Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Este protocolo foi desenvolvido para aprimorar a compreensão de como os agrotóxicos afetam a reprodução das abelhas de mel (Apis mellifera),estabelecendo métodos para expor rainhas das abelhas e seus cuidadores de trabalhadores a agrotóxicos em um ambiente controlado e laboratorial e monitorando cuidadosamente suas respostas relevantes.

A exposição agroquímica pode ter grandes impactos em todos os membros de uma colônia de abelhas, incluindo o membro mais importante, rainhas. Mas até recentemente, poucas ferramentas estavam disponíveis para estudar esses efeitos. Essa técnica permite que os pesquisadores exponham rainhas a agroquímicos em condições controladas que simulam condições que possam experimentar no campo.

É muito fácil perturbar comportamentos de criação de ovos da rainha das abelhas, por isso é importante tomar cuidado ao lidar com trabalhadores e rainhas antes e durante o experimento. Demonstrando esses procedimentos, Amy Floyd e Eliza Litsey, técnicos de laboratório da Unidade de Pesquisa em Saúde de Espécies Invasoras e Polinizadores, Honeybee Research Lab. Para começar, monte gaiolas de monitoramento de rainhas, ou QMCs, inserindo os painéis da porta, em seguida, insira o excludente de rainhas na porta da câmara de alimentação sobre a câmara de alimentação, para evitar que a rainha entre e entre em contato com a dieta tratada.

Insira um único ELP. Não adicione tubos de alimentação até que os trabalhadores tenham sido adicionados à gaiola e cubra temporariamente os quatro orifícios do alimentador com fita de grau de laboratório. Depois de coletar e incubar as molduras do pente de cera contendo a ninhada de trabalhador tampado das colônias de abelhas, escove as abelhas fechadas em um recipiente aberto forrado com uma tinta de barreira de insetos, para evitar que as abelhas rastejem para fora.

Adicione pelo menos 50 abelhas em peso à câmara de colocação de ovos de cada QMC. Para garantir que uma piscina genética diversificada seja introduzida, obtenha um número semelhante de abelhas operárias de pelo menos três colônias e permita que elas se misturem antes de adicionar abelhas aos QMCs. Adicione os alimentadores contendo solução de sacarose, água e suplemento de pólen.

Use rainhas compradas de um criador comercial dentro de 48 horas após o recebimento. Enquanto a rainha ainda está dentro da gaiola de transporte, coloque-a em um saco plástico transparente. Em seguida, coloque uma extremidade de um tubo plástico conectado a um botijão de gás de dióxido de carbono dentro do saco, e gentilmente abriu a válvula do recipiente para permitir que o gás dióxido de carbono flua.

Quando o saco estiver inflado com gás, feche simultaneamente a válvula do recipiente e mantenha o saco fechado para prender o gás dentro. Mantenha o saco fechado por 30 segundos ou até que a rainha pare de se mover. Remova a rainha abrindo a gaiola de embarque assim que a rainha estiver inconsciente.

Abra parcialmente a porta da câmara de colocação de ovos, coloque suavemente a rainha inconsciente dentro e feche a tampa. Adicione o segundo ELP a cada QMC. Coloque um pedaço de fita de laboratório na parte superior dos dois ELPs para evitar que eles se separem do quadro QMC e impeçam que os trabalhadores saiam da gaiola.

Coloque as gaiolas em uma incubadora escura com condições ambientais estáveis de 34 a 35 graus celsius, e 50-70% de umidade relativa. Para administrar a dieta repleta de agrotóxicos, prepare as soluções de estoque de agroquímicos em um solvente adequado, como a acetona, em uma concentração que pode ser adicionada à dieta para alcançar a concentração final desejada do agroquímico de interesse. Administrar os tratamentos agroquímicos em uma solução de sacarose, um suplemento comercial de pólen, ou ambos.

Prepare a dieta experimental para uso no mesmo dia, adicionando uma quantidade adequada de solução de estoque à solução de frio ou temperatura ambiente, solução de 50% de sacarose. Misture bem por vórtice a uma velocidade média. Para suplementos de pólen, adicione uma quantidade calculada de solução de estoque de agroquímicos à solução de sacarose e vórtice completamente antes de adicioná-la ao suplemento em pó.

Adicione dieta aos tubos alimentador e regissão os pesos do alimentador antes de colocá-los no QMC. Para quantificar a colocação do ovo, comece removendo QMCs da incubadora. Examine as costas dos ELPs claros, se os ovos estiverem presentes, remova o painel da porta em frente à placa de interesse.

Remova a fita através dos ELPs e deslize o painel da porta entre o ELP e as abelhas dentro do QMC. Com o painel da porta no lugar, remova o ELP e conte e regise o número de ovos dentro das células ELP. Remova os ovos tocando a borda do ELP de lado aberto para baixo, em uma superfície dura.

Uma vez que os ovos caiam, substitua o ELP vazio no QMC. Remova suavemente e substitua o painel da porta atrás do ELP na parte externa do QMC. Repita conforme necessário com o segundo ELP e substitua a fita pelo QMC quando terminar.

Para monitorar o consumo alimentar, substitua os alimentos por uma dieta recém-preparada a cada dois dias. Prepare novos tubos alimentador e pese-os antes de iniciar as atividades de monitoramento da produção de ovos. Troque tubos antigos por novos e pese tubos velhos antes de descartá-los.

Compare o peso final do tubo alimentador e dieta não consumida com o peso do mesmo tubo, para estimar o consumo da dieta. Verifique uma vez por dia para garantir que os alimentadores nunca estejam vazios. Se um tubo alimentador estiver vazio ou quase vazio, remova-o, recarregue-o, grave o peso do tubo antes e depois, e adicione a diferença ao total de consumo de dieta de dois dias para o QMC.

Em um ponto selecionado durante um experimento QMC, remova os ELPs contendo ovos recém-colocados do QMC como descrito anteriormente, mas não desaloja os ovos do ELP. Cubra o ELP primeiro com uma vedação de placa PCR e, em seguida, uma tampa de microplaca universal, e coloque-o dentro de um desiccador com uma solução de sulfato de potássio saturado. Avalie as taxas de incubação aproximadamente 78 horas após a remoção de ELPs do QMC.

Uma larva em forma de C na parte inferior da célula é indicativo de um evento de incubação bem sucedido. Se os QMCs foram preenchidos com excesso de trabalhadores, amostrar as abelhas operárias em um ponto de tempo selecionado durante o experimento para avaliar as alterações induzidas pelo tratamento em sua fisiologia. Antes da amostragem, coloque um painel de porta entre um ELP e o interior do QMC e remova o ELP.

Cuidadosamente, levante o painel da porta aproximadamente 0,5 centímetros da base da gaiola e remova uma abelha operária de dentro do QMC usando pinças de peso-pena. Para análise de expressão genética, congele as abelhas em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius. Preserve a abelha coletada para análise de acompanhamento e repita esse processo até que o número desejado de amostras tenha sido coletado.

As alterações relacionadas ao tratamento do tratamento de imidacloprido dietético na contagem diária de óvulos foram avaliadas pela implementação de uma equação de estimativa generalizada geral do tronco de Poisson, com uma matriz de correlação auto-regressiva. A produção diária de ovos foi significativamente menor em QMCs, dado suplemento de pólen e sacarose contendo 50 partes por bilhão de imidacloprido. Observou-se efeito dependente de dose no número total de ovos produzidos em cada QMC para tratamentos de imidaclopridos administrados tanto em sucrose quanto em suplemento de pólen.

Com a maior redução observada nos QMCs, os 50 imidaclopridos de 50 partes por bilhão, seguidos por 10 partes por bilhão em suplemento de pólen mais sacarose. Não foi observada diferença no total de ovos produzidos entre o controle e os QMCs alimentados 10 partes por bilhão de imidaclopridos e suplemento de pólen sozinhos. O consumo de pólen, água e sacarose foi registrado a cada 48 horas durante 10 ou 12 dias.

As taxas diárias de consumo de sacarose aumentaram significativamente à medida que o experimento progrediu, mas as taxas de consumo de suplementos de pólen diminuíram. As maiores taxas de consumo de pólen foram observadas quando 10 partes por bilhão de imidaclopridos foram administrados apenas no suplemento de pólen. E a taxa diminuiu quando 10 ou 50 partes por bilhão foram administradas em suplemento de pólen e solução de sacarose em conjunto.

O uso de abelhas antigas é fundamental para garantir a aceitação da rainha e reduzir o trabalhador sobre a reativação. Também crítico, é o manuseio cuidadoso da rainha e manter as gaiolas em um ambiente estável.