Name: Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a expressar e purificar o canal iônico TRPC3 humano usando células HEK293 e sistema baculovírus para estudos estruturais por crio-EM. Este método eficiente permite determinar estruturas de proteínas de membrana com alta qualidade.

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Agradecemos G. Zhao e X. Meng o apoio com coleta de dados para o David Van Andel Cryo-elétron microscopia conjunto avançado. Agradecemos a equipe VARI de computação de alto desempenho para suporte computacional. Nós damos nossa gratidão a s. Clemente, D. dívidas, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z para comentários que melhoraram muito este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoio editorial para este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela VARI interno financiamento.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Determinação estrutural de proteínas por cryo-EM tem revolucionado o campo da biologia estrutural nos últimos anos, graças ao desenvolvimento de novas câmeras e algoritmos que acelera significativamente a determinação da estrutura das proteínas que não prontamente crystalize, particularmente as proteínas da membrana. Apesar de todos os avanços recentes na técnica de cryo-EM, a preparação de proteínas purified em qualidade e quantidade suficiente para facilitar a alta qualidade de imagem muitas vezes continua a ser demora...

Cálcio está envolvido em processos mais celulares, incluindo a sinalização, cascatas, controle de transcrição, liberação de neurotransmissor e hormônio molécula síntese1,2,3. A manutenção homeostática do cálcio citosólico livre é crucial para a saúde e a função das células. Um dos principais mecanismos de homeostase de cálcio intracelular é operada a loja cálcio entrada (SOCE), um processo no qual depleção de cálcio armazenado em disparadores o retículo endoplasmático (ER) a abertura de canais iônicos na membrana plasmática, para facilitar a reposição de cálcio ER, que pode ser usado na sinalização mais4,5,6. Canais potencial receptor transitória (TRPCs), que são canais de cálcio-permeável pertencentes à Superfamília TRP, identificaram-se como um participante importante em SOCE7,8,9 .
Entre os sete membros da família TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formam um subgrupo homólogo, e eles são únicos na habilidade de ser ativado pelo Mensageiro secundário lipídico diacilglicerol (DAG), um produto de degradação de lipídios a sinalização fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 é altamente expresso no músculo liso e nas regiões do cérebro, onde ele tem um papel essencial na sinalização de cálcio que afetam a neurotransmissão e neurogênese12,13cerebrais e cerebelares. Disfunção de TRPC3 tem sido associada a distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares e certos tipos de câncer como adenocarcinoma ovariano14,15,16. Portanto, TRPC3 é uma promessa como um destino de farmacêutico para o tratamento destas doenças. Desenvolvimento de fármacos direcionados especificamente atuando na TRPC3 tem sido limitado pela falta de compreensão de seus mecanismos de ativação molecular, incluindo lipídios vinculação sites17,18. Informamos a primeira estrutura atômica-resolução do canal de TRPC3 humano (hTRPC3) e os seus sítios de ligação de lipídios dois em um estado fechado, proporcionando insights importantes sobre esses mecanismos de19.
O fator chave para determinar a estrutura de uma proteína de membrana em alta resolução é obter proteína de alta qualidade. O rastreio correspondente de expressão e purificação de condições necessárias para obter a proteína de alta qualidade pode ser uma tarefa demorada e dispendiosa. Aqui nós apresentamos um protocolo descrevendo em detalhe como identificamos as condições ideais para a expressão e purificação de hTRPC3, que se comportou mal na nossa seleção inicial. Apresentamos vários pontos-chave sobre como solucionar problemas e otimizar o comportamento da proteína, que colocam uma base sólida para nossa cryo-elétron estudos de microscopia (cryo-EM). Nós usamos um baculoviral modificado gerando vetor (pEG), desenvolvido pela Gouaux e colegas, que é otimizado para a seleção de ensaios e eficiente geração de baculovirus em células de mamíferos,20. Este método de expressão é apropriado para rápida e econômica a superexpressão de proteínas na membrana celular dos mamíferos. Podemos combinar o uso deste vetor com uma tamanho de fluorescência-deteção-exclusão baseada em cromatografia (FSEC) prescreening método21. Esse método usa uma tag de proteína verde fluorescente (GFP) fundida-se para a construção de interesse e melhora a visualização da proteína alvo em amostras pequenas, células inteiras de solubilizado. Isto permite a análise de estabilidade de proteína na presença de diferentes detergentes e aditivos, com mutações thermostabilizing e permite o uso de um pequeno número de células de transfecção transiente em pequena escala. Desta forma, uma infinidade de condições pode ser rastreada rapidamente antes de se mudar para uma purificação de proteínas em larga escala. Após a triagem, expressão e purificação, apresentamos um protocolo para obtenção e processamento de imagens de cryo-EM gerar uma determinação estrutural de novo da proteína. Acreditamos que as abordagens descritas aqui vão servir como um protocolo generalizável para estudos estruturais de receptores de canal TRP e outras proteínas de membrana.

<table><tbody><tr><td>Células pEG BacMam vector (pFastBacI)</td><td>addgene</td><td>31488</td><td></td></tr><tr><td>DH10&alpha;</td><td>Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Corning</td><td></td><td>46003CR</td><td>para transformação de células DH10&alfa; para placas de cultura Bacmid</td></tr><tr><td>Bacmam</td><td>Teknova</td><td>L5919</td><td>para cultura de células DH10&alfa transformadas</td></tr><tr><td>Agitador de incubação para células</td><td>bacterianas Infors HT</td><td>Multitron standard</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital incubado para células de insetos</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Reach-in CO2 incubadora para células de mamíferos</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital de mesa</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE416HP</td><td>usado na incubadora de CO2 Reach-in para células de mamíferos</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>1535</td><td>para placas bacterianas</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>para extração e purificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>para extração de DNA</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>Life Technologies</td><td>12659017</td><td>células de insetos para produção</td></tr><tr><td>de vírus Sf-900 mídia</td><td>Gibco</td><td>12658-027</td><td>meio de células de insetos</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Gibco</td><td>10362100</td><td>para transfecção de células de insetos</td></tr><tr><td>lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>para transfecção de células mamalianas</td></tr><tr><td>filtro de seringa de 0,2 mm</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>para filtragem do vírus P1</td></tr><tr><td>frascos de filtro de 0,2 mm 500ml reservatório</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>para filtragem do vírus P2</td></tr><tr><td>frasco de cultura erlenmeyer (fundo plano 2L)</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000</td><td>para cultura de células de insetos</td></tr><tr><td>frasco de cultura erlenmeyer (perplexo 2L)</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000B</td><td>para cultura de células de mamíferos</td></tr><tr><td>nanodrop 2000 espectrofotômetro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>para determinação de concentrações de DNA e proteínas</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td>células de mamíferos para a produção de proteínas</td></tr><tr><td>Meio de expressão de Freestyle 293 Gibco</td><td></td><td>1238-018</td><td>para expressão de proteínas</td></tr><tr><td>Ácido butírico Sal de sódio</td><td>Acros</td><td>263195000</td><td>para amplificar a expressão de proteínas</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Acros</td><td>215740500</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>Aprotinina de pulmão bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-100MG</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>Cloridrato de leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24125-16-4</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>pepstatina A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2671-250</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>digitonina</td><td>EMD Millipore</td><td>300410</td><td>detergente - para solubilizar proteína da membrana</td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma</td><td>792527</td><td>para eluir a proteína da coluna de resina</td></tr><tr><td>Resina TALON</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>para purificação de afinidade por</td></tr><tr><td>colunas de cessação His-tag superose6</td><td>GE</td><td>29091596; 29091597</td><td>para HPLC e FPLC</td></tr><tr><td>Sistema de HPLC Modular de Proeminência</td><td>Shimadzu</td><td>Veja abaixo</td><td></td></tr> o <tr><td>módulo controlador</td> <td>"</td><td>CBM20A</td><td></td></tr><tr><td>Solvent Delivery System</td><td>"</td> <td>LC30AD</td><td></td></tr><tr><td>Detector de Fluorescência</td> <td>"</td><td>RF20AXS</td><td></td></tr><tr><td>Amostrador Automático com Resfriamento</td><td>"</td><td>SIL20ACHT</td><td></td></tr><tr><td>Sistema FPLC Puro com Fracionador</td><td>Akta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>trombina (alfa)</td><td>Haematologic Technologies Incorporated</td><td>HCT-0020 Alfa humano</td><td>para clivagem GFP tag</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL 100K tubo de filtro centrífugo</td><td>Millipore</td><td>UFC910008</td><td>para concentrar a proteína</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>E478500</td><td>para estabilizar</td></tr><tr><td>a proteína 400 mesh grades de cobre revestidas de carbono</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>01754-F</td><td>grades para mancha negativa</td></tr><tr><td>Grade de carbono furada Quantifoil (ouro, 1.2/1.3&thinsp; &mu; m tamanho/espaço do furo, 300 mesh)</td> <td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>Q3100AR1.3</td><td>grades para Cryo-EM</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI</td><td></td><td>para preparação de grades de amostra por nitrogênio líquido de congelamento</td></tr> de <tr><td>etano líquido</td><td>Dura-Cyl</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>gás etano</td><td>Airgas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Plasma Solarus</td><td>Gatan</td><td>Modelo 950</td><td>para limpeza de grades antes congelamento de amostras</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico Tecnai Spirit</td><td>FEI</td><td></td><td>para coloração negativa Imagem EM</td></tr><tr><td>Talos Arctica Microscócope eletrônico</td><td>FEI</td><td></td><td>para triagem e imagem de baixa resolução de grades Cryo-EM</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico Titan Krios</td><td>FEI</td><td></td><td>para imagem Cryo-EM de alta resolução</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Gautomatch</td><td>http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td><td></td> <td>para escolher partículas de micrografias</td></tr><tr><td>O software Relion 2.1</td><td>https://github.com/3dem/relion</td><td></td><td>para construir a classificação 2D e 3D</td></tr><tr><td>O software CryoSPARC</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td> <td>para gerar um modelo de estrutura inicial</td></tr><tr>O<td>software Frealign</td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td><td></td><td>para refinar particles</td></tr><tr><td>Coot software</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td></td> <td>para construir um modelo</td></tr><tr><td>de software MolProbity</td><td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td><td></td> <td>para avaliar as geometrias do modelo atômico</td></tr><tr><td>Software SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td><td></td> <td>para aquisição automatizada de pilha de imagens seriais</td></tr><tr><td>Software</td> <td>MortionCor2</td><td></td> http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html <td>para correção de movimento de pilhas de filmes somadas</td></tr><tr><td>Software GCTF</td><td>https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td> <td>para medir valores de desfocagem em pilhas de filmes</td></tr><tr><td>Phenix.real_space_refine software</td><td>https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html</td><td></td><td>para refinamento do espaço real do modelo 3D inicial</td></tr></tbody></table>

expressão e purificação de trpc3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de single-particle cryo-elétron

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transiente do receptor potencial canais (TRPCs) da subfamília TRP canônica são canais de cátion não seletivo que desempenham um papel essencial na homeostase do cálcio, entrada de cálcio particularmente operada a loja, que é fundamental para manter a função adequada de lançamento da vesícula sináptica e vias de sinalização intracelulares. Por conseguinte, canais TRPC têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares, tais como hipertrofia cardíaca, doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e distúrbios neurológicos como ataxia espinocerebelar. Portanto, canais TRPC representam um potencial alvo farmacológico em doenças humanas. No entanto, os mecanismos moleculares de gating nesses canais são ainda pouco claras. A dificuldade na obtenção de grandes quantidades de proteína purificada, homogênea e estável tem sido um fator limitante em estudos de determinação de estrutura, particularmente para proteínas de membrana de mamíferos como os canais de íon TRPC. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão em larga escala de proteínas de membrana de canal íon mamíferos usando um sistema de transferência do gene de baculovirus modificados e a purificação destas proteínas por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. Apresentamos mais um protocolo para coletar imagens de microscopia cryo-elétron da único-partícula de proteína purificada e usar estas imagens para determinar a estrutura da proteína. Determinação da estrutura é um método poderoso para compreender os mecanismos de retenção e função em canais iônicos.

Uma visão esquemática do protocolo para a expressão e purificação de hTRPC3 são mostrados na figura 1A. Uma imagem da placa de bacmid de hTRPC3 com colônias brancas ideais, semelhantes àquele selecionado para a purificação de DNA de bacmid, é mostrada na figura 1B. Descobrimos que 48 h é ideal para coloração de Bluo-gal clara, mantendo a presença de colônias isoladas. Picos de produção de vírus de P2 para hTRPC3, como visualizado...

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Este protocolo nos permitiu resolver a estrutura do TRPC3 humano, um membro de uma importante, mas subestudada família de canais de íons. A principal vantagem dessa técnica é a alta eficiência com que ela pode ser aplicada para expressar e purificar uma variedade de proteínas, tanto para estudos estruturais quanto funcionais. Este método pode fornecer um sistema eficiente de expressão e purificação de proteínas, para uso no estudo da bioquímica proteica e biofísica e pode ser aplicado a uma grande variedade de canais de íons e outras proteínas de membrana.Primeiro, verifique a expressão relativa do vírus visualizando a fluorescência GFP do vírus em uma amostra da cultura produtora de vírus. Em um frasco de cultura erlenmeyer de fundo perplexo de tamanho suficiente, prepare um volume desejável de uma cultura de suspensão celular de mamíferos HEK293, a uma concentração de 3,5 a 3,8 milhões de células por mililitro no meio de expressão, complementado com FBS 1% estéril. Adicione 8% por volume de solução de estoque de vírus P2 preparada e incubar em um Shaker Orbital a 37 graus Celsius e 135 RPM.Às 12 a 18 horas após a infecção adicione 10 milimonas de butara de sódio, incubam a 30 graus Celsius pela quantidade de tempo necessária para a expressão proteica ideal. Depois disso, centrífuga a 2.880 vezes a gravidade por 20 minutos para colher as células. Lave e resuspenja as células em aproximadamente 100 mililitros de TBS por litro de células colhidas.Centrifugar novamente a 2.880 vezes a gravidade por 20 minutos e coletar a pelota celular. Também colecione pequenas colheitas de pelotas de células mililitros em diferentes pontos de tempo e solubilize por duas horas a quatro graus Celsius com agitação na presença de diferentes detergentes e/ou aditivos. Esclareça essas pequenas amostras de células inteiras solubilizadas por ultracentrifugação a 235.000 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, execute-os como 30 amostras de microliter em uma coluna de cromatografia SEC, para determinar o melhor momento para a expressão e as melhores condições de solubilização. Descongele a pelota em 100 mililitros de tampão por litro de células colhidas. Uma vez que as células estejam descongeladas, pipeta ou mexa-as para garantir que a solução seja homogênea.Deixe as células solubilizar em quatro graus Celsius em um béquer imerso em gelo por duas horas enquanto é agitado por uma barra de agitação. Em seguida, remova qualquer detrito celular por ultracentrifugação a 235.000 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por uma hora. Execute uma amostra de 30 microliter do supernante em uma coluna SCC pelo HPLC para verificar a quantidade de proteína e visualizar a proteína alvo pela saída de sinal GFB.Aplique a resina de afinidade de cobalto ligada ao supernante contendo a proteína solubilizada em uma coluna gravitacional e colete o fluxo-through. Execute uma amostra de 30 microliter do fluxo em uma coluna SCC para verificar se a proteína está se ligando à resina. Em seguida, lave a resina com 10 volumes de coluna de tampão.Execute uma amostra de 30 microliter da lavagem em uma coluna SCC para verificar se há perda de proteína. Usando tampão, elute a resina ligada ao TRPC3 humano. Execute uma amostra de 90 microliter do eluante que foi diluída de 1 a 100 em uma coluna SSC para verificar se a proteína foi elucidada e verificar a presença de um sinal GFP na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo.Adicione trombina a uma relação molar de 1 a 20 e adicione 10 milimões de EDTA à amostra elucidada. Incubar a 4 graus Celsius por três horas. Depois disso, transfira o eluante para um tubo de filtro centrífugo de 15 mililitros.Gire o tubo a 2.800 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius em incrementos de cinco minutos para concentrar o eluante a 500 microliters ou menos. Pipeta a solução de proteínas para cima e para baixo entre os giros para resuspensar a proteína e evitar a concentração excessiva. Carregue o concentrado em uma coluna SSC no buffer.Execute cromatografia líquida de proteína rápida e colete 300 frações de microliter. Em seguida, combine as frações de pico que contêm o tetramer TRPC3 como visualizado pelo sinal de absorção UV. E concentre-se novamente em uma concentração final de pelo menos cinco miligramas por mililitro.O TRPC3 humano é totalmente solubilizado em uma variedade de detergentes com uma concentração de micela crítica de 0,01 a 20 micromolars, e foi executado em um DDM/CHS contendo buffer. Embora o DDM/CHS mostre a maior solubilidade do TRPC3 humano, a posição máxima parece muito grande para ser o TRPC3 humano tetramédico. Após a solubilização de células inteiras, os detritos de lise celular são removidos e a proteína solubilizada é carregada em uma coluna SSC e executada no HPLC em detergente DDM/CHS contendo tampão, para comparar a solubilidade absoluta e o volume máximo do TRPC3 humano em condições diferentes em relação a um controle TRPM4.Todas as diferentes amostras de TRPC3 solubilizadas de detergente mostram posições máximas em torno de 11,9 mililitros, o que é provavelmente muito grande porque a forma tetramérica do TRPC3 humano tem um peso molecular menor do que o controle humano positivo TRPM4. Dois buffers de solubilização e execução diferentes contendo DDM/CHS e digitonin são então testados. A proteína executada no tampão contendo digitonina produz o pico mais alto em uma posição razoável em relação ao controle positivo.Enquanto uma purificação em pequena escala usando 25 mililitros de células mostra vários picos amplos, a proteína mostra características de um único canal trpc3 humano tetramédico em classificação 2D por mancha negativa. Os aditivos são então examinados com base no caráter fisiológico do TRPC3 humano. EDTA mostra um efeito notável na estabilização do TRPC3 humano em uma posição de pico tetramérica intacta e aumentou significativamente o número de partículas no micrografo crio-EM e diminuiu o ruído no fundo.A qualidade dos resultados finais depende de uma boa solução de problemas dos perfis do FSCC no HPLC. E ao completar todas as etapas de purificação rapidamente, idealmente em um único dia. A determinação estrutural, a geração de anticorpos e estudos funcionais como ensaios de ligação ou eletrofisiologia podem ser realizados após este procedimento.Essa técnica pode e foi adaptada para estudar outros canais de íons e famílias de proteínas e produzir proteínas purificadas para aplicações além da determinação estrutural. As precauções adequadas para o gerenciamento de bioargrágivos de cultura celular, como trabalhar em uma capa de fluxo laminar, usar roupas protetoras e descartar adequadamente resíduos, devem ser tomadas.

expression-purification-human-lipid-sensitive-cation-channel-trpc3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

A expressão heteróloga e purificação da fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) são desafios significativos e fatores limitantes para o desenvolvimento de drogas terapêuticas para a fibrose cística. Este protocolo descreve dois métodos para o isolamento de quantidades de miligrama de CFTR adequados para estudos funcionais e estruturais.

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

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Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

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Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

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Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

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Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Aprenda a expressar e purificar o canal iônico TRPC3 humano usando células HEK293 e sistema baculovírus para estudos estruturais por crio-EM. Este método eficiente permite determinar estruturas de proteínas de membrana com alta qualidade.

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