ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

O objetivo geral do ODELAY é medir fenótipos de crescimento de células individuais que se desenvolvem em colônias de forma de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em microbiologia, genética e biologia de sistemas, como os efeitos de perturbações genéticas e interações de fármacos sobre os fenótipos de crescimento de qualquer microrganismo formador de colônias. A principal vantagem do ODELAY é que ele permite ao pesquisador observar e quantificar diretamente a heterogeneidade populacional entre um grande número de indivíduos.

Antes de montar o molde de ágar, limpe os moldes acrílicos com etanol 70% e seque-os usando ar forçado. Existem três peças inferiores e duas peças verticais. Para iniciar a montagem do molde de ágar, pegue as três peças inferiores e monte-as de modo que as duas peças idênticas encaixem a terceira peça no meio.

Use dois clipes de papel pequenos para prender as peças da base em cada lado. Coloque os suportes verticais na fôrma, certificando-se de que a curva do laser esteja corretamente posicionada. Coloque uma lâmina de vidro limpa e seca sobre a fôrma e segure-a no lugar enquanto coloca uma segunda lâmina de vidro no outro lado.

Prenda o conjunto com um clipe de papel grande. Prenda ambos os lâminas com clipes de papel maiores, garantindo que cada clipe superior esteja em contato com o lâmina de vidro, sobrepondo o acrílico. Antes de preencher o molde montado com ágar fundido, certifique-se de que as bordas estejam seladas pipetando cerca de 70 microlitros de meio de ágar fundido ao longo do lado interno do molde.

Encha o molde sem aprisionar bolhas de ar, pipetando lentamente o ágar fundido ao longo da borda do molde. Após preencher o molde, deixe esfriar a aproximadamente 23 graus Celsius em temperatura ambiente por 40 a 60 minutos. O próximo passo é a separação do molde.

Inicie removendo o clipe de papel inferior. Em seguida, remova a parte inferior do molde, que consiste nas três peças sobrepostas. Segure as lâminas comprimindo-as e, depois, remova os clipes de papel cuidadosamente.

Coloque o molde na borda da bancada de forma que o lado do molde com o ponto azul fique voltado para cima. Coloque os dois polegares por baixo do acrílico e os primeiros dedos por cima, em direção à borda interna do molde, e empurre lentamente e com cuidado para cima com os polegares contra o molde, como se estivesse girando o espaçador do molde em torno de sua borda inferior. Aplique pressão constante, mas gradualmente crescente.

Deve surgir uma rachadura e uma bolha de ar ao longo da linha onde o vidro superior cobre o espaçador do molde. Após observar a linha inicial de ruptura, continue empurrando para cima com os dois polegares e aplique pressão constante. O ágar deve começar a se desprender do vidro.

Continue a girar o molde para cima. Quando o vidro se soltar completamente, segure-o e remova-o totalmente do molde. Em seguida, remova a outra peça do molde usando um movimento semelhante para levantar a peça sem mover o ágar.

Coloque as lâminas em uma caixa estéril para ponteiras com um pouco de água estéril de alta pureza no fundo. Feche a caixa e armazene a 4 graus Celsius durante a noite para uso no dia seguinte. Inicie este procedimento preparando as cepas em uma placa de 96 poços conforme descrito no protocolo textual.

Utilizando um leitor de placas para medir a densidade óptica a 600 nanômetros de cada cultura. Em seguida, utilize um protocolo automatizado de diluição para diluir as culturas na placa até uma densidade óptica a 600 nanômetros de aproximadamente 0,1. Uma vez que o programa de diluição esteja configurado, carregue as placas, tubos e ponteiras no deck do robô de manipulação líquida conforme indicado pelo layout do deck.

Clique no botão de reprodução para executar o programa de diluição. Selecione o número correto de ponteiras de 50 microlitros e o número correto de ponteiras de 300 microlitros. Quando a diluição estiver concluída, remova a placa de diluição do robô e cultive a placa a 30 graus Celsius, mantendo a umidade para evitar que a placa seque por cinco a seis horas.

Aproximadamente uma a duas horas antes de o cultivo em placa terminar a incubação, ligue as câmaras de incubação do microscópio e deixe-as equilibrar a 30 graus Celsius. Dilua o cultivo uma segunda vez até uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,01 a 0,02, utilizando o mesmo protocolo automatizado de diluição. Cubra a placa de diluição com um selo metálico para freezer e sonique em banho de gelo por 30 segundos, com a placa flutuando em água gelada.

Rotule quatro placas de 96 poços com fundo plano como um, dois, três e quatro. Transfira 150 microlitros de cada cultura sonicada da placa de diluição para as placas de fundo plano seguindo este padrão: poços A1 a D6 para os poços C4 a F9 da Placa Um.

Poços A7 a D12 para os poços C4 a F9 da Placa Dois. Poços E1 a H6 para os poços C4 a F9 da Placa Três. E poços E7 a H12 para os poços C4 a F9 da Placa Quatro.

Para iniciar este procedimento, posicione corretamente a lâmina de agarose na câmara para lâminas. Em seguida, coloque as placas de 96 poços com fundo plano sobre a mesa na ordem de seus quadrantes. Placas Um, Dois, Três e Quatro da esquerda para a direita.

Organize as pontas em quatro caixas de pontas vazias de modo que os 24 poços internos de cada caixa sejam ocupados com pontas. Em uma quinta caixa, coloque uma ponta na posição C10 e pontas com a extremidade cortada nas posições A1, A12, H1 e H12. Essas quatro pontas cortadas fornecerão estabilidade para a braçadeira da placa de pontas.

Coloque a primeira ponta do furador no local inicial do programa de controle de marcação do robô para fazer um furo no agarose, que será usado posteriormente para alinhar a coordenada de origem. Coloque a Placa Um no robô de manipulação líquida para marcar o primeiro quadrante. Remova a tampa e continue o programa de marcação.

Verifique se todos os pontos estão presentes. Esvazie as ponteiras usadas no recipiente de biohazard e coloque ponteiras novas no robô. Aguarde cerca de 30 segundos para que os pontos sequem até um diâmetro de aproximadamente um milímetro e, em seguida, continue o programa.

Substitua a Placa Um pela Placa Dois e continue o programa de aplicação. Quando os quatro quadrantes tiverem sido aplicados e as manchas estiverem secas, recoloque a tampa da câmara de lâminas e vire o aparelho. Coloque uma lâmina de vidro no lado superior da câmara de lâminas.

Primeiro, carregue a câmara de lâmina no microscópio. A microscopia com intervalo de tempo é realizada executando um script personalizado. Clique no obturador para abrir o obturador de luz transmitida e, em seguida, no botão de foco para iniciar a alta taxa de câmera.

Clique em Ir para Origem" e mova o estágio para encontrar a marca de origem que foi perfurada no ágar, depois mova-se ligeiramente para a direita para focar nas células localizadas na área E7. Retorne ao furo de origem e centralize-o no campo de visão. Defina a origem para este valor pressionando o botão Definir". Mova-se para a posição H18 e foque utilizando o parafuso sextavado mais próximo dessa localização.

Em seguida, mova para a posição L7 e foque utilizando o parafuso sextavado mais próximo dessa localização. Finalmente, mova para a posição E7 e foque utilizando o parafuso sextavado mais próximo dessa localização. Verifique o foco no centro e nas bordas nos pontos E12, H12 e L12; ajuste o intervalo de foco automático se os valores de foco em z, indicados pelo valor de z, forem maiores que mais ou menos o intervalo de foco automático.

Pressione o botão "Reset" e depois pressione ODELAY. Escolha o diretório para salvar os dados. O microscópio coletará dados durante 48 horas ou até que o programa seja encerrado.

Essas imagens representativas de lapso de tempo mostram células de levedura crescendo em meio sólido nos tempos zero hora, três horas, seis horas e nove horas após a inoculação. É apresentado aqui um conjunto de dados representativo comparando duas linhagens de levedura após o processamento das imagens de lapso de tempo. Os tempos de duplicação relativamente uniformes refletem o preparo adequado da lâmina de agarose, porém os tempos de latência variam consideravelmente devido a configurações de foco automático que não são ideais.

Um conjunto de dados mais consistente é mostrado aqui, no qual todos os tempos de duplicação parecem sobrepor-se bem e os tempos de latência parecem ser consistentes. Uma vez dominada, a configuração do ODELAY pode ser realizada em três a quatro horas, se for feita corretamente. Os passos mais críticos para medições repetíveis do ODELAY são preparar o meio de forma consistente e evitar deformar mecanicamente o meio ao separar as lâminas.

ODELAY é um ensaio muito sensível. Por exemplo, ele pode observar defeitos de crescimento em cepas de levedura sensíveis à temperatura em temperatura ambiente, onde ensaios baseados em pontos comumente utilizados exigem o cultivo da levedura a 37 graus Celsius para revelar um defeito de crescimento. Embora ODELAY tenha sido desenvolvido em levedura, o método é aplicável a qualquer organismo formador de colônias, incluindo patógenos, para explorar uma ampla gama de condições ambientais e genéticas e compreender o comportamento de microrganismos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ODELAY para medir fenótipos de crescimento de microrganismos unicelulares formando colônias em meio sólido. Não se esqueça de que trabalhar com microrganismos pode ser perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados para os organismos estudados, devem sempre ser tomadas.