Name: Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a avaliar os efeitos de agroquímicos em rainhas de abelhas de mel usando o sistema de gaiolas de monitoramento QMC. Este protocolo controlado permite medir a produção de ovos e a eclosão larval após exposição subletal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obrigado ao Dr. Amy Cash-Ahmed, Nathanael J. Beach e Alison L. Sankey por sua ajuda na realização deste trabalho. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e empregador. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa # HR0011-16-2-0019 para Gene E. Robinson e Huimin Zhao, projeto do USDA 2030-21000-001-00-D, e a Experiência de Pesquisa de Plasticidade Fenotípica para Estudantes Universitários Comunitários da Universidade de Illinois em Urbana Champaign.

1. Montagem QMC
<ol><li>Monte QMCs de partes(Figura 1A) com uma única placa de colocação de ovo (ELP) inserida conforme mostrado na Figura 1B. Não adicione tubos de alimentação até que os trabalhadores tenham sido adicionados à gaiola. Cubra temporariamente os 4 orifícios do alimentador com fita de grau de laboratório.</li>
	<li>Insira o excludente de plantas e a porta da câmara de alimentação sobre a câmara de alimentação para evitar que a rainha entre na câmara de alimentação e entre em contato com a dieta tratada. Consulte Fine et al.32 para obter mais detalhes da montagem.</li>
	<li>Colete as molduras do pente de cera contendo a ninhada de trabalhador tampado das colônias de abelhas 24 h antes da eclosão adulta e coloque-as em uma incubadora (34,5 °C) dentro de uma caixa de ninhada. 24 h depois, escove as abelhas escancaradas das molduras e em um recipiente aberto que foi forrado com uma tinta de barreira de insetos (por exemplo, Fluon) para evitar que as abelhas rastejem para fora.</li>
	<li>Adicione pelo menos 50 abelhas em peso (5 g ≈ 50 abelhas44,45) à câmara de colocação de ovos de cada QMC. Para garantir que um conjunto genético diversificado de trabalhadores seja representado no experimento, obtenha um número aproximadamente igual de abelhas operárias de pelo menos três colônias e misture-as antes de adicioná-las aos QMCs. NOTA: Abelhas operárias recém-fechadas com menos de 1 dia de idade não podem voar ou picar devido aos seus músculos de voo subdesenvolvidos e cutícula não encolhida. Se eles forem adicionados nesta idade, não há necessidade de anestesia-los antes do manuseio. Eles podem ser pesados colhendo suavemente abelhas do recipiente usando um pequeno copo de medição de volume de 1/4 e colocando-as em um segundo recipiente (forrado com tinta de barreira de insetos, por exemplo, Fluon) que foi asfaltado em uma escala. A área dos quadros cobertos por ninhadas tampadas deve ser aproximadamente igual para garantir que as colônias de origem sejam igualmente representadas nas populações de trabalhadores da QMC. A homogeneização das abelhas operárias pode ser alcançada escovando abelhas recém-fechadas de quadros retirados de todas as colônias para o mesmo recipiente e permitindo que elas se misturem por 5 minutos antes de adicioná-las aos QMCs.</li>
	<li>Adicione os alimentadores contendo solução de sacarose, água e suplemento de pólen (Ver seção 2).</li>
	<li>Exponha as rainhas acasaladas individuais ao gás CO2 para estimular a colocação deovos 46 e facilitar a transferência para a QMC.<ol>
<li>Use rainhas compradas de um criador comercial dentro de 48 horas após o recebimento. Enquanto a rainha ainda está dentro da gaiola de transporte, coloque-a em um saco plástico transparente. Coloque uma extremidade de um tubo plástico conectado a um botijão de gás CO2 dentro do saco e abra suavemente a válvula do cannister para permitir que o gás CO2 flua.</li>
		<li>Quando o saco estiver inflado com gás, feche simultaneamente a válvula do cannister e mantenha o saco fechado para prender o gás dentro. Mantenha o saco fechado por 30 s ou até que a rainha pare de se mover. Remova a rainha e abra a gaiola de embarque assim que ela for observada inconsciente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abra parcialmente a porta da câmara de colocação do ovo, coloque suavemente a rainha inconsciente dentro e feche a tampa, tomando cuidado para não esmagar a rainha ou os trabalhadores dentro. Adicione a segunda placa de colocação de ovo a cada QMC, conforme mostrado na Figura 1C. Coloque um pedaço de fita de laboratório na parte superior dos dois ELPs para evitar que eles se separem do quadro QMC e impeçam que os trabalhadores saiam da gaiola.</li>
	<li>Coloque as gaiolas em uma incubadora escura com condições ambientais estáveis de 34 ± 0,5 °C e 60% ± umidade relativa, como as condições dentro de uma colônia normal.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62316/62316fig01.jpg"> Figura 1. A: QMC desmontado. B: QMC parcialmente montado com 1 ELP inserido. C: QMC totalmente montado com 2 ELPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62316/62316fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Preparar e administrar dietas atadas com agrotóxicos
<ol><li>Para preparar 1000 g de solução de sacarose de 50% (g/g), coloque uma barra de mexida no fundo de uma garrafa de reagente de vidro 1 L limpa. Adicione 500 g de sacarose e 500 mL de água deionizada. Desaparafusar a tampa da garrafa e use uma placa de mexida aquecida para aquecer a solução até que toda a sacarose tenha dissolvido. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente antes de adicionar as soluções de estoque de agroquímicos.</li>
	<li>Prepare as soluções de estoque de agroquímicos em um solvente apropriado, como a acetona, em uma concentração que pode ser adicionada à dieta para alcançar a concentração final desejada do agroquímico de interesse. NOTA: Ao usar acetona como solvente de veículos, as diretrizes da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) estipulam que a concentração final de acetona na dieta deve ser ≤ 5% para testes crônicos de toxicidade oral em abelhas adultas47. No entanto, alguns solventes como n-metil-2-pyrrolidone5, 31 e sulfóxido de dimetila25 podem exercer efeitos tóxicos abaixo dessa concentração, por isso é recomendado manter as concentrações de solventes o mais baixas possível na dieta do tratamento. Dependendo do volume e tipo de solvente utilizado, pode ser necessário incluir um grupo de controle de solventes e um grupo de controle negativo para garantir que os efeitos potenciais devido à toxicidade do solvente sejam detectados. Ao utilizar produtos formulados, a quantidade do produto utilizado deve ser ajustada com base na concentração presente na formulação. Dependendo da estabilidade do agroquímico de interesse no solvente, as soluções de estoque podem ser mantidas por até 2 semanas a -20 °C.</li>
	<li>Selecione doses subletárias com base nos resultados do Teste da OCDE nº 245: Abelha de Mel(Apis mellifera L.), Teste de Toxicidade Oral Crônica (Alimentação 10 Dias)47, e identifique a literatura relevante consultando a base de conhecimento Ecotox48.</li>
	<li>Administrar os tratamentos agroquímicos em uma solução de sacarose, um suplemento comercial de pólen (se disponível em pó), ou ambos. Prepare a dieta experimental para uso no mesmo dia adicionando uma quantidade adequada de solução de estoque à solução de sacarose de 50% de sacarose (w/w). Misture bem pelo vórtice ou com uma barra de mexida definida em velocidade média. Para suplementos de pólen, adicione a solução de sacarose atada agroquímica ao suplemento em pó em vez do xarope de acordo com os protocolos do fabricante, certificando-se de ajustar o volume da solução de estoque usada de acordo com o peso final da dieta do pólen. Consulte a Tabela 1, por exemplo, os cálculos.</li>
	<li>Prepare os tubos alimentador a partir de tubos de microcentrifuuge de 2 mL.<ol>
<li>Para alimentadores de dieta líquida, aqueça a ponta de uma agulha de calibre 20 em uma placa quente/fogão e perfure o fundo do tubo duas vezes. Feche a tampa do tubo e a pipeta aproximadamente 1,5 mL de solução de sacarose ou água através de um dos furos de punção. Coloque o tubo para baixo com o lado perfurado até que seja adicionado ao QMC.</li>
		<li>Para alimentadores de suplementos de pólen, use uma lâmina de barbear para cortar o fundo do tubo. Feche a tampa e empurre uma bola de 1-2 g de suplemento de pólen no tubo até que toque a tampa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registo os pesos do alimentador antes de colocá-los nos QMCs. Não mantenha a dieta não atenuada a 4 °C por mais de 48 horas.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentração Desejada</td>
			<td>Concentração de veículos solventes desejados</td>
			<td>Volume final desejado/massa de solução de sacarose</td>
			<td>Voume de solução de estoque</td>
			<td>Imidacloprid em solução de estoque</td>
			<td>Receita de solução de estoque sugerida</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de sacarose</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td>0,05% (v/v)</td>
			<td>81,45 mL/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,001 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento de pólen</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0001 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de sacarose</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td>0,05% (v/v)</td>
			<td>78,5 mL/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,005 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento de pólen</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0005 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Exemplo de receitas para solução de sacarose tratada, suplemento de pólen e solução de estoque. *Volume baseado na densidade de 50% (w/w) solução de sacarose (1.228 g/mL). **A densidade do suplemento de pólen vai variar dependendo do produto utilizado, mas se esse volume de solvente for utilizado, a concentração final de solvente no suplemento de pólen estará dentro da faixa desejada de ≤ 5% em volume.
3. Monitoramento - Taxa de Produção de Ovos
<ol><li>Quantifique o ovo deitado de 1 a 2 vezes por dia pela manhã e/ou à noite. Comece removendo QMCs da incubadora para verificar se há ovos. NOTA: Em um experimento bem-sucedido, a produção de ovos começará na maioria dos QMCs de controle dentro de 3 dias após a montagem inicial da gaiola. Basta tirar o máximo de QMCs da incubadora ao mesmo tempo que pode ser verificado e alimentado dentro de 10 minutos. Períodos mais longos fora da incubadora podem interromper a produção de ovos.</li>
	<li>Examine as costas dos ELPs claros para ovos. Se os ovos estiverem presentes, remova o painel da porta em frente à placa de interesse. Remova a fita através dos ELPs e deslize cuidadosamente o painel da porta entre o ELP e as abelhas dentro do QMC, tomando cuidado para não esmagar nenhuma abelha que possa estar limpando as células nos ELPs.</li>
	<li>Com o painel da porta no lugar, remova o ELP e conte e regise o número de ovos dentro das células ELP. Remova os ovos tocando a borda do ELP, abra o lado celular para baixo, em uma superfície dura (como o lábio de um recipiente de resíduos). Uma vez que os ovos caiam, substitua o ELP vazio no QMC. Remova suavemente e substitua o painel da porta atrás do ELP na parte externa do QMC. Repita conforme necessário com o segundo ELP e substitua a fita pelo QMC quando terminar. NOTA: A produção de ovos geralmente diminui e a mortalidade aumenta em QMCs após 2 semanas32,33, portanto, recomenda-se concluir experimentos após 14 dias.</li>
</ol>4. Monitoramento - Consumo de Alimentos
<ol><li>Substitua todos os alimentos restantes em alimentadores QMC por dieta recém-preparada a cada dois dias. Prepare novos tubos alimentadores (incluindo água) e pese-os antes de remover QMCs da incubadora para monitoramento. Troque todos os tubos antigos por novos e pese tubos velhos antes de descartar dieta não consumida. Compare o peso final do tubo alimentador e dieta não consumida com o peso do mesmo tubo alimentador antes de colocá-lo no QMC para estimar o consumo de dieta.</li>
	<li>Entre os dias em que os alimentadores estão programados para serem substituídos, verifique o consumo de dieta uma vez por dia (ao mesmo tempo em que os QMCs são monitorados para a produção de ovos) para garantir que os alimentadores nunca estejam vazios. Se um tubo alimentador estiver vazio ou quase vazio, remova-o, recarregue-o, grave o peso do tubo antes e depois e adicione a diferença ao total de consumo de dieta de 2 dias para o QMC.</li>
</ol>5. Monitoramento - Viabilidade do Embrião
<ol><li>Em um ponto selecionado durante um experimento QMC, remova os ELPs contendo ovos recém-colocados do QMC de acordo com a etapa 3,mas não desaloja os ovos do ELP.</li>
	<li>Cubra o ELP com uma tampa de microplaca universal e coloque-o dentro de um dessecator com uma solução Saturada K2SO4 (150 g K2SO4 em 1 L de água, mantida em um prato raso). NOTA: Um pouco de sal deve ser visível na parte inferior do prato depois que a mistura chegar à temperatura na incubadora.</li>
	<li>Mantenha a desiccadora em uma incubadora fixada em 34,5 °C, resultando em uma umidade relativa de 95% dentro do dessecanteador, semelhante às condições utilizadas por Collins49. NOTA: Quase todos os ovos eclodirão dentro de 72 ± 6 horas após a49ª,portanto, as taxas de eclosão podem ser avaliadas em até 78 horas após a retirada dos ELPs do QMC. Uma larva de forma "C" na parte inferior da célula é indicativo de um evento de incubação bem sucedido. Alguma variação nesse tempo é possível se, por exemplo, os ovos forem drones e não trabalhadores50.</li>
</ol>6. Amostragem do trabalhador
<ol><li>Se os QMCs foram preenchidos com excesso de trabalhadores, prove as abelhas operárias em um ponto de tempo selecionado durante o experimento para avaliação de alterações induzidas pelo tratamento em sua fisiologia. Realizar as coletas em conjunto com atividades diárias de alimentação e contagem de ovos para minimizar o tempo para o qual os QMCs estão fora da incubadora.</li>
	<li>Antes da amostragem, coloque um painel de porta entre um ELP e o interior do QMC e remova o ELP. Levante cuidadosamente o painel da porta aproximadamente 0,5 cm da base da gaiola e remova uma abelha operária de dentro do QMC usando pinças de peso-pena. Para evitar que as abelhas escapem, cubra partes da abertura de 0,5 cm com um dedo enluvado ou um pedaço de algodão conforme necessário.</li>
	<li>Preserve a abelha coletada para análise de seguimento e repita esse processo até que o número desejado de amostras tenha sido coletado. Para análise de expressão genética, o encaixe de abelhas congelantes em nitrogênio líquido e armazenamento imediato a -80 °C é fortemente recomendado51.</li>
</ol>7. Mortalidade do trabalhador
<ol><li>Avalie a mortalidade do trabalhador durante o experimento contando o número de abelhas mortas no fundo da câmara de alimentação e na câmara de colocação de ovos. Realize esta avaliação em conjunto com a quantificação diária de fixação de ovos.</li>
	<li>Usando fórceps, remova cuidadosamente as abelhas mortas através dos orifícios do alimentador, cobrindo o orifício com um dedo enluvado ou um pedaço de algodão enquanto as fórceps não são inseridas.</li>
	<li>Remova as abelhas mortas da câmara de colocação do ovo levantando cuidadosamente o painel da porta aproximadamente 0,5 cm da base da gaiola e inserindo fórceps. Para evitar que as abelhas escapem, cubra partes da abertura de 0,5 cm com um dedo enluvado ou um pedaço de algodão conforme necessário.</li>
	<li>Avalie a mortalidade do trabalhador na conclusão do experimento removendo e contando todas as abelhas mortas dos QMCs utilizando os métodos descritos anteriormente antes de eutanásia das abelhas restantes. NOTA: Na ausência de abelhas operárias, as rainhas não produzirão ovos e morrerão de fome dentro de 24 horas. Portanto, se todos os trabalhadores em um QMC forem observados mortos, o QMC deve ser removido do experimento. Da mesma forma, se uma rainha morre durante o experimento, o QMC deve ser removido, e os dados devem ser devidamente censurados.</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

A fecundidade de insetos solitários fêmeas, bem como rainhas em colônias de insetos eusociais, pode ser influenciada por estressores abióticos como os agroquímicos25,28,29,30,33. Nas abelhas, os efeitos dos agrotóxicos nas rainhas podem ser indiretos, pois podem ocorrer através de mudanças em seus cuidados e alimentação por abelhas operárias. Nossos resultados...

Devido ao aumento da demanda global por produtos agrícolas, as práticas agrícolas modernas muitas vezes exigem o uso de agroquímicos para controlar inúmeras pragas conhecidas por reduzir ou prejudicar a produção agrícola1. Simultaneamente, os produtores de muitas culturas de frutas, legumes e castanhas dependem dos serviços de polinização fornecidos pelas colônias comerciais de abelhas para garantir a abundante produção de culturas2. Essas práticas podem resultar em polinizadores, incluindo abelhas de mel(Apis mellifera),expostos a níveis nocivos de resíduos de pesticidas3. Ao mesmo tempo, a presença generalizada de infestações de ácaros parasiticos de Varroa em colônias de abelhas frequentemente exigem que os apicultores tratem suas colmeias com miticides, que também podem exercer efeitos negativos sobre a saúde e longevidade da colônia4,5,6. Para reduzir e mitigar os efeitos nocivos dos produtos agroquímicos, é necessário avaliar plenamente sua segurança às abelhas antes de sua implementação para que possam ser feitas recomendações para seu uso para proteger insetos benéficos.
Atualmente, a Agência de Proteção Ambiental (EPA) conta com uma estratégia hierárquica de avaliação de risco para exposição a pesticidas de abelhas, que envolve testes laboratoriais em abelhas adultas e, às vezes, larvasde abelhas 7. Se testes laboratoriais de nível inferior não aliviarem as preocupações de toxicidade, podem ser recomendados testes de campo de nível mais alto e semi-campo. Embora esses testes laboratoriais forneçam uma visão valiosa sobre os potenciais efeitos dos agrotóxicos na longevidade do trabalhador, eles não são necessariamente preditivos de seus efeitos sobre as rainhas, que diferem significativamente dos trabalhadores biologicamente8 e comportamentalmente9. Além disso, existem inúmeros efeitos potenciais de agrotóxicos em insetos além da mortalidade, que podem ter consequências consideráveis para insetos sociais que dependem de comportamentos coordenados para funcionar como uma unidade colônia10,11.
Embora a mortalidade seja o efeito mais comumente considerado dos pesticidas agroquímicos12, esses produtos podem ter uma ampla gama de efeitos tanto em artrópodes alvo quanto não-alvo, incluindo comportamento alterado13,14,15,16, repellency ou attractancy17,18,19, mudanças nos padrões de alimentação20,21,22 , e aumentou ou diminuiu a fecundidade20,21,22,23,24,25. Para insetos sociais, esses efeitos podem interrompa sistematicamente as interações e funções das colônias11. Dessas funções, a reprodução, que é fortemente dependente de uma única rainha que pomente ovos apoiada pelo resto da unidadecolônia 9,pode ser particularmente vulnerável à perturbação devido à exposição a pesticidas.
Estudos realizados em rainhas imaturas demonstraram que a exposição ao desenvolvimento de miticides pode afetar o comportamento da rainha adulta, a fisiologia, a sobrevivência26,27. Da mesma forma, estudos utilizando colônias de tamanho integral ou reduzido demonstraram que os agrotóxicos podem afetar rainhas de abelhas adultas, diminuindo o sucesso do acasalamento28, diminuindo a oviposição29e diminuindo a viabilidade dos ovos produzidos25,30,31. Esses fenômenos têm sido anteriormente difíceis de observar sem o uso de colônias inteiras, devido em grande parte à falta de métodos laboratoriais disponíveis. No entanto, um método para estudar a oviposição da rainha sob condições laboratoriais fortemente controladas usando queen monitoring cages (QMC)32 foi recentemente adaptado para examinar os efeitos dos agrotóxicos na fecundidade rainha33. Aqui, essas técnicas são descritas detalhadamente, juntamente com métodos adicionais para medir e acompanhar o consumo de dieta dos trabalhadores em QMCs.
Esses métodos são mais vantajosos do que experimentos que exigem colônias de tamanho completo porque permitem a administração de doses precisas de agroquímicos para um número muito reduzido de trabalhadores em relação às dezenas de milhares tipicamente presentes dentro de uma colônia34, que então fornece a rainha. Essa técnica de exposição espelha a exposição em segunda mão que as rainhas experimentariam em cenários reais porque, dentro de uma colônia, as rainhas não se alimentam e dependem dos trabalhadores para forregá-los com dieta9. Da mesma forma, as rainhas geralmente não saem da colmeia, exceto durante a reprodução da colônia (enxame) para voos de acasalamento35. Rainhas de abelhas acasaladas podem ser compradas de criadores de rainhas comerciais e enviadas durante a noite. Normalmente, os criadores de rainhas vendem rainhas diretamente depois de confirmar que começaram a colocar ovos, o que é tomado como uma indicação de acasalamento bem sucedido. Se forem necessárias informações mais precisas sobre a idade ou a relação da rainha, os pesquisadores podem consultar o criador da rainha antes de fazer um pedido.
Os QMCs permitem a observação precisa e quantificação da oviposição rainha das abelhas e das taxas de eclosão de ovos32,33, produzindo dados valiosos relacionados aos efeitos da exposição agroquímica na fecundidade da rainha. Os resultados representativos aqui apresentados descrevem um experimento quantificando a oviposição, o consumo de dieta e viabilidade de embriões em QMCs sob exposição crônica a concentrações relevantes de campo do pesticida neonicotinóide neurotoxicista sistêmico imidacloprido36. Uma vez aplicados, o imidacloprido transloca para tecidos vegetais37, e foram detectados resíduos o pólen e o néctar de numerosas plantas polinizados de abelhas38,39,40. A exposição ao imidacloprido pode ter uma ampla gama de efeitos prejudiciais sobre as abelhas, incluindo o desempenho de forrageamento prejudicado16,a função imunológica prejudicada41, e as taxas reduzidas de expansão e sobrevivência da colônia42,43. Aqui, imidacloprido foi selecionado para uso como uma substância de teste porque experimentos de campo mostraram que pode afetar a oviposição rainha das abelhas29

<table><tbody><tr><td>Fluon</td><td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td><td>2871A</td><td></td></tr><tr><td>Rainhas das abelhas</td><td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidacloprid</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>MegaBee Powder</td><td>MegaBee, San Dieago, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>02-682-004</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas calibre 20</td><td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td><td>5FVK4</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato</td><td>de Potássio Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Gaiolas</td><td>de Monitoramento Queen University of Illinois Urbana-Champaign</td><td></td><td>Número do pedido de patente: 20190350175</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de Microplacas Universais</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>5500</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

As estratégias atuais de avaliação de risco para abelhas dependem fortemente de testes laboratoriais realizados em abelhas trabalhadoras adultas ou imaturas, mas esses métodos podem não capturar com precisão os efeitos da exposição agroquímica nas rainhas das abelhas. Como única produtora de ovos fertilizados dentro de uma colônia de abelhas, a rainha é sem dúvida o membro único mais importante de uma unidade colônia em funcionamento. Portanto, compreender como os agrotóxicos afetam a saúde e a produtividade das rainhas deve ser considerado um aspecto crítico da avaliação do risco de pesticidas. Aqui, um método adaptado é apresentado para expor rainhas de abelhas e assistentes de rainha operária a estressores agroquímicos administrados por meio de uma dieta de trabalhadores, seguido pelo acompanhamento da produção de ovos em laboratório e avaliação da primeira eclosão instar utilizando uma gaiola especializada, chamada de Queen Monitoring Cage. Para ilustrar o uso pretendido pelo método, são descritos resultados de um experimento no qual os atendentes da rainha do trabalhador foram alimentados com dieta subletal de imidacloprido e os efeitos nas rainhas foram monitorados.

A produção de ovos foi monitorada em QMCs montadas e mantidas como descrito acima com observações diárias da produção de ovos e 15 gaiolas por grupo de tratamento. Rainhas recém-acasaladas de ações principalmente carniolan foram compradas e enviadas durante a noite de um criador de rainhas, e os trabalhadores das abelhas foram obtidos de 3 colônias mantidas de acordo com métodos comerciais padrão no The Bee Research Facility da Universidade de Illinois Urbana-Champaign. Aqui, Foram utilizados 4 grupos de tratamento dieté...

Este protocolo foi desenvolvido para aprimorar a compreensão de como os agrotóxicos afetam a reprodução das abelhas de mel (Apis mellifera),estabelecendo métodos para expor rainhas das abelhas e seus cuidadores de trabalhadores a agrotóxicos em um ambiente controlado e laboratorial e monitorando cuidadosamente suas respostas relevantes.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

A exposição agroquímica pode ter grandes impactos em todos os membros de uma colônia de abelhas, incluindo o membro mais importante, rainhas. Mas até recentemente, poucas ferramentas estavam disponíveis para estudar esses efeitos. Essa técnica permite que os pesquisadores exponham rainhas a agroquímicos em condições controladas que simulam condições que possam experimentar no campo.É muito fácil perturbar comportamentos de criação de ovos da rainha das abelhas, por isso é importante tomar cuidado ao lidar com trabalhadores e rainhas antes e durante o experimento. Demonstrando esses procedimentos, Amy Floyd e Eliza Litsey, técnicos de laboratório da Unidade de Pesquisa em Saúde de Espécies Invasoras e Polinizadores, Honeybee Research Lab. Para começar, monte gaiolas de monitoramento de rainhas, ou QMCs, inserindo os painéis da porta, em seguida, insira o excludente de rainhas na porta da câmara de alimentação sobre a câmara de alimentação, para evitar que a rainha entre e entre em contato com a dieta tratada.Insira um único ELP. Não adicione tubos de alimentação até que os trabalhadores tenham sido adicionados à gaiola e cubra temporariamente os quatro orifícios do alimentador com fita de grau de laboratório. Depois de coletar e incubar as molduras do pente de cera contendo a ninhada de trabalhador tampado das colônias de abelhas, escove as abelhas fechadas em um recipiente aberto forrado com uma tinta de barreira de insetos, para evitar que as abelhas rastejem para fora.Adicione pelo menos 50 abelhas em peso à câmara de colocação de ovos de cada QMC. Para garantir que uma piscina genética diversificada seja introduzida, obtenha um número semelhante de abelhas operárias de pelo menos três colônias e permita que elas se misturem antes de adicionar abelhas aos QMCs. Adicione os alimentadores contendo solução de sacarose, água e suplemento de pólen.Use rainhas compradas de um criador comercial dentro de 48 horas após o recebimento. Enquanto a rainha ainda está dentro da gaiola de transporte, coloque-a em um saco plástico transparente. Em seguida, coloque uma extremidade de um tubo plástico conectado a um botijão de gás de dióxido de carbono dentro do saco, e gentilmente abriu a válvula do recipiente para permitir que o gás dióxido de carbono flua.Quando o saco estiver inflado com gás, feche simultaneamente a válvula do recipiente e mantenha o saco fechado para prender o gás dentro. Mantenha o saco fechado por 30 segundos ou até que a rainha pare de se mover. Remova a rainha abrindo a gaiola de embarque assim que a rainha estiver inconsciente.Abra parcialmente a porta da câmara de colocação de ovos, coloque suavemente a rainha inconsciente dentro e feche a tampa. Adicione o segundo ELP a cada QMC. Coloque um pedaço de fita de laboratório na parte superior dos dois ELPs para evitar que eles se separem do quadro QMC e impeçam que os trabalhadores saiam da gaiola.Coloque as gaiolas em uma incubadora escura com condições ambientais estáveis de 34 a 35 graus celsius, e 50-70% de umidade relativa. Para administrar a dieta repleta de agrotóxicos, prepare as soluções de estoque de agroquímicos em um solvente adequado, como a acetona, em uma concentração que pode ser adicionada à dieta para alcançar a concentração final desejada do agroquímico de interesse. Administrar os tratamentos agroquímicos em uma solução de sacarose, um suplemento comercial de pólen, ou ambos.Prepare a dieta experimental para uso no mesmo dia, adicionando uma quantidade adequada de solução de estoque à solução de frio ou temperatura ambiente, solução de 50% de sacarose. Misture bem por vórtice a uma velocidade média. Para suplementos de pólen, adicione uma quantidade calculada de solução de estoque de agroquímicos à solução de sacarose e vórtice completamente antes de adicioná-la ao suplemento em pó.Adicione dieta aos tubos alimentador e regissão os pesos do alimentador antes de colocá-los no QMC. Para quantificar a colocação do ovo, comece removendo QMCs da incubadora. Examine as costas dos ELPs claros, se os ovos estiverem presentes, remova o painel da porta em frente à placa de interesse.Remova a fita através dos ELPs e deslize o painel da porta entre o ELP e as abelhas dentro do QMC. Com o painel da porta no lugar, remova o ELP e conte e regise o número de ovos dentro das células ELP. Remova os ovos tocando a borda do ELP de lado aberto para baixo, em uma superfície dura.Uma vez que os ovos caiam, substitua o ELP vazio no QMC. Remova suavemente e substitua o painel da porta atrás do ELP na parte externa do QMC. Repita conforme necessário com o segundo ELP e substitua a fita pelo QMC quando terminar.Para monitorar o consumo alimentar, substitua os alimentos por uma dieta recém-preparada a cada dois dias. Prepare novos tubos alimentador e pese-os antes de iniciar as atividades de monitoramento da produção de ovos. Troque tubos antigos por novos e pese tubos velhos antes de descartá-los.Compare o peso final do tubo alimentador e dieta não consumida com o peso do mesmo tubo, para estimar o consumo da dieta. Verifique uma vez por dia para garantir que os alimentadores nunca estejam vazios. Se um tubo alimentador estiver vazio ou quase vazio, remova-o, recarregue-o, grave o peso do tubo antes e depois, e adicione a diferença ao total de consumo de dieta de dois dias para o QMC.Em um ponto selecionado durante um experimento QMC, remova os ELPs contendo ovos recém-colocados do QMC como descrito anteriormente, mas não desaloja os ovos do ELP. Cubra o ELP primeiro com uma vedação de placa PCR e, em seguida, uma tampa de microplaca universal, e coloque-o dentro de um desiccador com uma solução de sulfato de potássio saturado. Avalie as taxas de incubação aproximadamente 78 horas após a remoção de ELPs do QMC.Uma larva em forma de C na parte inferior da célula é indicativo de um evento de incubação bem sucedido. Se os QMCs foram preenchidos com excesso de trabalhadores, amostrar as abelhas operárias em um ponto de tempo selecionado durante o experimento para avaliar as alterações induzidas pelo tratamento em sua fisiologia. Antes da amostragem, coloque um painel de porta entre um ELP e o interior do QMC e remova o ELP.Cuidadosamente, levante o painel da porta aproximadamente 0,5 centímetros da base da gaiola e remova uma abelha operária de dentro do QMC usando pinças de peso-pena. Para análise de expressão genética, congele as abelhas em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius. Preserve a abelha coletada para análise de acompanhamento e repita esse processo até que o número desejado de amostras tenha sido coletado.As alterações relacionadas ao tratamento do tratamento de imidacloprido dietético na contagem diária de óvulos foram avaliadas pela implementação de uma equação de estimativa generalizada geral do tronco de Poisson, com uma matriz de correlação auto-regressiva. A produção diária de ovos foi significativamente menor em QMCs, dado suplemento de pólen e sacarose contendo 50 partes por bilhão de imidacloprido. Observou-se efeito dependente de dose no número total de ovos produzidos em cada QMC para tratamentos de imidaclopridos administrados tanto em sucrose quanto em suplemento de pólen.Com a maior redução observada nos QMCs, os 50 imidaclopridos de 50 partes por bilhão, seguidos por 10 partes por bilhão em suplemento de pólen mais sacarose. Não foi observada diferença no total de ovos produzidos entre o controle e os QMCs alimentados 10 partes por bilhão de imidaclopridos e suplemento de pólen sozinhos. O consumo de pólen, água e sacarose foi registrado a cada 48 horas durante 10 ou 12 dias.As taxas diárias de consumo de sacarose aumentaram significativamente à medida que o experimento progrediu, mas as taxas de consumo de suplementos de pólen diminuíram. As maiores taxas de consumo de pólen foram observadas quando 10 partes por bilhão de imidaclopridos foram administrados apenas no suplemento de pólen. E a taxa diminuiu quando 10 ou 50 partes por bilhão foram administradas em suplemento de pólen e solução de sacarose em conjunto.O uso de abelhas antigas é fundamental para garantir a aceitação da rainha e reduzir o trabalhador sobre a reativação. Também crítico, é o manuseio cuidadoso da rainha e manter as gaiolas em um ambiente estável.

assessing-agrochemical-risk-to-mated-honey-bee-queens

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único - uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Consórcios microbianos dentro bumble colmeias enriquecem e preservar o pólen para larvas de abelha. Usando o sequenciamento de próxima geração, juntamente com o laboratório e experiências no terreno, este manuscrito descreve protocolos usados para testar a hipótese de que resíduos do fungicida alteram o pólen microbiome e demografia de colônia, finalmente levando à colônia perda.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Apresentamos aqui   um método para alimentar pesticida alimentos contaminados se tanto a um indivíduo abelha do mel e uma colónia colmeia. O procedimento avalia o efeito pesticida em abelhas de mel individuais por alimentação in vivo de dieta da larva de base e também na condição natural da colónia colmeia.

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

A perda de colônias de abelhas mel é um desafio para os serviços de polinização de culturas. As atuais práticas de proteção de polinizadores garantem uma abordagem alternativa para minimizar o contato de abelhas com pesticidas nocivos usando produtos químicos repelentes. Aqui, fornecemos métodos detalhados para um protocolo de rastreamento visual para detecção de dissuasores para abelhas.

Protocolo de rastreamento de vídeo para a tela de quimioterapia para abelhas

Doses subletais de pesticidas podem afetar colônias nas maneiras que são difíceis de detectar usando métodos somente periódicos ou visuais. Métodos para medir a massa total de abelha adulta, ninhada e os recursos alimentares por pesagem urticária e partes da colmeia, fotografando quadros e instalação de sensores, são fornecidos. Análise de dados também é abordada.

Monitoramento de nível de colônia os efeitos da exposição de pesticidas subletais em mel de abelhas

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

O presente protocolo explica um método para alimentar provisões contaminadas por pesticidas às larvas das abelhas solitárias, Osmia escavada. O procedimento examina a ecotoxicidade do pesticida para as larvas das abelhas solitárias.

Avaliando o efeito dos pesticidas nas larvas das abelhas solitárias

Abelhas pode ser condicionado em um paradigma de aprendizado apetitivo olfativo (PER-condicionado). Usando odores como estímulos, estabelecemos um método em que o comportamento é gravado simultaneamente imagens de cálcio é usado para medir a atividade do odor evocado nos neurônios do corpo de...

In vivo Ca 2 + - Imagem de Neurônios Corpo Mushroom durante o aprendizado olfativo no Honey Bee

Nós apresentamos um método de amostragem não invasiva para coletar amostras de cabelo de forma eficiente a partir elusive pequenos mamíferos, como mostrado para o pika americano. Demonstramos a utilidade deste método por extração de DNA de amostras de cabelo e ampliando vários tipos de marcadores moleculares usados ​​em estudos de ecologia da vida selvagem e conservação.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Um método, claro padronizados para dissecção e isolamento do coração zebrafish em vários estágios de desenvolvimento são descritos. Técnicas de anotação e quantificação também são discutidos.

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Aprenda a avaliar os efeitos de agroquímicos em rainhas de abelhas de mel usando o sistema de gaiolas de monitoramento QMC. Este protocolo controlado permite medir a produção de ovos e a eclosão larval após exposição subletal.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Explorar mais vídeos