Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica
17 de janeiro de 2020
Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.
Nosso método é significativo, pois permite que o bioquímico médio determine rapidamente se amostras isoladas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada estão contaminadas com metais de transição. A principal vantagem é a facilidade pela qual o ensaio pode ser realizado. O ensaio usa instrumentação e técnicas comuns à maioria dos laboratórios de bioquímica, e pode ser implementado de forma fácil e rápida.
Enquanto neste artigo aplicamos este método para amostras isoladas com uma coluna níquel-NTA, o método pode ser usado com qualquer outra resina de afinidade metálica. Primeira vez que os usuários devem experimentar este método com uma solução de níquel estoque de concentração conhecida. Isso irá familiarizá-los com o fluxo de trabalho, cores de amostra e resinas mostradas em alterações espectrais.
Demonstrando o procedimento será Cole Swain, um técnico do meu laboratório. Para começar, ligue e aqueça o espectrômetro UV-Vis. Determine as frações de cromatografia a serem avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis com absorvção óptica a 280 nanômetros para quantificar a proteína.
Obtenha tampão amostral de 10 a 100 mililitros com um PH entre 7 e 12, como Tris, HEPES, MOPS e tampão fosfato. Prepare uma solução de 12% de peso por volume de dispersão HNB no buffer de amostra usando 120 miligramas de reagente HNB para cada mililitro de solução de estoque preparada. Defina o espectótmetro para coletar dados em 647 nanômetros.
Use uma cuvette de quartzo preenchida com o tampão de amostra para passar o espaço espectotúmetro. Prepare uma solução de controle em uma cuvette contendo 50 microliters de estoque HNB por mililitro de volume total de ensaios. Deixe o controle incubar por um mínimo de três minutos em temperatura ambiente.
Meça e regisse a absorvância em 647 nanômetros para a amostra de controle. Prepare as amostras de ensaio misturando 150 microliters de estoque HNB com 2850 microliters de frações proteicas adequadamente diluídas com o tampão amostral. Deixe a amostra incubar por um mínimo de três minutos em temperatura ambiente.
Repita o registro de espectro para que cada fração seja medida. No caso de diluição insuficiente, toda a banda espectral a 647 nanômetros se foi. Embora com diluição muito forte, a amostra é indissistível do controle.
Para determinar a concentração de metal em cada amostra, primeiro encontre a diferença de cada absorvimento amostral a 647 nanômetros do controle HNB. Determine a concentração metálica em micromolar usando a fórmula onde DF é o fator de diluição para a fração de ensaio, delta A-B-S 647 é a mudança de absorvância em 647 nanômetros, 3,65 vezes 10 para o negativo 2 representa o coeficiente de extinção do HNB, e l é o caminho óptico de Cuvette em centímetros. Neste estudo, o espectro de HNB livre em PH neutro em espectro representativo de frações avaliadas para íon níquel a partir do isolamento do MSP1E3D1 são mostrados aqui.
Observou-se uma diminuição da absorvância em 647 nanômetros em relação ao controle hnb, o que correspondeu à formação de complexos HNB na presença de um metal de transição. Para demonstrar a aplicação deste ensaio, foram analisadas duas proteínas de espeto de membrana marcadas, MSP1E3D1, MSP2N2, e um novo, citocromo c-tipo C GSU0105, de enxofre geobacter, foram analisados. O teor de íons de proteína e níquel de cada fração para GSU0105 foi significativamente deslocado um do outro, enquanto as frações para MSP1E3D1 e MSP2N2 que continham mais proteínas também apresentaram o maior teor de níquel.
Também é ilustrado que o conteúdo metálico pode não ser distribuído uniformemente entre frações coletadas por meio de uma cromatografia de afinidade metálica mobilizada. É mais importante misturar adequadamente e consistentemente o branco em todas as amostras e permitir tempos iguais de incubação para o branco em todas as amostras. Frações proteicas de interesse especial poderiam ser analisadas com espectrometria de absorção atômica ou ICPMS para confirmar a contaminação metálica e testar íons metálicos de proteínas quequeadas ou fortemente ligadas.
Além da detecção de lixiviação metálica de transição, essa técnica pode ser usada para medir afinidades vinculantes em íons metálicos de transição para proteínas. HNB e qualquer níquel presente nas amostras são irritantes para os olhos e pele, respectivamente. Epi padrão, incluindo luvas e proteção ocular devem ser usados durante o método.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio simples para quantificar metais em amostras preparadas utilizando cromatografia de afinidade por metal imobilizado. O método emprega o azul de hidroxinaftol como indicador colorimétrico e utiliza um espectrofotômetro UV-Vis para detecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Química Analítica
- Cromatografia de Afinidade Metálica
Antecedentes
- A contaminação de amostras com metais de transição pode afetar os resultados experimentais.
- A cromatografia de afinidade por metal imobilizado é uma técnica comum em bioquímica.
- Os métodos existentes para detecção de contaminação por metais podem ser complexos ou exigir equipamentos especializados.
- É necessária uma metodologia simples e acessível para análises de rotina em laboratórios de bioquímica.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um ensaio simples para detecção de contaminação por metais em amostras.
- Permitir que bioquímicos avaliem rapidamente a pureza da amostra.
- Facilitar o uso de equipamentos de laboratório comuns para a quantificação de metais.
Métodos Utilizados
- Uso do hidroxinaftol azul como indicador colorimétrico.
- Aplicação da espectrofotometria UV-Vis para detecção.
- Testes com colunas de NTA-níquel e outras resinas de afinidade metálica.
- Ensaios iniciais com concentrações conhecidas de soluções estoque de níquel.
Resultados Principais
- O ensaio permite uma avaliação rápida da contaminação por metais.
- Os resultados podem ser obtidos utilizando técnicas laboratoriais padrão.
- O método é adaptável a diversas resinas de afinidade metálica.
- Os usuários podem familiarizar-se com o fluxo de trabalho por meio de ensaios iniciais.
Conclusões
- O ensaio proposto simplifica a detecção de contaminação por metais.
- É acessível a bioquímicos comuns com equipamentos laboratoriais usuais.
- O método aumenta a confiabilidade de amostras preparadas por meio de cromatografia de afinidade metálica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A lixiviação de metais a partir de colunas de cromatografia de afinidade com metais imobilizados (IMAC) introduz contaminantes de metais de transição que podem inibir a atividade enzimática e comprometer a confiabilidade dos ensaios em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico. Este protocolo fornece um método simples e acessível para quantificar essa contaminação utilizando espectrofotometria UV-Vis amplamente disponível e azul de hidroxinaftol (HNB), permitindo controle de qualidade de rotina sem necessidade de instrumentação especializada. Ao oferecer sensibilidade em nível nanomolar com equipamentos laboratoriais padrão, o ensaio apoia a integridade dos dados em validação inicial de alvos e fluxos de trabalho de purificação de proteínas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar se a inibição enzimática observada decorre da biologia do alvo ou da contaminação por metais, reduzindo falsos positivos na validação de alvos.
- Valor Operacional: Utiliza espectrofotômetros UV-Vis existentes e tampões comuns, permitindo implementação rápida entre equipes de descoberta sem necessidade de investimento em novos equipamentos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece leituras quantitativas de íons metálicos em 647 nm, permitindo a correlação entre níveis de lixiviação e pureza da fração na purificação por IMAC.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação de contaminação entre variantes proteicas e resinas, apoiando o desenvolvimento reprodutível de ensaios para a produção de proteínas com marcação his.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Confirma o status livre de metais de proteínas purificadas antes de ensaios funcionais, melhorando a confiança preditiva em estudos subsequentes de interação com alvos.
- Valor Operacional: Fornece um critério de liberação para lotes de proteínas, permitindo decisões de prosseguir ou não antes de comprometer recursos com testes pré-clínicos de eficácia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método posiciona-se entre a purificação por IMAC e a caracterização bioquímica ou biofísica subsequente, servindo como um ponto de verificação da pureza da amostra antes de estudos cinéticos enzimáticos, ensaios de ligação ou análises estruturais.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao descartar artefatos mediados por metais em dados de atividade enzimática ou interações proteicas.
- Triagem: Garante a prontidão do ensaio ao verificar se as frações proteicas purificadas estão livres de metais de transição inibitórios que poderiam distorcer os resultados da triagem de compostos.
- Análises: Gera valores quantitativos de variação de absorbância em 647 nm, permitindo o cálculo de concentrações micromolares de metais para comparação entre lotes.
- Pesquisa Translacional: Conecta a qualidade da purificação à continuidade pré-clínica, assegurando que a contaminação por metais não interfira na validação de alvos ou nas medições de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma etapa de controle de qualidade reutilizável, aplicável a qualquer purificação baseada em IMAC, independentemente do tipo de resina ou proteína-alvo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao eliminar uma fonte comum de ruído bioquímico em ensaios baseados em enzimas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios mediante o uso de um método colorimétrico com parâmetros definidos de incubação e medição.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de experimentos falhados devido à inibição por metais não detectada, melhorando a eficiência do capital em campanhas de identificação de compostos líderes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos proteicos com base na pureza confirmada, apoiando uma alocação mais eficaz de recursos na fase inicial de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige familiaridade com espectrofotometria UV-Vis e preparação básica de soluções para o reagente HNB.
- Depende do acesso a cubetas de quartzo e a um espectrofotômetro capaz de realizar medições de absorbância em 647 nm.
- Necessita de diluição de amostras e tempo de incubação consistentes para garantir cálculos precisos de delta-AB.
- Pode exigir otimização para proteínas com absorbância intrínseca intensa ou interferência de cor em 647 nm.
- É melhor combinado com métodos ortogonais, como AAS ou ICPMS, para confirmação quando for necessária quantificação confiável de metais.
