Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

Glioma stem As células-tronco são sub-população de células no glioma, que geralmente são resistentes à quimioterapia e radioterapia. Aqui descrevemos o método de identificação rápida de terapias combinadas, visando células-tronco glioma, em vez de células glioma diferenciadas. Comparado com outros métodos, o que pode ser um trabalhoso e complicado.

Este protocolo é relativamente simples e rápido, para identificar potenciais combinações de drogas úteis. Comece coletando as células-tronco de glioma ou GSCs do meio de cultura, e centrifugando-as a 70 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Depois de remover o supernante, digerir as células com accutase por quatro minutos a 37 graus Celsius.

Usando uma ponta de 200 microliter, pipeta as células repetidamente para dissociar, e resuspensar a pelota celular. Adicione os GSCs a uma densidade de 200.000 células em um mililitro de cultura média, em cada poço de uma placa de cultura de 12 poços, e incuba-los durante a noite. Oh no dia seguinte, adicione 30 microliters de luciferase-eGFP vírus supernante em cada poço da placa.

Centrifugar as células a 1000 vezes G por duas horas, a 25 graus Celsius e incuba-las durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio nos poços coletando os GSCs, centrifugando-os, removendo o supernascimento, reutilizando-os em meio fresco e ressuculando-os. Cultue as células por mais 48 horas.

Observe a placa sob um microscópio fluorescente e confirme o aparecimento de células GFP positivos. Classifique e colete os GSCs com uma alta fluorescência usando um classificador de células de fluxo e cultuá-los ainda mais. Cubra, 96 placas de fundo ópticas com uma mistura de matriz extracelular, como o matrigel, e incuba-as por uma hora a 37 graus Celsius.

Remova a mistura em excesso e enxágue suavemente as placas uma vez com PBS, em seguida, sementes células XG387-Luc a uma densidade de 1000 células em 100 microliters de meio cultura, e para cada poço das placas revestidas e cultuá-las durante a noite. No dia seguinte, observe as células sob um microscópio para confirmar sua ligação com a placa. Em seguida, prepare uma solução de 200 temozolomidas de micromolar e duas soluções micromolar dos agentes alvos, no meio da cultura.

Para a triagem combinada de drogas, remova o meio em branco e adicione o meio contendo 200 temozolomida micromolar ou dois agentes-alvo micromolar, ou uma combinação de ambos, em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias. Tire imagens da bioluminescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS.

Usando o software embutido, crie várias áreas circulares da região de interesse e quantifique a bioluminescência celular. Para identificar potenciais candidatos que poderiam aumentar o efeito antiglioblastoma do temozolomide, 20 inibidores seletivos de pequenas moléculas foram analisados através da triagem de combinação de drogas. Os valores de índice sensíveis de 13 agentes-alvo estavam acima de zero e cinco deles acima de 0,1.

O índice sensível das duas principais drogas candidatas UMI-77 e A 83-01, foram superiores a 0,25, sugerindo seu potencial de sinergizar com temozolomide. O tratamento combinado de temozolomida e UMI-77 foi avaliado utilizando um ensaio anti-proliferativo em uma matriz de titulação de seis por seis doses. Os valores do índice de combinação foram inferiores a um.

E os altos valores de agente único foram maiores que zero para a maioria das combinações de temozolomide e UMI-77 em diferentes concentrações. Sugerindo uma interação sinérgica geral de temozolomide e UMI-77 em GSCs XG387 e XG328. Este protocolo também pode ser aplicado em encontrar combinação de drogas usando células cancerígenas aderentes, simplesmente removendo a etapa de revestimento da placa.