Name: Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Explore a análise do fenótipo esquelético em modelos de rato transgênicos Stat3 Ctsk usando técnicas histológicas, micro CT e marcação TRAP. Este método ajuda pesquisadores a investigar a diferenciação de osteoclastos e a regulação da massa óssea in vivo.

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Agradecemos ao Prof. Weiguo Zou e à S. Kato pelos reagentes e ratos e aos membros do laboratório Zou por discussões úteis. Agradecemos também ao Laboratório de Estomatologia Digitalizada e Centro de Pesquisa de Anomalias Craniofaciais do Hospital do Nono Povo de Xangai pela assistência. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, o fundo SHIPM-mu do Instituto de Medicina de Precisão de Xangai, Shanghai Nona Escola Popular de Medicina, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], o Projeto de Incentivo da Equipe de Inovação de Alto Nível para a Escola de Medicina da Universidade de Xangai Jiao Tong , o Fundo de Pesquisa Interdisciplinar do Hospital do Nono Povo de Xangai, Shanghai JiaoTong University School of Medicine [JYJC201902]. E L.J. é um estudioso dos Talentos Médicos Da Juventude, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program e o projeto "Chen Xing" da Universidade de Xangai Jiaotong.

Todos os métodos relacionados aos animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Xangai Jiaotong.
1. Reprodução de camundongos de exclusão Stat3 específicos do assino
NOTA: Os ratos Stat3fl/fl foram obtidos comercialmente. Os camundongos Ctsk-Cre foram fornecidos pela S. Kato (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão12). Os camundongos foram criados e mantidos sob condições específicas sem patógenos (FPS) na instalação institucional de animais em condições padronizadas.
<ol><li>Emparelhe um rato macho sexualmente maduro com duas fêmeas da mesma idade. Após 18 dias, verifique diariamente os cheques para recém-nascidos. Separe os camundongos fêmeas grávidas e mantenha-o sozinho, se necessário. Mude os camundongos machos entre diferentes gaiolas de reprodução se os camundongos fêmeas não estivessem grávidas dentro de um mês do emparelhamento.</li>
	<li>Cruze ratosfl/fl de Stat3para ratos Ctsk-Cre (F0). Corte as caudas para genotipagem e mantenha o Stat3fl/+ ;masculino Camundongos Ctsk-Cre até que estejam sexualmente maduros, que tem cerca de 6 semanas de idade (F1). Use os seguintes primers: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Cruze 6 semanas de idade masculino Stat3fl/+; Camundongos Ctsk-Cre com ratos Stat3fl/fl femininos. Corte as caudas para genotipagem e mantenha o Stat3 fl/flmasculino; Camundongos Ctsk-Cre até que estejam sexualmente maduros, que tem cerca de 6 semanas de idade (F2).</li>
	<li>Cruz 6-week-old masculino Stat3 fl/fl; Camundongos Ctsk-Cre com ratos Stat3fl/fl fêmeas (F3). Corte as caudas para genotipagem e substitua os camundongos de criação antigos por camundongos mais jovens com o tempo (F3+N).</li>
</ol>2. Coleta de espécimes
<ol><li>Eutanize seis pares de 8 semanas de idade Stat3fl/fl e Stat3Ctsk lixo-mate ratos separadamente com asfixia por dióxido de carbono. NOTA: A taxa de fluxo de CO2 desloca 30% do volume da gaiola por minuto (por exemplo, para 45 cm x 30 cm x 30 cm de gaiola a taxa de fluxo de CO2 é de 40 L/min).</li>
	<li>Coloque os ratos em uma posição supina. Desloque as articulações bilaterais do quadril suavemente à mão. Use uma tesoura oftálmica para cortar a pele verticalmente da tíbia distal e, em seguida, dissecar toda a pele do membro traseiro.</li>
	<li>Corte o ligamento articular da articulação do quadril direito e articulação do joelho com uma tesoura para separar o membro traseiro. Corte o trochanter e a junção da fíbula e, em seguida, mergulhe o membro traseiro em 4% de paraformaldeído. Mantenha os membros traseiros certos para o passo 3. Corte adequadamente o osso em ambas as extremidades para imergir completamente e fixar a medula óssea com 4% de paraformaldeído.</li>
	<li>Corte o ligamento articular da articulação do quadril esquerdo e da articulação do joelho com uma tesoura, remova suavemente o tecido mole e separe cuidadosamente a tíbia e o fêmur. Mergulhe a tíbia e o fêmur separadamente em 75% de etanol. Mantenha a femora para a etapa 4 e tíbia para a etapa 6. Certifique-se de manter o trochanter intacto.</li>
</ol>3. Preparação da seção de parafina
<ol><li>Fixar o membro traseiro direito em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 48 h.</li>
	<li>Decalcificar: Lave suavemente os espécimes com 1x PBS por 10 min 3 vezes. Decalcifice os espécimes em 15% EDTA (150 g EDTA em 800 mL de ddH2O e 100 mL de 10x PBS) com um decalcificador ultrassônico por 3 a 4 semanas até que os ossos possam ser dobrados. Substitua por um fluido de decalcificante fresco a cada dois dias.</li>
	<li>Lave suavemente as amostras 3x com 1x PBS e, em seguida, mergulhe-as em 75% de etanol a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Desidratação: No segundo dia, imergir sequencialmente espécimes em 95% de etanol, 100% etanol e xileno, cada um por 1h duas vezes.</li>
	<li>Mergulhe espécimes em 1/2 xileno 1/2 parafina por 30 min. Mergulhe os espécimes em parafina a 65 °C durante a noite.</li>
	<li>Incorporar: Selecione um tanque de incorporação adequado para incorporar. Coloque a tíbia uniformemente por baixo. Coloque o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90°. Depois que a parafina tiver esfriado e solidificado, remova-a do tanque de incorporação. Numerar os espécimes e armazená-los a -20 °C durante a noite.</li>
	<li>Corte seções de 5 μm de espessura continuamente usando o microtoma. Corte de 20 a 40 seções. Espalhe as seções em água de 37 °C, adere-as aos slides do microscópio e asse a 42 °C durante a noite.</li>
</ol>4. Micro-CT de digitalização e análise
<ol><li>Escaneie a femora esquerda com um scanner microcáludo. Resolução: 10 μm; Tensão: 70 kV; Corrente: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Passo de rotação: 0,5°.</li>
	<li>Reconstrua imagens 3D do osso cortical e do osso trabecular usando o software de suporte do scanner seguindo as instruções do fabricante. Os ROIs têm uma largura total de 1 mm de osso trabecular próximo à placa de crescimento distal e em uma seção total de 1 mm de largura do osso cortical no meio da femora.</li>
	<li>Calcular os parâmetros quantitativos de microarquitetura: densidade mineral óssea (DMO), fração de volume ósseo (VB/TV), espessura trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separação trabecular (Tb.Sp.) e espessura óssea cortical (Ct.Th.).</li>
</ol>5. Coloração de armadilha
<ol><li>Asse as seções de parafina a 65 °C por 30 min.</li>
	<li>Dewax: Mergulhe as seções em xileno por 10 minutos. Realize esta etapa 3x com xileno fresco.</li>
	<li>Reidratar: Mergulhe as seções sequencialmente em 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol e ddH2O, cada uma por 5 min duas vezes.</li>
	<li>Prepare a solução de coloração usando o kit de coloração TRAP seguindo as instruções do fabricante e aqueça até 37 °C. NOTA: A solução de coloração TRAP deve ser preparada imediatamente antes de cada ensaio.</li>
	<li>Adicione 50-100 μL de solução de coloração a cada amostra e incubar em uma câmara úmida de 37 °C por 20-30 min. Verifique o estado de coloração dos osteoclastos sob um microscópio de luz a cada 5 minutos até que os osteoclastos multinucleados vermelhos possam ser vistos. Termine a reação com ddH2O.</li>
	<li>Contra-mancha na solução de hematoxilina para 30 s. Crie uma cor azul estável por imersão em solução de amônia de 1% por 1 min. Enxágüe lentamente água da torneira.</li>
	<li>Monte as seções com tampas usando bálsamo neutro e seque durante a noite.</li>
	<li>Capture 3-5 campos de interesse por um microscópio. Analise o perímetro trabecular por Imagem J: meça o comprimento da barra de escala (Ls) usando a ferramenta 'linha reta' como L1, em seguida, meça o comprimento do perímetro trabecular usando a ferramenta 'linha segmentada' como L2, o comprimento físico (Lp)= Ls*L2 /L1). Conte o número de células TRAP-positivas com mais de três núcleos.</li>
</ol>6. Rotulagem dupla vermelha de Calcein e alizarin
<ol><li>Preparação da amostra: Injete intraperitonealmente 20 mg/kg de calceína (1 mg/mL em solução NaHCO3) no dia 0, e 25 mg/kg alizarin vermelho S (AL, 2 mg/mL em H2O) no dia 4. Sacrifício de ratos no 7º dia. Desassociar cuidadosamente a tíbia e fixar em 4% paraformaldeído a 4 °C por 48 h.</li>
	<li>Desidratar: Após a fixação, lave suavemente a tíbia 3x com 1x PBS. Imersão sequencialmente as amostras em 95% de etanol, 100% etanol e xileno por 5 min duas vezes separadamente.</li>
	<li>Mergulhe os espécimes em acetona por 12 h, em 1/2 resina acetona 1/2 por 2 h, e em resina pura em um forno de secagem durante a noite. NOTA: A resina foi preparada por resina comercialmente disponível (por exemplo, Embed 812 Resin) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Incorporar: Adicione resina pura em um tanque adequado de incorporação de gel de sílica e coloque os espécimes suavemente para evitar bolhas. Polimerize a resina em forno de secagem a 60 °C por 48 h.</li>
	<li>Corte os espécimes em seções de 5 μm de espessura continuamente com um microtome rotativo. Armazene o resto das amostras com dessecante à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adere às seções com pinças em uma queda de 75% de álcool. Monte as seções com tampas usando bálsamo neutro. Capture rotulagem de fluorescência vermelha e verde com um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Meça a largura entre duas linhas de rotulagem (Ir.L.Wi), perímetro trabecular de etiqueta única (sL.Pm), perímetro trabecular de dupla rotulagem (dL.Pm) e perímetro trabecular total (Tb.Pm). Calcular a taxa de apposition mineral (MAR) e a taxa de formação óssea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/dias de intervalo. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li>
<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li>
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<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast%2Fosteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li>
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<li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+acid+phosphatase%3A+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li>
<li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li>
<li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li>
<li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li>
<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
<li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li>
<li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li>
<li>Tambutté, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein+labelling+and+electrophysiology%3A+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%2FRaptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente usados para estudar o mecanismo e o tratamento farmacêutico da doença humana13. Os camundongos Ctsk-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos6. O presente estudo descreveu os protocolos dos métodos para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.
A análise histológica é o melhor mét...

O osso esquelético é o principal órgão portador de carga do corpo humano e está sob pressão do ambiente interno e externo durante a caminhada e o exercício1. Ao longo de sua vida, os ossos passam continuamente pela auto-renovação, que é equilibrada por osteoblastos e osteoclartos. O processo de osteoclasstos limpando ossos velhos e osteoblastos formando novos ossos mantém a homeostase e a função mecânica do sistema esquelético2. A perturbação no equilíbrio pode induzir doenças metabólicas ósseas, como a osteoporose. A osteoporose, causada pelo excesso de atividade osteoclástica, é globalmente prevalente e causa perdas econômicas substanciais para a sociedade2,3,4. De acordo com o número limitado de medicamentos disponíveis para o tratamento da osteoporose e seu risco de efeitos adversos4, é importante desvendar os detalhes da formação e atividade do osteoclato.
Os osteoclatos derivados da linhagem hematopoiética monócito/macrófago têm múltiplos núcleos (podem ter de 2 a 50 núcleos) e são grandes (geralmente maiores que 100 μm de diâmetro)2. Embora a exploração de mecanismos e a triagem de medicamentos para distúrbios osteoclásticos tenham sido amplamente melhoradas através da cultura osteoclasta in vitro, as complicadas reações orgânicas tornam a evidência in vivo indispensável para a terapia-alvo. Devido às semelhanças genéticas e fisiopacionológicas entre camundongos e humanos, modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente utilizados para estudar os mecanismos e os tratamentos farmacêuticos da doença humana in vivo6. O sistema Cre-loxP é uma tecnologia amplamente utilizada para edição de genes de camundongos e permitiu que os pesquisadores investigassem funções genéticas de forma específica de tecido/célula5. Cathepsin K (CSTK) é uma protease de cisteína secretada por osteoclartos que pode degradar colágeno ósseo8. É bem aceito que o CTSK seja expresso seletivamente em osteoclastos maduros; portanto, os camundongos Ctsk-Cre são considerados uma ferramenta útil para estudos funcionais de osteoclatos e tem sido utilizado6.
O transdutor de sinal e ativador da família de transcrição (STAT) é clássico e altamente significativo em imunidade e progressão e desenvolvimento do câncer7,8. Entre os sete STATs, o STAT3 é relatado como o mais relevante para a homeostaseóssea 9,10. Vários estudos in vivo relataram que a inativação específica do STAT3 nos osteoblastos diminui a formaçãoóssea 9,10. No entanto, as evidências sólidas sobre a participação do STAT3 na formação de osteoclatos e metabolismo ósseo in vivo ainda são limitadas. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo de mouse de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, a partir de agora chamado Stat3Ctsk) que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo11. No presente estudo, descrevemos os métodos e protocolos que utilizamos para analisar as alterações na massa óssea, histomorfologia óssea e anabolismo ósseo e catabolismo dos camundongos Stat3Ctsk, a fim de estudar a influência da exclusão STAT3 específica do osteoclato na homeostase óssea.

<table><tbody><tr><td>Solução de paraformaldeído a 4%</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Reagente</td><td>Experimental De Xangai Acetona Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Solução de amônia Alizarin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratos</td><td></td><td></td> Calcein Sigma-Aldrich C0875<td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre</td><td>um presente de S. Kato, Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão</td>DDSA Microscopia Eletrônica Ciências 13710 DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100 DMP-30 Microscopia Eletrônica Ciências 13600 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Reagente experimental Co. de EDTA Shanghai, Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 RESINA</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de fluorescência</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG&</td><td>mu; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Shanghai Reagente Experimental Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Bálsamo neutro</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo</td><td>A601889 Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl camundongos</td><td>GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>kit de coloração TRAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>xileno</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Modelos de camundongos transgênicos são poderosos para entender os genes críticos que controlam a diferenciação e atividade osteoclante, e para estudar mecanismos e tratamentos farmacêuticos da osteoporose. Os camundongos Cathepsin K (Ctsk)-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é relevante na homeostase óssea, mas seu papel nos osteoclas in vivo permanece mal definido. Para fornecer a evidência in vivo de que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo, geramos um modelo de rato de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) e analisou seu fenótipo esquelético. A varredura microcsi tomografia e a reconstrução 3D implicaram aumento da massa óssea nos camundongos eliminatórios condicionais. Foram realizadas colorações de H&E, re coloração dupla de calceína e alizarina vermelha e coloração de fosfattase de ácido resistente a tartaratos (TRAP) para detectar o metabolismo ósseo. Em suma, este protocolo descreve alguns métodos e técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.

Utilizando o protocolo atual, foram gerados camundongos de exclusão Stat3 específicos para estudar a influência da exclusão de STAT3 na diferenciação de osteoclatos. Os camundongos Stat3Ctsk e seus ninhados wildtype (WT) foram criados e mantidos após a genotipagem. Macrófagos de medula óssea foram isolados e cultivados em osteoclatos, e a exclusão de STAT3 em camundongos Stat3Ctsk foi demonstrada(Figura 1).
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Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.

Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Modelos de camundongos geneticamente modificados são ferramentas poderosas para estudar os mecanismos de doenças humanas in vivo. A análise do fenótipo esquelético de camundongos é a base da pesquisa esquelética. Esta partícula descreve algumas técnicas típicas para analisar o fenótipo esquelético que podem ser interessantes para aqueles que são novos na pesquisa de tecidos esqueléticos.Ao tentar essa partícula, lembre-se de que os experimentos com animais levam tempo, portanto, colete o máximo possível de amostras de alta qualidade durante cada experimento, mesmo que você não precise delas a curto prazo. Comece colocando um camundongo sacrificado em decúbito dorsal e deslocando suavemente as articulações bilaterais do quadril com a mão. Use uma tesoura oftálmica para cortar verticalmente a pele da tíbia distal e, em seguida, remova toda a pele do membro posterior.Corte o ligamento articular da articulação do quadril direito e da articulação do joelho com uma tesoura para separar o membro posterior. Em seguida, corte o osso em ambas as extremidades para mergulhar totalmente o osso em 4% de PFA. Corte o trocânter e a junção da fíbula.Mergulhe o membro posterior em 4% PFA, mantendo o membro posterior direito para seccionamento em parafina. Corte os ligamentos articulares das articulações do quadril esquerdo e do joelho com uma tesoura e remova suavemente o tecido mole. Separe a tíbia e o fêmur e mergulhe-os separadamente em etanol a 75%.Mantenha o fêmur para microtomografia computadorizada e as tíbias para marcação dupla de calceína e vermelho de alizarina. Para preparar as seções de parafina, lave suavemente o membro posterior direito fixo três vezes com PBS por 10 minutos por lavagem. Em seguida, descalcifique-o em 15% EDTA com um descalcificador ultrassônico por três a quatro semanas até que os ossos possam ser dobrados, substituindo o fluido descalcificante a cada dois dias.Após a descalcificação, lave os espécimes três vezes com PBS e mergulhe-os em etanol a 75% a quatro graus Celsius durante a noite. No segundo dia, mergulhe sequencialmente as amostras em etanol a 95%, etanol a 100% e xileno por uma hora cada. Mergulhe os espécimes em meio xileno e meio parafina por 30 minutos, depois em parafina a 65 graus Celsius durante a noite.Para embutir o espécime, mergulhe-o em parafina, colocando o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90 graus. Quando a parafina esfriar completamente, remova as amostras do tanque de incorporação. Numere-os e armazene-os a 20 graus Celsius negativos durante a noite.Asse as seções de parafina a 65 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, descere-as mergulhando-as em xileno por 10 minutos. Mergulhe as seções três vezes com xileno fresco de cada vez. Reidrate as seções mergulhando-as sequencialmente em etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% e água destilada por cinco minutos cada.Prepare a solução de coloração usando o kit de coloração TRAP e aqueça-a a 37 graus Celsius. Adicione 50 a 100 microlitros de solução de coloração a cada seção e incube-os em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Verifique o estado de coloração dos osteoclastos sob um microscópio óptico a cada cinco minutos até que os osteoclastos multinucleados vermelhos possam ser vistos.Em seguida, termine a reação com água. Contra-core as seções em solução de hematoxilina por 30 segundos e crie uma cor azul estável mergulhando-as em solução de amônia a 1% por um minuto. Em seguida, enxágue-os em água corrente lentamente.Monte as seções usando lamínulas com bálsamo neutro e seque-as durante a noite. Capture de três a cinco campos de visão com um microscópio e analise o perímetro trabecular com a imagem J.Use a ferramenta de linha reta para medir o comprimento da barra de escala como L1. Em seguida, use a ferramenta de linha segmentada para medir o comprimento do perímetro trabecular como L2. Calcule o comprimento físico e conte o número de células positivas para TRAP com mais de três núcleos. Após a fixação, lave suavemente as tíbias três vezes com PBS e mergulhe sequencialmente os espécimes em etanol a 95%, etanol a 100% e xileno por cinco minutos cada.Mergulhe os espécimes em acetona por 12 horas e metade acetona e metade resina por duas horas, e em resina pura em um forno de secagem durante a noite. Adicione resina pura em um tanque de inclusão de gel de sílica adequado e coloque as amostras no tanque evitando bolhas. Polimerizar a resina em um forno de secagem a 60 graus Celsius por 48 horas.Corte as amostras em seções de cinco micrômetros de espessura continuamente com um micrótomo rotativo e armazene o restante das amostras com dessecante em temperatura ambiente. Cole as seções com uma pinça em uma gota de 75% de etanol e monte-as com lamínulas usando bálsamo neutro. Capture a rotulagem de fluorescência vermelha e verde com um microscópio de fluorescência.Camundongos com deleção Stat3 específicos para osteoclastos foram gerados para estudar a influência da deleção Stat3 na diferenciação de osteoclastos. A reconstrução femoral e a análise quantitativa por micro CT indicaram que a massa óssea dos camundongos Stat3 Ctsk estava aumentada em comparação com os camundongos selvagens. A histomorfologia do fêmur de camundongos selvagens e Stat3 Ctsk foi examinada por meio de coloração H e E.A atividade osteoclastogênica foi detectada usando a coloração TRAP. Os osteoclastos são grandes células positivas para TRAP com múltiplos núcleos. O número de osteoclastos positivos para TRAP foi menor em camundongos Stat3 Ctsk, em comparação com camundongos do tipo selvagem, indicando que a deficiência de Stat3 prejudicou a formação de osteoclastos.A osteogênese foi medida com marcação dupla de calceína e vermelho de alizarina. A área entre a fluorescência da calceína e do vermelho de alizarina representa o osso recém-formado. O Stat3 deletado em osteoclastos não influenciou o anabolismo ósseo.Cortes de parafina sagital em que a cartilagem mais tarde era simétrica e que mostraram que uma linha clara em forma de M foi usada aqui. Para os estudos, incluiremos mais características do sistema esquelético, como propriedades mecânicas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e...

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Níveis de atividade de campo aberto são usados ​​para avaliar os níveis de atividade de locomotivas e comportamentais. Este protocolo fornece um bem concebido, protocolo padronizado para usar em ensaios pré-clínicos para doenças neuromusculares.

Medidas comportamentais e do aparelho locomotor Usando um sistema aberto Activity Monitoring Campo de Doenças músculo-esquelético

A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar e quantificar níveis da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial pela imunocoloração usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. Além, nós descrevemos um método para a preparação e o criossecção de tecidos duros secçóes dos ratos novos para a imunocoloração.

Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

A análise de pegada é uma alternativa de baixo custo para programas digitalizados de análise da marcha para pesquisadores que quantifiquem anormalidades de movimento em camundongos. Devido à sua velocidade, simplicidade e potencial longitudinal, é ideal para a fenotipagem comportamental de modelos de mouse.

Análise de marcha de baixo custo para fenotipagem comportamental de modelos de camundongo de doença neuromuscular

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

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Este estudo fornece um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descreve métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica, esclarecendo a biologia mecânica esquelética.

Uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica

Aqui, descrevemos em profundidade um método, baseado em microtomografia computadorizada, para segmentar e medir modelos 3D de ossos craniomaxilofaciais em camundongos, para melhor avaliação do desenvolvimento ósseo craniomaxilofacial em camundongos do que é possível com os métodos atuais.

Análise de malformações craniomaxilofaciais em camundongos por meio de tomografia computadorizada tridimensional

Explore a análise do fenótipo esquelético em modelos de rato transgênicos Stat3 Ctsk usando técnicas histológicas, micro CT e marcação TRAP. Este método ajuda pesquisadores a investigar a diferenciação de osteoclastos e a regulação da massa óssea in vivo.

Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional

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