Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional
3 de julho de 2020
Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.
Modelos de camundongos geneticamente modificados são ferramentas poderosas para estudar os mecanismos de doenças humanas in vivo. A análise do fenótipo esquelético de camundongos é a base da pesquisa esquelética. Esta partícula descreve algumas técnicas típicas para analisar o fenótipo esquelético que podem ser interessantes para aqueles que são novos na pesquisa de tecidos esqueléticos.
Ao tentar essa partícula, lembre-se de que os experimentos com animais levam tempo, portanto, colete o máximo possível de amostras de alta qualidade durante cada experimento, mesmo que você não precise delas a curto prazo. Comece colocando um camundongo sacrificado em decúbito dorsal e deslocando suavemente as articulações bilaterais do quadril com a mão. Use uma tesoura oftálmica para cortar verticalmente a pele da tíbia distal e, em seguida, remova toda a pele do membro posterior.
Corte o ligamento articular da articulação do quadril direito e da articulação do joelho com uma tesoura para separar o membro posterior. Em seguida, corte o osso em ambas as extremidades para mergulhar totalmente o osso em 4% de PFA. Corte o trocânter e a junção da fíbula.
Mergulhe o membro posterior em 4% PFA, mantendo o membro posterior direito para seccionamento em parafina. Corte os ligamentos articulares das articulações do quadril esquerdo e do joelho com uma tesoura e remova suavemente o tecido mole. Separe a tíbia e o fêmur e mergulhe-os separadamente em etanol a 75%.
Mantenha o fêmur para microtomografia computadorizada e as tíbias para marcação dupla de calceína e vermelho de alizarina. Para preparar as seções de parafina, lave suavemente o membro posterior direito fixo três vezes com PBS por 10 minutos por lavagem. Em seguida, descalcifique-o em 15% EDTA com um descalcificador ultrassônico por três a quatro semanas até que os ossos possam ser dobrados, substituindo o fluido descalcificante a cada dois dias.
Após a descalcificação, lave os espécimes três vezes com PBS e mergulhe-os em etanol a 75% a quatro graus Celsius durante a noite. No segundo dia, mergulhe sequencialmente as amostras em etanol a 95%, etanol a 100% e xileno por uma hora cada. Mergulhe os espécimes em meio xileno e meio parafina por 30 minutos, depois em parafina a 65 graus Celsius durante a noite.
Para embutir o espécime, mergulhe-o em parafina, colocando o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90 graus. Quando a parafina esfriar completamente, remova as amostras do tanque de incorporação. Numere-os e armazene-os a 20 graus Celsius negativos durante a noite.
Asse as seções de parafina a 65 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, descere-as mergulhando-as em xileno por 10 minutos. Mergulhe as seções três vezes com xileno fresco de cada vez. Reidrate as seções mergulhando-as sequencialmente em etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% e água destilada por cinco minutos cada.
Prepare a solução de coloração usando o kit de coloração TRAP e aqueça-a a 37 graus Celsius. Adicione 50 a 100 microlitros de solução de coloração a cada seção e incube-os em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Verifique o estado de coloração dos osteoclastos sob um microscópio óptico a cada cinco minutos até que os osteoclastos multinucleados vermelhos possam ser vistos.
Em seguida, termine a reação com água. Contra-core as seções em solução de hematoxilina por 30 segundos e crie uma cor azul estável mergulhando-as em solução de amônia a 1% por um minuto. Em seguida, enxágue-os em água corrente lentamente.
Monte as seções usando lamínulas com bálsamo neutro e seque-as durante a noite. Capture de três a cinco campos de visão com um microscópio e analise o perímetro trabecular com a imagem J.Use a ferramenta de linha reta para medir o comprimento da barra de escala como L1. Em seguida, use a ferramenta de linha segmentada para medir o comprimento do perímetro trabecular como L2. Calcule o comprimento físico e conte o número de células positivas para TRAP com mais de três núcleos. Após a fixação, lave suavemente as tíbias três vezes com PBS e mergulhe sequencialmente os espécimes em etanol a 95%, etanol a 100% e xileno por cinco minutos cada.
Mergulhe os espécimes em acetona por 12 horas e metade acetona e metade resina por duas horas, e em resina pura em um forno de secagem durante a noite. Adicione resina pura em um tanque de inclusão de gel de sílica adequado e coloque as amostras no tanque evitando bolhas. Polimerizar a resina em um forno de secagem a 60 graus Celsius por 48 horas.
Corte as amostras em seções de cinco micrômetros de espessura continuamente com um micrótomo rotativo e armazene o restante das amostras com dessecante em temperatura ambiente. Cole as seções com uma pinça em uma gota de 75% de etanol e monte-as com lamínulas usando bálsamo neutro. Capture a rotulagem de fluorescência vermelha e verde com um microscópio de fluorescência.
Camundongos com deleção Stat3 específicos para osteoclastos foram gerados para estudar a influência da deleção Stat3 na diferenciação de osteoclastos. A reconstrução femoral e a análise quantitativa por micro CT indicaram que a massa óssea dos camundongos Stat3 Ctsk estava aumentada em comparação com os camundongos selvagens. A histomorfologia do fêmur de camundongos selvagens e Stat3 Ctsk foi examinada por meio de coloração H e E.
A atividade osteoclastogênica foi detectada usando a coloração TRAP. Os osteoclastos são grandes células positivas para TRAP com múltiplos núcleos. O número de osteoclastos positivos para TRAP foi menor em camundongos Stat3 Ctsk, em comparação com camundongos do tipo selvagem, indicando que a deficiência de Stat3 prejudicou a formação de osteoclastos.
A osteogênese foi medida com marcação dupla de calceína e vermelho de alizarina. A área entre a fluorescência da calceína e do vermelho de alizarina representa o osso recém-formado. O Stat3 deletado em osteoclastos não influenciou o anabolismo ósseo.
Cortes de parafina sagital em que a cartilagem mais tarde era simétrica e que mostraram que uma linha clara em forma de M foi usada aqui. Para os estudos, incluiremos mais características do sistema esquelético, como propriedades mecânicas.
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Visão Geral
Este estudo explora os papéis de genes críticos na atividade dos osteoclastos utilizando modelos de camundongos geneticamente modificados. O protocolo descreve técnicas para analisar fenótipos esqueléticos e enfatiza a importância de amostras biológicas de alta qualidade.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia óssea
- Diferenciação de osteoclastos
- Regulação genética da remodelação óssea
Antecedentes
- Importância dos osteoclastos na saúde esquelética
- Uso de camundongos transgênicos para modelar doenças humanas
- Necessidade de protocolos experimentais rigorosos
Métodos Utilizados
- Análise do esqueleto utilizando diversas técnicas histológicas
- Modelos de camundongos transgênicos (camundongos Stat3 Ctsk)
- Coloração TRAP, varredura por micro-TC e marcação dupla para medida da formação óssea
Resultados Principais
- A deficiência de Stat3 reduziu a formação de osteoclastos
- Aumento da massa óssea em camundongos Stat3 Ctsk em comparação com o tipo selvagem
- O estudo valida o papel do gene na diferenciação de osteoclastos e sugere um mecanismo para a regulação da massa óssea
Conclusões
- Este estudo demonstra como a regulação gênica pode afetar o comportamento dos osteoclastos e a saúde óssea em geral.
- Os achados são significativos para abordagens terapêuticas em doenças relacionadas à perda óssea.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a função de genes específicos dos osteoclastos permite a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de terapias direcionadas ao osso. Modelos de eliminação condicional fornecem confiança preditiva para a validação de alvos ao isolar as contribuições celulares na remodelação óssea. Essa abordagem apoia a avaliação pré-clínica da modulação de vias anabólicas versus catabólicas na descoberta de medicamentos para osteoporose.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar a hipótese terapêutica sobre o papel do STAT3 na diferenciação de osteoclastos e na reabsorção óssea.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo por meio de ablação genética específica de células in vivo.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao associar a perda do STAT3 à redução da formação de osteoclastos e ao aumento da massa óssea.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados (tecido ósseo) para padronização e reprodutibilidade de ensaios posteriores.
- Valor Operacional: Gera resultados quantitativos (contagem de células TRAP+, área óssea, métricas de microTC) para avaliação confiável de compostos.
- Valor Científico: Facilita a preparação para triagem por meio de fluxos de trabalho padronizados de histologia e imagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a continuidade do sistema relevante para a doença, desde a modulação do alvo genético até o fenótipo esquelético.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a medição de ambos os parâmetros: reabsorção (TRAP) e formação (calceína/alizarina).
- Valor Científico: Fornece insights mecanicistas sobre a regulação da massa óssea por meio de vias específicas de osteoclastos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método auxilia a biologia descritiva por meio da verificação de hipóteses sobre a função gênica intrínseca aos osteoclastos e da clarificação de vias na homeostase óssea.
- Biologia da Descoberta: Explica como a deleção condicional apoia o teste de hipóteses do STAT3 em osteoclastos e a redução de riscos biológicos de alvos de reabsorção.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio por meio de preparação padronizada de tecidos e histomorfometria quantitativa para triagem de compostos.
- Análises: Destaca a microTC, coloração para TRAP e marcação dupla como leituras quantitativas que permitem comparação intercondições do fenótipo ósseo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação genética à continuidade pré-clínica por meio de análise integrada de reabsorção e formação.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para validar alvos específicos de osteoclastos em modelos de doenças ósseas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista na regulação de osteoclastos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de fenotipagem esquelética.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados no desenvolvimento de terapêuticas ósseas.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, baseadas na validação do mecanismo específico do alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise necessária em genética de camundongos, histologia óssea e análise de microTC.
- Os equipamentos necessários incluem micrótomo, microscópios de fluorescência e óptico, escâner de microTC e equipamentos para descalcificação.
- A padronização entre equipes exige protocolos de coloração e análise de imagens harmonizados entre as equipes de histologia e in vivo.
- As considerações para adaptação entre sistemas modelo incluem a verificação da especificidade do Cre e das vias compensatórias em outros modelos de osteoclastos.
- As limitações práticas incluem o processo demorado de descalcificação e seccionamento, além da possível compensação no desenvolvimento em modelos constitutivos.
