Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura
29 de maio de 2021
A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.
A análise crio-EM de partículas únicas tornou-se uma técnica de rotina na caixa de ferramentas do biólogo estrutural aplicável a uma ampla gama de espécimes, incluindo proteínas de membrana, fibrilas amiloides, proteínas de ligação de ácido nucleico e vírus. Uma vez concluída a preparação da amostra e as grades carregadas no microscópio, a coleta de dados pode ser realizada remotamente em muitas instalações crio-EM, como o Laboratório de Bioestrutura de Astbury e o eBIC. Grandes barreiras à determinação bem-sucedida da estrutura muitas vezes residem nas etapas de preparação da amostra e triagem da grade com múltiplas iterações às vezes necessárias através desse processo.
Aqui, demonstraremos a triagem remota da rede e a aquisição de dados de partículas únicas. Na guia carregador automático da interface do usuário do microscópio, tabe a caixa de opções usando a seta e pressione o botão de inventário. Isso verificará sequencialmente cada posição do para determinar se um cartucho está presente.
O inventário será executado em cada slot sequencialmente. Quando todos os slots ocupados forem mapeados, o inventário vai parar. Destaque a grade a ser transferida para a coluna do microscópio e clique na carga.
A etiqueta do slot passará de azul para amarelo assim que a grade tiver sido carregada com sucesso no palco. Para exibir as grades, abra o software EPU. Na página de preparação, selecione a óptica de aquisição e as configurações e selecione o predefinido do atlas no menu suspenso.
Escolha predefinições de configuração de feixe apropriadas e pressione o conjunto de pressione para empurrar os parâmetros para o microscópio. Pressione para abrir as válvulas da coluna e insira a tela de gripe. Verifique se um feixe está visível e suficientemente espalhado e centrado para cobrir o detector.
Se necessário, navegue até uma região mais fina da grade usando o joystick ou painéis de mão virtuais para controlar os movimentos do palco em X e Y.Levante a tela da gripe e tire uma imagem usando o botão de visualização em EPU. Na EPU, vá para a página do Atlas e pressione nova sessão. Selecione o formato de imagem MRC e digite um nome e local de pasta adequados para salvar a sessão de seleção e clique em solicitar.
Selecione a triagem no menu à esquerda. Marque as caixas de seleção ao lado de cada grade para ter uma montagem atlas adquirida e, em seguida, inicie a sessão de triagem em EPU. Um atlas é adquirido para cada grade verificada e as praças de grade disponíveis são listadas após a conclusão.
Cada atlas pode ser visto destacando-o na página de triagem. Quando concluído, revise os atlas coletados e identifique as grades adequadas para avaliar a qualidade da amostra em ampliações mais elevadas. Destaque a grade escolhida no menu de triagem EPU e clique na amostra de carga.
No menu de triagem do atlas, selecione a grade atualmente carregada e mova o palco para um quadrado de grade contendo os orifícios preenchidos clicando com o botão direito do mouse sobre o local desejado na imagem da grade e selecionando o estágio de movimento aqui. Retorne à página de preparação do EPU e selecione a predefinição quadrada da grade. Abra a página de funções automáticas EPU e execute auto-eucentric por inclinação de palco com a predefinição quadrada da grade para mover a amostra para a altura eucêntrica.
Na preparação do EPU, faça uma nova imagem de visualização quadrada da grade. Observe os valores cinzentos em diferentes orifícios indicando diferentes espessuras de gelo. Mova o palco sobre um buraco usando o clique com o botão direito e mova o palco aqui.
Selecione o orifício ou a predefinição da altura eucêntrica e clique em visualização. Selecione a predefinição de aquisição de dados e defina uma ampliação que permita fácil identificação das partículas. Defina o desfoco deslocado para negativo de três a cinco micrômetros.
Iterar através de etapas para reavaliar uma gama de espessura de gelo para distribuição de partículas, orientação e contaminação em toda a rede. Dependendo da disponibilidade de microscópio, continue diretamente à coleta de dados ou redes podem ser removidas do microscópio para coleta futura, inclusive em outros locais. Colete um atlas se não estiver disponível na triagem, configurando as configurações do Atlas e selecionando grade para adquirir o atlas.
Adquira o atlas e clique no local da grade para ver a saída. Uma vez que o atlas esteja completo, defina cada uma das predefinições de configuração do feixe de acordo com as necessidades experimentais do projeto. Execute calibrações de mudança de imagem.
Configure a sessão EPU selecionando a configuração da sessão de página EPU e, em seguida, selecionando uma nova sessão ou nova das preferências. Depois de selecionar uma nova sessão, um popup aparecerá fornecendo uma opção para usar configurações anteriores. As configurações serão carregadas automaticamente da sessão anterior para a atual EPU.
Alternativamente, selecione novas entre as preferências e escolha um arquivo com preferências salvas para pré-carregar essas informações no EPU atual. Preencha o nome da sessão com algo informativo. Em tipo, selecione manual.
Para o modo de aquisição, selecione o centro de furos preciso ou a aquisição mais rápida se a coleção de mudança de imagem livre de aberração estiver disponível e desejada. Selecione o formato de imagem desejado e selecione pasta de armazenamento e O EPU criará um diretório com o nome da sessão. Selecione a grade apropriada de acordo com a qual o espaçamento do orifício da grade está sendo usado e pressione a aplicação.
Selecione um quadrado de grade inicial e defina um modelo de aquisição. Vá para a seleção quadrada. Se todos os quadrados forem verdes, clique em desmarcar tudo no canto superior esquerdo.
Abra as telhas clicando com o botão direito do mouse e, em seguida, selecionando azulejo aberto. Adicione ou escolha um quadrado de grade clicando em selecionar e, em seguida, clicar com o botão direito do mouse e selecionar o estágio de movimento para o quadrado da grade. Vá para a seleção de buracos e pressione auto-eucentric.
Espere até que uma imagem quadrada seja tirada. Se a função automática falhar, isso pode ser porque a altura está significativamente desligada. Pode ser ajustado manualmente usando a tela de gripe na ampliação quadrada da grade.
Para medir o tamanho do orifício, mova-se e ajuste os círculos amarelos para que eles estejam sobre os orifícios com tamanho correto e espaçamento. Pressione encontrar buracos. Verifique se os buracos foram encontrados corretamente.
Se não, mude o tamanho do furo e pressione encontrar buracos novamente. Se esse processo falhar consistentemente, considere mover-se para um número menor ou tamanho de ponto mais brilhante na ampliação quadrada da grade. Use o histograma de qualidade de gelo do filtro à direita para ajustar a seleção do orifício.
Isso pode ser útil para excluir áreas com gelo espesso e gelo fino. Isso será lembrado para futuros quadrados de grade selecionados durante a sessão. Otimize a seleção de furos com as ferramentas no menu seleto na parte superior.
Por exemplo, clique em remover orifícios próximos à barra de grade. Vá para a definição do modelo e pressione a aquisição. Clique em encontrar e centralizar o buraco.
Altere o atraso após o turno e atrase após o tempo de mudança de imagem para um a cinco segundos, em seguida, se disponível, verifique o valor máximo de mudança de imagem é o desejado. Clique em adicionar área de aquisição e clique em qualquer lugar na imagem. Mova a área de aquisição para o local desejado.
Adicione o intervalo de defoco no canto superior direito. Uma lista típica de desfoco para um projeto de proteína de membrana é negativa de 0,8 a negativo de desfoco de três micrômetros, em seguida, adicionar outras áreas de aquisição, organizando-as de tal forma que as áreas de aquisição não sejam duplamente expostas com o feixe. Clique em adicionar área de foco automático e clique em qualquer lugar da imagem.
Mova a área de foco automático para o carbono em torno de um buraco. A prática padrão é focar automaticamente após o centro ao usar AFIS ou a cada cinco a 15 micrômetros, dependendo da variação de altura Z em todo o quadrado. Clique em adicionar área de medição de deriva.
A medição de deriva realizada uma vez por quadrado de grade com um limiar definido de 0,05 nanômetros por segundo como uma configuração padrão. A área de medição de deriva pode se sobrepor diretamente com a área de foco automático. Certifique-se de que nem a área de deriva nem foco automático se sobreponham a uma área de aquisição.
Volte para a seleção quadrada e selecione os quadrados para aquisição na grade. Use o número de áreas de aquisição e a taxa esperada de aquisição de dados para prever quantas áreas de aquisição são necessárias. Quando todos os quadrados desejados forem selecionados, pressione preparar todos os quadrados.
Uma vez que cada quadrado é coletado, navegue entre os quadrados da grade e ajuste os orifícios usando a escova de seleção. Mova-se para um local de estágio sobre o espécime e use funções automáticas para definir a altura eucêntrica. Execute alinhamentos de microscópio usando software de microscópio descrito anteriormente e no texto.
Realize o alinhamento livre de coma dentro das funções automáticas antes de reinserir e centralizar a abertura objetiva e corrigir o astigmatismo da lente objetiva com EPU. Certifique-se de que ambos os alinhamentos convergem em valores adequados. Antes de iniciar a execução automatizada de aquisição, certifique-se de que a bomba turbo do carregador automático esteja desligada e a abertura objetiva seja inserida, se necessário.
Na aquisição automatizada, pressione a corrida de inicialização para iniciar a aquisição automatizada de dados. Usando este protocolo, grades quebradas ou secas podem ser rastreadas e descartadas na fase atlas. Um gradiente de gelo é observado na maioria das grades.
Durante a triagem, uma distribuição ideal de partículas é monodisperada com uma gama de orientações de partículas visíveis. Se o gelo for muito fino, pode derreter quando iluminado com o feixe de elétrons, causando movimento excessivo no micrografo. Isso é mais comumente observado quando há detergente no buffer.
O gelo precisa ser vítreo para que áreas da grade onde a maioria das imagens mostram gelo cristalino foram excluídos. O resumo gráfico dos dados foi incluído para avaliar a qualidade do micrográfico e decidir se são necessárias alterações na coleta de dados. Catadores de partículas como crYOLO funcionam suficientemente bem para uma primeira passagem dos dados, permitindo a progressão para a média da classe 2D.
As classes que mostram detalhes da estrutura secundária devem ser escolhidas para análise 3D, enquanto as partículas de lixo devem ser descartadas. Um subconjunto de partículas pode ser usado para gerar um modelo inicial para classificação e refinamento 3D. No caso do RagAB, o conjunto de dados continha três conformadores distintos que podem ser separados durante a classificação 3D.
É importante lembrar que o sucesso nas etapas de aquisição de dados e análise de imagem subsequentes dependem da obtenção e identificação de grades bem otimizadas durante a fase de triagem. Uma vez que um mapa de densidade 3D EM é obtido, ele pode ser interpretado ainda mais através da montagem e refinação de um modelo de proteína ou da construção de um modelo atômico de novo. A análise de partículas únicas crio-EM permite a determinação estruturada de muitos alvos que não eram possíveis anteriormente.
Notavelmente, esses fluxos de trabalho têm sido recentemente usados para resolver estruturas de macromoléculas relacionadas ao COVID-19.
Visão Geral
Este artigo resume a determinação da estrutura de complexos macromoleculares utilizando microscopia eletrônica de criogenia (cryo-EM), detalhando o fluxo de trabalho desde o preparo da amostra até a aquisição de dados. Destaca a importância da triagem de grades e fornece insights sobre os desafios enfrentados durante o processo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Estrutural
- Microscopia Eletrônica Criogênica
- Complexos Macromoleculares
Antecedentes
- A microscopia crioeletrônica tornou-se uma técnica rotineira para biólogos estruturais.
- Aplicável a diversos espécimes, incluindo proteínas de membrana e vírus.
- A preparação da amostra e a triagem da grade são fundamentais para a determinação bem-sucedida da estrutura.
- A coleta remota de dados é possível em muitas instalações de crioeletrônica.
Objetivo do Estudo
- Resumir o fluxo de trabalho de criomicroscopia eletrônica para determinação de estruturas.
- Fornecer orientações sobre preparo de amostras e análise de grades.
- Orientar os leitores quanto a recursos adicionais para espécimes desafiadores.
Métodos Utilizados
- Preparação da amostra e carregamento da grade no microscópio.
- Triagem remota da grade utilizando o software EPU.
- Aquisição e processamento de imagens coletadas.
- Avaliação iterativa da espessura do gelo e distribuição das partículas.
Principais Resultados
- Demonstrou-se o carregamento e triagem bem-sucedidos das grades.
- Foram fornecidas orientações para ajustar as configurações do feixe e adquirir atlas.
- Identificaram-se grades adequadas para avaliações com maior magnificação.
- Destacou-se a importância de processos iterativos na avaliação da qualidade da amostra.
Conclusões
- A microscopia crioeletrônica é uma ferramenta poderosa para a biologia estrutural.
- A preparação adequada da amostra e a triagem da grade são essenciais para o sucesso.
- A coleta remota de dados aumenta o acesso às instalações de microscopia crioeletrônica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia eletrônica criogênica permite a determinação estrutural de alta resolução de alvos macromoleculares, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta precoce de fármacos. A técnica fornece confiança preditiva ao revelar detalhes estruturais de proteínas relevantes para doenças, incluindo complexos de membrana e antígenos virais, que frequentemente são intratáveis por outros métodos. As capacidades de operação remota aumentam a acessibilidade e a produtividade em instalações centrais compartilhadas de biologia estrutural, acelerando os prazos de passagem do acerto ao fármaco líder.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a resolução de estruturas tridimensionais de proteínas-alvo e complexos.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da visualização direta da conformação do alvo e dos sítios de ligação de ligantes.
- Valor Preditivo: Facilita o planejamento de fármacos baseado em estrutura e a otimização de compostos iniciais ao fornecer informações em nível atômico sobre a dinâmica do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera modelos estruturais validados que servem como referências para o desenvolvimento de ensaios e o planejamento de campanhas de triagem.
- Valor Operacional: Permite a padronização de construtos-alvo por meio de feedback estrutural sobre expressão, purificação e formação de complexos.
- Escalabilidade: Apoia a triagem em painel de variantes ou mutantes do alvo para avaliar integridade estrutural e farmacabilidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece base estrutural para o alinhamento de biomarcadores ao identificar epítopos, sítios alostéricos ou estados conformacionais relevantes para a doença.
- Redução de Riscos Pré-clínicos: Orienta a avaliação de segurança ao revelar mecanismos de ligação fora do alvo ou semelhanças estruturais com proteínas humanas.
- Conhecimento Mecanístico: Esclarece o mecanismo de ação de biológicos ou moléculas pequenas por meio da visualização de estados ligados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A microscopia crioeletrônica insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do fármaco candidato e a seleção do candidato pré-clínico, especialmente para alvos com desafios estruturais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver estruturas de complexos nativos e estados transitórios.
- Triagem: Permite a preparação para ensaios ao fornecer feedback estrutural sobre a qualidade e estabilidade do alvo para aplicações downstream de triagem.
- Análises: Fornece métricas estruturais quantitativas, como resolução, qualidade do mapa e ocupação do ligante, que orientam decisões de prosseguir ou não prosseguir.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao permitir a predição baseada em estrutura de propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma estrutural reutilizável em múltiplos alvos e projetos dentro de um portfólio.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade estrutural.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de triagem em grade e coleta de dados.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a falha precoce de alvos estruturalmente inviáveis.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na viabilidade estrutural e na farmacologicidade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em biologia estrutural, preparação de amostras e processamento de dados de microscopia crioeletrônica (cryo-EM).
- Depende do acesso a microscópios crioeletrônicos de alta performance e infraestrutura estável de energia, refrigeração e isolamento contra vibrações.
- Necessita padronização entre equipes envolvidas na produção, purificação e imagem de proteínas para garantir qualidade consistente das amostras.
- Envolve adaptação a diversos tipos de amostras, incluindo detergentes, lipídios e ácidos nucleicos, que afetam a qualidade do gelo e a distribuição das partículas.
- Limitado pela quantidade, estabilidade e homogeneidade da amostra, fatores que impactam diretamente o sucesso do pré-visualização nas grades e a utilidade dos dados.
