Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

O objetivo geral deste método estrutura-função é dissecar em nível molecular o papel de diferentes domínios de proteínas, ou mutações de relevância para doenças, em células-tronco embrionárias de camundongos virgens ou diferenciadas. Este método pode ajudar a revelar como diferentes resíduos ou domínios de uma proteína podem contribuir para sua função em um determinado contexto celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o direcionamento muito eficiente de construções de resgate para o genoma de células-tronco embrionárias nocauteadas, ou células ES, e a investigação de seu papel em diferentes tipos de células.

Para conseguir isso, combinamos três tecnologias altamente eficientes. Isso inclui isolamento aprimorado de células-tronco embrionárias de camundongos, montagem de fatores de direcionamento baseados em recombinação e direcionamento de células ES por meio de troca de mediada por recombinação, ou RMC. Demonstrando alguns dos procedimentos estará Jinke D'Hont, um técnico do meu laboratório.

A troca de mediada por recombinação, ou RMCE, permite o intercâmbio de fragmentos de DNA entre um vetor e um locus genômico. O RMCE aproveita os locais de recombinação heteroespecíficos que não reagem de forma cruzada e que estão embutidos em um locus genômico. Na presença de um plasmídeo doador que contém um fragmento de DNA flanqueado pelos mesmos sítios heteroespecíficos, a recombinase inserirá esse fragmento de DNA no locus genômico compatível com RMCE devido à dupla translocação simultânea.

Somente após a recombinação correta, o gene de resistência à neomicina sem promotor preso no local de ancoragem do Rosa 26 será restaurado por meio de um promotor PGK no vetor de direcionamento de entrada, que torna a resistência aos medicamentos. Este sistema de armadilha de resistência à neomicina resulta em uma eficiência de direcionamento muito alta, geralmente perto de 100% No dia anterior ao isolamento do blastocisto, adicione 0,1% de gelatina a 12 placas bem cultivadas. E incube-os a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Aspirar a solução de gelatina. Em seguida, semeie um quarto de um frasco de fibroblastos embrionários de camundongo P2, ou MEFs, em meio MEF e divida sobre a placa de 12 poços. Incube as placas de 12 poços de MEFs em dois mililitros de meio MEF a 37 graus Celsius.

E cresça as células em uma monocamada confluente. Em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro de semente de mitomicina aos poços. E incubar as culturas por três horas a 37 graus Celsius, para inativar as células.

Depois de selecionar camundongos knock out heterozigotos contendo um RMCE no locus Rosa 26 de acordo com o protocolo de texto, configure acasalamentos para criar camundongos knockout heterozigotos compatíveis com RMCE, com camundongos knock out heterozigotos. Na manhã seguinte, verifique se há tampões de cópula levantando a fêmea pela base do conto e examine a abertura vaginal em busca de uma massa esbranquiçada. Se o plugue for difícil de ver, com uma sonda angular, abra levemente os lábios da vulva e, em seguida, separe as fêmeas conectadas de seus machos.

Coletar blastocistos aos 3,5 dias pós-coito, ou DPC. Depois de sacrificar as fêmeas grávidas, faça uma incisão no meio ventral e use tesouras finas e fórceps para dissecar o útero e o oviduto. Em seguida, dobre uma agulha de calibre 26 em um ângulo de 45 graus presa a uma seringa de 1 mililitro cheia de meio M2.

E insira a agulha na extremidade do útero mais próxima do oviduto. Use uma pinça fina para segurar a agulha no lugar enquanto empurra o êmbolo para liberar os blastocistos do útero para a tampa de um prato de 10 centímetros. O útero vai inchar, se o rubor for bem-sucedido.

Use uma pipeta bucal para coletar todos os embriões em uma gota de meio M2 e lave os embriões duas vezes em uma gota de meio M2. Imediatamente após a lavagem dos embriões, use PBS, para lavar as células inativadas da mitomicina-C duas vezes. Em seguida, usando uma pipeta bucal, coloque cada blastocisto em um poço separado dos MEFs tratados com mitomicina-C, em meio celular SRES, suplementado com pluripotente ou 2I.

Incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Atualize o meio celular SREF a cada dois ou três dias. Examine cada blastocisto sob um microscópio estéreo com ampliação de 4X e verifique se há eclosão e desprendimento da camada de MEF.

Após 10 a 12 dias de cultura, sob um microscópio estereoscópico, use uma pipeta P10 com pontas descartáveis, para coletar excrescências individuais de icium. Transfira cada crescimento para aproximadamente 10 microlitros de meio para uma placa de 96 poços em forma de V, contendo 30 microlitros por poço de PBS. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitros de 0,25% de tripsina a cada poço.

E incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três minutos. Adicione 100 microlitros de meio de células ES contendo FPS pré-incubado e dissocie as protuberâncias de icium em células únicas pipetando de 10 a 15 vezes. Em seguida, transfira as células dissociadas para placas de MEF de 96 poços tratadas com mitomicina-C.

No dia seguinte, altere a mídia baseada em SR. Expanda as células ES de maneira semelhante de placas de 24 para 6 poços. Depois de identificar os vetores de CDNA resgatados de acordo com o protocolo de texto, prepare uma reação LR de 10 microlitros usando 100 nanogramas de vetor de CDNA de resgate, 150 nanogramas de vetor de RMCEDV1 pré-excisado e dois microlitros de mistura de recombinase, contendo uma integrase codificada por fago, uma excisão e um fator hospedeiro de integração bacteriana.

Incube a reação a 25 graus Celsius por duas horas. Para transformar os vetores recombinados, adicione 5 microlitros de cada mistura, a 40 microlitros de bactérias E.Coli competentes em choque térmico, em um tubo de tampa de rosca com rodapé de 2 mililitros. E incube a amostra no gelo por 20 minutos.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione um mililitro de meio LB ao tubo e incube as células a 37 graus Celsius por uma hora. Placa de 50 microlitros em placas de ágar com ampicilina.

E crescem a 37 graus Celsius durante a noite. Identifique colônias com o vetor de direcionamento correto usando uma ponta P200 para escolher aleatoriamente cinco colônias. Transfira a ponta para um tubo de ensaio de vidro contendo dois a cinco mililitros de meio LB e cresça durante a noite a 37 graus Celsius.

Depois de extrair o DNA de cada colônia, valide as amostras digerindo 0,5 a dois microgramas de DNA e separe as amostras em um gel de agarose a 1%. Inicie uma cultura de células ES knock out compatíveis com RMCE e passe-as pelo menos duas vezes em MEFs, em meio de células ES baseado em FBS. Em seguida, divida as células ES em uma placa gelatinizada de seis poços.

No dia seguinte, use 1,5 mililitros de meio de célula ES à base de FBS para refrescar as células ES que são cerca de 50% confluentes. Combinar um micrograma de vetor alvo de RMCEDV1 pré-excisado, contendo CDNA de resgate, e um micrograma de plasmídeo de expressão FLIPe, em 250 microlitros de meio DMEM puro. Adicione sete microlitros de reagente de transvecção à base de lipofectina a 250 microlitros de meio DMEM puro.

E incube a solução por cinco minutos em temperatura ambiente. Combine as soluções de DNA e lipofectina. E incube a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos.

Em seguida, pipete a mistura de transvecção nas células ES refrescadas e gire suavemente. Um dia após a transvecção, divida todas as células ES do tubo em uma placa de cultura de 10 centímetros, com uma camada confluente de DR4 MEFS e 10 mililitros de meio de célula ES baseado em FPS. Dois dias após a transvecção, selecione clones de células ES com a troca de mediada por FLIP-e correta, adicionando G418 ao meio.

Como mostrado aqui, a matança maciça de colônias não-alvo deve ser visível após três a cinco dias. As colônias devem aparecer após sete a 10 dias. Escolha essas colônias, expanda-as e verifique os clones conforme demonstrado anteriormente neste vídeo.

Para diferenciar as células ES em corpos embrióides, ou EBs, após a cultura, as células ES nocauteadas com construções de resgate conduzidas por Rosa 26 de acordo com o protocolo de texto, permita que os EBs se formem nas placas não aderentes por 30 dias. Atualize o meio a cada dois ou três dias, transferindo a suspensão EB para um tubo de 50 mililitros. E deixe os EBs se estabelecerem por gravidade.

Remova o sobrenadante, adicione meio fresco e transfira a suspensão EB para um prato de grau bacteriano. Analisar as células ES e EBs por imunofluorescência e TEM, de acordo com o protocolo de texto. Usando o método da função estrutura, cinco vetores de direcionamento de RMCEDV1 pré-excisados foram gerados com uma eficiência de 100% e essas construções de resgate foram direcionadas via RMCE, para P120 catenina nocautear células ES, com uma eficiência de 97% A morfologia cística do EB pode ser usada como uma leitura fenotípica para rastrear diferentes construções de resgate.

Como prova de conceito, a isoforma 1A da catenina P120 impulsionada por R26 resgatou o fenótipo nocaute da catenina p120. Para testar se a ancoragem da membrana independente da E-caderina da catenina P120 permitiu a formação de EB csilítica, o motivo de direcionamento da membrana k-ras, CAAX, foi fundido ao terminal carboxi da catenina P120 e introduzido via RMCE, para P120 catenina nocautear as células ES, antes que os EBs fossem feitos a partir delas. No entanto, essa construção serve a um negativo dominante que não permite a ligação e estabilização da E-caderina.

E, como consequência, não resgata o fenótipo nocaute da catenina p120. A transição epitelial-mesenquimal, ou EMT, é um processo de desenvolvimento essencial que também ocorre durante a diferenciação das células ES. Quando expressos em células ES nocauteadas por catenina p120, os indutores EMT, ZEB1, ZEB2 ou caracol que podem reprimir diretamente vários genes marcadores epiteliais como a E-caderina, falharam em restaurar a formação de EB cística.

Uma vez dominadas, as células ES compatíveis com RMCE podem ser isoladas dentro de um mês. Vetores de direcionamento compatíveis com RMCE podem ser gerados em uma semana, e o resgate direcionado de células ES pode ser alcançado em um mês usando esta técnica, se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o RMCE para realizar estudos de função estrutural em células-tronco embrionárias virgens ou diferenciadas.