição. Cubra a placa de diluição com um selo metálico para freezer e sonique em banho de gelo por 30 segundos, com a placa flutuando em água gelada.Rotule quatro placas de 96 poços com fundo plano como um, dois, três e quatro. Transfira 150 microlitros de cada cultura sonicada da placa de diluição para as placas de fundo plano seguindo este padrão: poços A1 a D6 para os poços C4 a F9 da Placa Um.Poços A7 a D12 para os poços C4 a F9 da Placa Dois. Poços E1 a H6 para os poços C4 a F9 da Placa Três. E poços E7 a H12 para os poços C4 a F9 da Placa Quatro.Para iniciar este procedimento, posicione corretamente a lâmina de agarose na câmara para lâminas. Em seguida, coloque as placas de 96 poços com fundo plano sobre a mesa na ordem de seus quadrantes. Placas Um, Dois, Três e Quatro da esquerda para a direita.Organize as pontas em quatro caixas de pontas vazias de modo que os 24 poços internos de cada caixa sejam ocupados com pontas. Em uma quinta caixa, coloque uma ponta na posição C10 e pontas com a extremidade cortada nas posições A1, A12, H1 e H12. Essas quatro pontas cortadas fornecerão estabilidade para a braçadeira da placa de pontas.Coloque a primeira ponta do furador no local inicial do programa de controle de marcação do robô para fazer um furo no agarose, que será usado posteriormente para alinhar a coordenada de origem. Coloque a Placa Um no robô de manipulação líquida para marcar o primeiro quadrante. Remova a tampa e continue o programa de marcação.Verifique se todos os pontos estão presentes. Esvazie as ponteiras usadas no recipiente de biohazard e coloque ponteiras novas no robô. Aguarde cerca de 30 segundos para que os pontos sequem até um diâmetro de aproximadamente um milímetro e, em seguida, continue o programa.Substitua a Placa Um pela Placa Dois e continue o programa de aplicação. Quando os quatro quadrantes tiverem sido aplicados e as manchas estiverem secas, recoloque a tampa da câmara de lâminas e vire o aparelho. Coloque uma lâmina de vidro no lado superior da câmara de lâminas.Primeiro, carregue a câmara de lâmina no microscópio. A microscopia com intervalo de tempo é realizada executando um script personalizado. Clique no obturador para abrir o obturador de luz transmitida e, em seguida, no botão de foco para iniciar a alta taxa de câmera.Clique em Ir para Origem" e mova o estágio para encontrar a marca de origem que foi perfurada no ágar, depois mova-se ligeiramente para a direita para focar nas células localizadas na área E7. Retorne ao furo de origem e centralize-o no campo de visão. Defina a origem para este valor pressionando o botão Definir". Mova-se para a posição H18 e foque utilizando o parafuso sextavado mais próximo dessa localização.Em seguida, mova para a posição L7 e foque utilizando o parafuso sextavado mais próximo dessa localização. Finalmente, mova para a posição E7 e foque utilizando o parafuso sextavado mais próximo dessa localização. Verifique o foco no centro e nas bordas nos pontos E12, H12 e L12; ajuste o intervalo de foco automático se os valores de foco em z, indicados pelo valor de z, forem maiores que mais ou menos o intervalo de foco automático.Pressione o botão "Reset" e depois pressione ODELAY. Escolha o diretório para salvar os dados. O microscópio coletará dados durante 48 horas ou até que o programa seja encerrado.Essas imagens representativas de lapso de tempo mostram células de levedura crescendo em meio sólido nos tempos zero hora, três horas, seis horas e nove horas após a inoculação. É apresentado aqui um conjunto de dados representativo comparando duas linhagens de levedura após o processamento das imagens de lapso de tempo. Os tempos de duplicação relativamente uniformes refletem o preparo adequado da lâmina de agarose, porém os tempos de latência variam consideravelmente devido a configurações de foco automático que não são ideais.Um conjunto de dados mais consistente é mostrado aqui, no qual todos os tempos de duplicação parecem sobrepor-se bem e os tempos de latência parecem ser consistentes. Uma vez dominada, a configuração do ODELAY pode ser realizada em três a quatro horas, se for feita corretamente. Os passos mais críticos para medições repetíveis do ODELAY são preparar o meio de forma consistente e evitar deformar mecanicamente o meio ao separar as lâminas.ODELAY é um ensaio muito sensível. Por exemplo, ele pode observar defeitos de crescimento em cepas de levedura sensíveis à temperatura em temperatura ambiente, onde ensaios baseados em pontos comumente utilizados exigem o cultivo da levedura a 37 graus Celsius para revelar um defeito de crescimento. Embora ODELAY tenha sido desenvolvido em levedura, o método é aplicável a qualquer organismo formador de colônias, incluindo patógenos, para explorar uma ampla gama de condições ambientais e genéticas e compreender o comportamento de microrganismos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ODELAY para medir fenótipos de crescimento de microrganismos unicelulares formando colônias em meio sólido. Não se esqueça de que trabalhar com microrganismos pode ser perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados para os organismos estudados, devem sempre ser tomadas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Envelhecimento cronológico em levedura refere-se à perda de viabilidade celular associada ao tempo na fase estacionária. Aqui nós descrevemos um método de alto rendimento para determinar quantitativamente fermento esperança de vida cronológica.

Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

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Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

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Aprenda o método ODELAY para quantificar fenótipos de crescimento em leveduras usando microscopia de lapso temporal. Esta técnica permite observar e medir a heterogeneidade populacional em células geneticamente idênticas.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

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