Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

A espectrometria de massa por imagem MALDI é um avanço único no campo da metabolômica que nos permite medir e visualizar a abundância e distribuição relativa de metabólitos, que são indicativos de organismos, condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem do MALDI Imaging é sua capacidade de detectar metabólitos em C2 sem a necessidade de rotulagem. Demonstrando o procedimento, temos você Sami Sauma, um estudante de pós-graduação do laboratório da Dra. Patricia Casita.

Yuki Chen e Kelly Veerasammy, estudantes pesquisadores do meu laboratório. Após a colheita, imediatamente colocado o tecido em um barco de folha de alumínio resfriado com nitrogênio líquido e uma caixa de poliestireno. Feche a tampa da caixa de poliestireno para congelar o tecido por 2 a 10 minutos, de acordo com o tamanho do tecido.

Quando o tecido estiver suficientemente congelado, use uma pinça para remover o barco e transportar o tecido preso dentro da folha em gelo seco para o criostato. Antes de seccionar o tecido, tomando cuidado, para não respirar nas lâminas. Use luvas e um voltímetro ajustado para resistência para testar a condutividade do número apropriado de lâminas de vidro revestidas de óxido de índio e estanho compatíveis com MALDI para a análise.

Após a rotulagem, coloque as lâminas em uma toalha de papel limpa e um criostato limpo com etanol a 70% ajustado para menos 20 graus Celsius. Coloque a amostra de tecido no criostato e defina a temperatura da câmara do criostato e da cabeça da amostra, de acordo com o tipo de tecido. Depois de permitir que o tecido se equilibre por 30 minutos, use o composto de incorporação de tecido criogênico para montar o tecido no mandril.

E coloque e trave uma lâmina limpa no palco, ajuste a posição do palco e o ângulo da amostra para obter o ângulo de corte desejado. E seccione o tecido até que a região de interesse seja revelada. Quando a região desejada for alcançada, obtenha seções de 10 a 12 mícrons de espessura, usando uma escova pré-resfriada para coletar cuidadosamente, mas rapidamente, cada seção no lado rotulado de cada lâmina à medida que são adquiridas.

Coloque um dedo sob as corrediças para aquecer as seções, para garantir uma montagem segura na corrediça. As seções ficarão transparentes em 5 a 10 segundos e ficarão opacas após cerca de 30 a 60 segundos. Quando todas as seções tiverem sido coletadas, coloque as lâminas no suporte da lâmina e leve gelo seco a um profanador.

Alternativamente, os slides podem ser transportados em uma caixa de vácuo. Coloque as lâminas em um profanador com dessecante e seque as lâminas a vácuo por 45 a 60 minutos. Após a secagem, se não for usar imediatamente, coloque as lâminas no transportador de lâminas e encha o transportador com nitrogênio.

Sele o suporte com parafilme e coloque-o em um saco com zíper. Em seguida, coloque o primeiro saco com zíper em um segundo saco com zíper rotulado contendo dessecante para armazenamento de 80 graus Celsius negativos por até seis meses. Após a desidratação, use um marcador prateado em negrito para colocar marcas X nos espaços em branco das lâminas fora das seções de tecido e use um marcador preto de ponta fina para colocar um segundo X preto em cima de cada X prateado.

Delineie o local da amostra na tampa plástica e coloque a lâmina e o alvo MALDI na superfície de um scanner de mesa. Em seguida, visualize o slide e selecione a área desejada. Digitalize o slide em escala de cinza de 16 bits, em 2.400 pontos por polegada e salve a imagem para uso posterior.

Para aplicar a matriz nas lâminas, ligue uma unidade de pulverização automática de matriz, certificando-se de que a válvula esteja posicionada em carga, e inicie o software do pulverizador. Verifique se o exaustor está funcionando corretamente e confirme na guia de comunicação se o sistema está se comunicando corretamente. Ligue a bomba de solvente a 100 microlitros por minuto com uma contrapressão de aproximadamente 500 libras por polegada quadrada.

E defina o tanque de nitrogênio para 30 libras por polegada quadrada para iniciar o fluxo de ar comprimido para o pulverizador de matriz. Ajuste o regulador de pressão na frente do pulverizador para 10 libras por polegada quadrada e defina a temperatura do bico do pulverizador conforme desejado. Com a válvula e a posição de carga, use a seringa para lavar o laço com sete mililitros de metanol a 70% antes de encher o laço com seis mililitros por matriz.

Coloque uma lâmina de vidro em branco no suporte e no pulverizador, prendendo as duas extremidades com fita adesiva para evitar movimentos e verifique se a vazão e a temperatura estão estáveis. Pressione start para definir a temperatura do bico e ajustar a vazão da bomba, para corresponder ao método selecionado. Mude a válvula de carga para pulverização e clique em continuar.

Permitiu que o sistema fosse executado até a conclusão. Quando a deposição terminar, mude a válvula de spray para carga e clique em continuar. Examine o padrão de codificação da matriz sob um microscópio.

Se uma camada uniforme de cristal de matriz fina for observada, deposite a matriz nas lâminas de amostra apropriadas, conforme demonstrado. Quando todas as lâminas tiverem sido tratadas, limpe o sistema de acordo com as instruções do fabricante para evitar o entupimento do bico do pulverizador. Aqui, são mostradas as imagens de saída da análise de dados de imagem MALDI MS de espectros de descarga de massa selecionados a cada intervalo de 100 Dalton, representando claramente a utilidade para a identificação de espectros de metabólitos de moléculas pequenas a lipídios de alto peso molecular.

Cada estrada descreve os respectivos mapas de calor iônico contendo informações espaciais e espectrais de uma espécie específica de metabólito em três tecidos coletados nos dias 1, 21 e 60 pós-natais. Um ponto forte da metodologia MALDI MSI é a capacidade de discernir a especificidade de certas espécies identificadas pela relação massa/carga com marcos de desenvolvimento ou estruturas anatômicas específicas. Nesta análise, observou-se que alguns metabólitos foram enriquecidos em neonatos pós-natais no primeiro dia ou adultos no 60º dia pós-natal, ou uniformemente distribuídos nas idades testadas.

Observou-se que outras espécies moleculares são especificamente enriquecidas em substância cinzenta, substância branca ou líquido cefalorraquidiano e ventrículos. A distribuição espacial de metabólitos representativos, incluindo hipoxantina, ácido glutâmico, ácido N-acetil aspártico, ácido araquidônico e vários lipídios também foi analisada. Para manter a fidelidade dos stata metabólicos, a dissecação, armazenamento e seccionamento apropriados da amostra são cruciais para prevenir alterações metabólicas artificiais.

Depois de realizar seu experimento MALDI, você pode querer verificar as identidades dos metabólitos encontrados. Isso pode ser alcançado por microextração e cromatografia líquida em tandem MS. O MALDI MS Imaging facilita a investigação baseada em metabolômica com resolução espacial e oferece aos investigadores a oportunidade de verificar dados metabólicos em um meio quantitativo e visual. Recentemente, há muito interesse no efeito da dieta em distúrbios neurodegenerativos, a relação entre o microbioma intestinal e o cérebro.

E assim tem havido uma tremenda importância do estudo do metabolismo na neurociência, desde o desenvolvimento neurológico até a neurodegeneração. O principal fato da interação intestino-cérebro. E é nesse contexto que a ideia da instalação MALDI Imaging pode realmente fornecer tecnologias excepcionais para visualizar o efeito que uma manipulação específica pode ter no cérebro.