Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional
July 3rd, 2020
Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.
Modelos de camundongos geneticamente modificados são ferramentas poderosas para estudar os mecanismos de doenças humanas in vivo. A análise do fenótipo esquelético de camundongos é a base da pesquisa esquelética. Esta partícula descreve algumas técnicas típicas para analisar o fenótipo esquelético que podem ser interessantes para aqueles que são novos na pesquisa de tecidos esqueléticos.
Ao tentar essa partícula, lembre-se de que os experimentos com animais levam tempo, portanto, colete o máximo possível de amostras de alta qualidade durante cada experimento, mesmo que você não precise delas a curto prazo. Comece colocando um camundongo sacrificado em decúbito dorsal e deslocando suavemente as articulações bilaterais do quadril com a mão. Use uma tesoura oftálmica para cortar verticalmente a pele da tíbia distal e, em seguida, remova toda a pele do membro posterior.
Corte o ligamento articular da articulação do quadril direito e da articulação do joelho com uma tesoura para separar o membro posterior. Em seguida, corte o osso em ambas as extremidades para mergulhar totalmente o osso em 4% de PFA. Corte o trocânter e a junção da fíbula.
Mergulhe o membro posterior em 4% PFA, mantendo o membro posterior direito para seccionamento em parafina. Corte os ligamentos articulares das articulações do quadril esquerdo e do joelho com uma tesoura e remova suavemente o tecido mole. Separe a tíbia e o fêmur e mergulhe-os separadamente em etanol a 75%.
Mantenha o fêmur para microtomografia computadorizada e as tíbias para marcação dupla de calceína e vermelho de alizarina. Para preparar as seções de parafina, lave suavemente o membro posterior direito fixo três vezes com PBS por 10 minutos por lavagem. Em seguida, descalcifique-o em 15% EDTA com um descalcificador ultrassônico por três a quatro semanas até que os ossos possam ser dobrados, substituindo o fluido descalcificante a cada dois dias.
Após a descalcificação, lave os espécimes três vezes com PBS e mergulhe-os em etanol a 75% a quatro graus Celsius durante a noite. No segundo dia, mergulhe sequencialmente as amostras em etanol a 95%, etanol a 100% e xileno por uma hora cada. Mergulhe os espécimes em meio xileno e meio parafina por 30 minutos, depois em parafina a 65 graus Celsius durante a noite.
Para embutir o espécime, mergulhe-o em parafina, colocando o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90 graus. Quando a parafina esfriar completamente, remova as amostras do tanque de incorporação. Numere-os e armazene-os a 20 graus Celsius negativos durante a noite.
Asse as seções de parafina a 65 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, descere-as mergulhando-as em xileno por 10 minutos. Mergulhe as seções três vezes com xileno fresco de cada vez. Reidrate as seções mergulhando-as sequencialmente em etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% e água destilada por cinco minutos cada.
Prepare a solução de coloração usando o kit de coloração TRAP e aqueça-a a 37 graus Celsius. Adicione 50 a 100 microlitros de solução de coloração a cada seção e incube-os em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Verifique o estado de coloração dos osteoclastos sob um microscópio óptico a cada cinco minutos até que os osteoclastos multinucleados vermelhos possam ser vistos.
Em seguida, termine a reação com água. Contra-core as seções em solução de hematoxilina por 30 segundos e crie uma cor azul estável mergulhando-as em solução de amônia a 1% por um minuto. Em seguida, enxágue-os em água corrente lentamente.
Monte as seções usando lamínulas com bálsamo neutro e seque-as durante a noite. Capture de três a cinco campos de visão com um microscópio e analise o perímetro trabecular com a imagem J.Use a ferramenta de linha reta para medir o comprimento da barra de escala como L1. Em seguida, use a ferramenta de linha segmentada para medir o comprimento do perímetro trabecular como L2. Calcule o comprimento físico e conte o número de células positivas para TRAP com mais de três núcleos. Após a fixação, lave suavemente as tíbias três vezes com PBS e mergulhe sequencialmente os espécimes em etanol a 95%, etanol a 100% e xileno por cinco minutos cada.
Mergulhe os espécimes em acetona por 12 horas e metade acetona e metade resina por duas horas, e em resina pura em um forno de secagem durante a noite. Adicione resina pura em um tanque de inclusão de gel de sílica adequado e coloque as amostras no tanque evitando bolhas. Polimerizar a resina em um forno de secagem a 60 graus Celsius por 48 horas.
Corte as amostras em seções de cinco micrômetros de espessura continuamente com um micrótomo rotativo e armazene o restante das amostras com dessecante em temperatura ambiente. Cole as seções com uma pinça em uma gota de 75% de etanol e monte-as com lamínulas usando bálsamo neutro. Capture a rotulagem de fluorescência vermelha e verde com um microscópio de fluorescência.
Camundongos com deleção Stat3 específicos para osteoclastos foram gerados para estudar a influência da deleção Stat3 na diferenciação de osteoclastos. A reconstrução femoral e a análise quantitativa por micro CT indicaram que a massa óssea dos camundongos Stat3 Ctsk estava aumentada em comparação com os camundongos selvagens. A histomorfologia do fêmur de camundongos selvagens e Stat3 Ctsk foi examinada por meio de coloração H e E.
A atividade osteoclastogênica foi detectada usando a coloração TRAP. Os osteoclastos são grandes células positivas para TRAP com múltiplos núcleos. O número de osteoclastos positivos para TRAP foi menor em camundongos Stat3 Ctsk, em comparação com camundongos do tipo selvagem, indicando que a deficiência de Stat3 prejudicou a formação de osteoclastos.
A osteogênese foi medida com marcação dupla de calceína e vermelho de alizarina. A área entre a fluorescência da calceína e do vermelho de alizarina representa o osso recém-formado. O Stat3 deletado em osteoclastos não influenciou o anabolismo ósseo.
Cortes de parafina sagital em que a cartilagem mais tarde era simétrica e que mostraram que uma linha clara em forma de M foi usada aqui. Para os estudos, incluiremos mais características do sistema esquelético, como propriedades mecânicas.
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Visão Geral
Este estudo explora os papéis de genes críticos na atividade dos osteoclastos usando modelos de camundongos geneticamente modificados. O protocolo descreve técnicas para analisar fenótipos esqueléticos e enfatiza a importância de amostras biológicas de alta qualidade.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia óssea
- Diferenciação de osteoclastos
- Regulação genética da remodelação óssea
Fundamentos
- Importância dos osteoclastos na saúde esquelética
- Uso de camundongos transgênicos para modelar doenças humanas
- Necessidade de protocolos experimentais rigorosos
Métodos Utilizados
- Análise do esqueleto usando uma variedade de técnicas histológicas
- Modelos de camundongos transgênicos (camundongos Stat3 Ctsk)
- Coloração TRAP, varredura micro CT e dupla marcação para medição da formação óssea
Principais Resultados
- A deficiência de Stat3 reduziu a formação de osteoclastos
- Massa óssea aumentada em camundongos Stat3 Ctsk em comparação com o tipo selvagem
- O estudo valida o papel do gene na diferenciação dos osteoclastos e sugere um mecanismo para a regulação da massa óssea
Conclusões
- Este estudo demonstra como a regulação gênica pode impactar o comportamento dos osteoclastos e a saúde óssea geral.
- Os resultados são significativos para abordagens terapêuticas em doenças relacionadas à perda óssea.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding osteoclast-specific gene function enables mechanistic de-risking in bone-targeted therapeutic development. Conditional knockout models provide predictive confidence for target validation by isolating cellular contributions to bone remodeling. This approach supports preclinical assessment of anabolic versus catabolic pathway modulation in osteoporosis drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis regarding STAT3's role in osteoclast differentiation and bone resorption.
- Operational Value: Enables functional target validation through cell-specific genetic ablation in vivo.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking STAT3 loss to reduced osteoclast formation and increased bone mass.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (bone tissue) for downstream assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs (TRAP+ cell count, bone area, microCT metrics) for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness through standardized histology and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system continuity from genetic target modulation to skeletal phenotype.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring both resorption (TRAP) and formation (calcein/alizarin) endpoints.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone mass regulation via osteoclast-specific pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of osteoclast-intrinsic gene function and pathway clarification in bone homeostasis.
- Discovery Biology: Explains how conditional deletion supports hypothesis testing of STAT3 in osteoclasts and biological de-risking of resorption targets.
- Screening: Describes assay readiness via standardized tissue preparation and quantitative histomorphometry for compound screening.
- Analytics: Highlights microCT, TRAP staining, and dual-labeling as quantitative readouts that enable cross-condition comparison of bone phenotype.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to preclinical continuity through integrated resorption and formation analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating osteoclast-specific targets in bone disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in osteoclast regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of skeletal phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bone therapeutics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on on-target mechanism validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse genetics, bone histology, and microCT analysis.
- Instrumentation needs include microtome, fluorescence and light microscopes, microCT scanner, and decalcification equipment.
- Cross-team standardization requires harmonized staining protocols and imaging analysis between histology and in vivo teams.
- Adaptation considerations across model systems include verifying Cre specificity and compensatory pathways in other osteoclast models.
- Practical limitations include time-intensive decalcification and sectioning, and potential developmental compensation in constitutive models.
