Name: Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando 18F FDG Micro-PET/MR Imaging (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar tecidos adiposos marrons e bege em camundongos usando imagem micro-PET/MR com [18F]FDG. Este método não invasivo permite avaliar a atividade termogênica in vivo após aclimatação ao frio.

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Agradecemos o apoio da National Natural Science Foundation of China (NSFC) - Excellent Young Scientists Fund (Hong Kong and Macau) (81922079), Hong Kong Research Grants Council General Research Fund (GRF 17121520 and 17123419) e Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) para pequenos experimentos de imagem animal.

O protocolo descrito abaixo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Hong Kong. Os animais utilizados no estudo foram camundongos C57BL/6J de 8 semanas de idade.
1. Procedimentos cirúrgicos animais e desafio frio
<ol><li>Realize a dissecção bat (iBAT) interescapular.<ol>
<li>Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100 mg/kg de cetamina bodyweight e 10 mg/kg de xilazina). Após anestesia, raspe o cabelo do rato do pescoço até logo abaixo da escápula.</li>
		<li>Coloque os ratos na almofada de aquecimento após a desinfecção e faça uma incisão de 2 cm ao longo da linha média dorsal dos camundongos.</li>
		<li>Remova as almofadas iBAT (bilaterais). No grupo operado por farsas, faça a mesma incisão, mas deixe as almofadas iBAT intactas.</li>
		<li>Feche a incisão usando clipes de aço inoxidável de 7 mm depois que o sangramento parar.</li>
		<li>Após a cirurgia, dê meloxicam (5 mg/kg em água potável) aos camundongos por 6 dias e abriga-os em uma unidade de terapia intensiva (UTI) por 14 dias. Remova os clipes assim que a ferida estiver curada (7-10 dias).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desafio frio dos ratos: Abrigar os ratos na termoneutralidade (30 °C) por 14 dias. No dia 13, pré-chill as gaiolas animais em frio (6 °C) durante a noite. No dia 14, coloque os ratos a 6°C na câmara ambiental por 7 dias. Coloque dois ratos em cada gaiola.</li>
</ol>2. Calibrações micro-PET/MR e configuração do fluxo de trabalho
NOTA: A imagem micro-PET/MR é realizada utilizando um sistema PET/MR sequencial (ver Tabela de Materiais). Cada rato é colocado na cama de imagem; primeiro digitalize com o MR para uma referência anatômica (visão de scout) antes de avançar para o centro do campo de visão PET (FOV) para uma aquisição estática [18F]FDG PET, seguida de imagem MR para referência anatômica. Um fluxo de trabalho de imagem é criado no software operacional do scanner (ver Tabela de Materiais) para permitir varreduras PET/MR automatizadas e sequenciais antes da sessão de imagem.
<ol><li>Crie um fluxo de trabalho de imagem no software operacional que inclua aquisição estática de PET, aquisições de ressonância magnética para correção de atenuação e referência anatômica usando imagens 3D t1-weigthed e imagem 2D ponderada t2, respectivamente.</li>
	<li>Para adquirir PET, estabeleça discriminação de nível de 400-600 keV, isótopo de estudo F-18, modo 1-5 coincidência e 20 min de varreduras.</li>
	<li>Para adquirir MR ponderado T1 (para correção de atenuação), defina Gradiente Echo-3D (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, número de excitações (NEX) = 3, 28 fatias com espessura de 0,9 mm, tamanho do voxel = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).</li>
	<li>Para adquirir MR ponderado T2 (referência anatômica), defina o Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 32 fatias com espessura de 0,9 mm, tamanho do voxel = 0,265 x 0,268 x 0,93 mm).</li>
	<li>Para reconstruir o PET, use o algoritmo Tera-Tomo 3D (TT3D) (8 iterações, 6 subconjuntos) com modo coincidência 1-3, e com decaimento, tempo morto, atenuação aleatória e correções de dispersão para criar imagens com um tamanho geral de 0,3 mm3 voxel.</li>
	<li>Realize um teste de atividade PET do scanner micro-PET/MR um dia antes do início do estudo de imagem para verificar a precisão da quantitação PET.<ol>
<li>Prepare uma seringa de 5 mL preenchida com [18F]FDG conforme recomendado pelas diretrizes do fabricante (140-220 μCi/5-8 MBq em água ou soro fisiológico).</li>
		<li>Registo a atividade da seringa utilizando um calibrador de dose (ver Tabela de Materiais) e observe o tempo de medição.</li>
		<li>Selecione ROI de Elipse Interpolada para desenhar um VOI de volume de interesse (VOI) na imagem reconstruída para comparar a atividade recuperada com o valor medido como descrito acima. A atividade recuperada para um scanner bem calibrado é precisa dentro de ±5%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeção de [18F]FDG
<ol><li>Peça uma dose clínica de FDG (10 mCi/370 MBq) do fornecedor para sua chegada ao laboratório de imagem aproximadamente 30 minutos antes da primeira injeção programada. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, como um jaleco, luvas, dosímetro de radiação pessoal, por exemplo, dedos, corpo inteiro ao receber a embalagem contendo materiais radioativos. Troque as luvas regularmente para evitar a contaminação cruzada da radioatividade e aumente a distância da fonte radioativa o máximo possível.</li>
	<li>Use os fórceps para transferir cuidadosamente o frasco de estoque FDG [18F]atrás de um escudo superior de mesa de bloco L.</li>
	<li>Dispense uma alíquota de FDG [18F]e dilua com soro fisiológico esterilizado para dar uma concentração total de atividade em 200-250 μCi/7-9 MBq) em 100-150 μL.</li>
	<li>Desenhe a solução FDG [18F]em uma seringa de 1 mL com agulha (ver Tabela de Materiais), meça a radioatividade usando um calibrador de dose definido para F-18 e registe o tempo de medição.</li>
	<li>Regisso o peso do mouse antes da injeção. Injete a solução FDG preparada através da veia traseira. Tome nota do tempo de injeção e resíduo da radioatividade da seringa para permitir a correção da decomposição.</li>
	<li>Coloque o mouse de volta na gaiola e deixe [18F]captação de FDG por 60 minutos antes do PET scans.</li>
	<li>Calcule a atividade de FDG injetada [18F]usando a seguinte fórmula11: Atividade injetada (μCi/MBq) = Atividade na seringa antes da injeção - atividade na seringa após injeção</li>
</ol>4. Aquisição de Micro-PET/MR
<ol><li>Ligue o aquecedor de ar para a cama do rato para permitir que o ar quente passe por ele.</li>
	<li>Anestesiar o mouse usando 5% de isoflurane (1 L/min médico O2). Uma vez induzido, transfira o rato para a cama quente do rato e mantenha a anestesia em 2%-3 % isoflurane através de um cone de máscara de nariz. Posicione a cabeça do mouse na barra de mordida e certifique-se de que o mouse não se projede fora do diâmetro da cama. Aplique lubrificante ocular para evitar a secagem e formação de úlceras córneas.</li>
	<li>Monitore a temperatura corporal e a taxa respiratória por uma sonda térmica e uma almofada respiratória, respectivamente. Mantenha a temperatura corporal a 36-37 °C, e a taxa respiratória a 70-80 respirações por minuto (bpm) ajustando o nível de isoflurane.</li>
	<li>Execute uma visão de batedor para determinar a posição do mouse. Ajuste a posição da cama do mouse para incluir todo o corpo do mouse, e para garantir que o FOV central de MR esteja no centro do corpo do mouse.</li>
	<li>De acordo com a aquisição pet na janela de lista de estudo, selecione Faixa de varredura na aquisição anterior para usar a posição de exibição do scout conforme descrito acima. Clique em Prepare-se para mover a cama animal de MR para PET. Selecione OK para iniciar a varredura PET. Registo da dose de injeção e tempo medido antes e depois da administração FDG no Editor Radiofarmacêutico. Digite o peso do mouse no menu Informações de Assunto .</li>
	<li>Uma vez concluída a varredura PET, selecione Preparar para mover-se para MR e concluir todas as aquisições de MR na janela da lista de estudo. Selecione OK para iniciar as varreduras de Mr.</li>
	<li>Após todo o fluxo de trabalho ser concluído, avalie brevemente a qualidade das imagens de MR adquiridas usando o software pós-processamento (ver Tabela de Materiais). Clique no botão Home para mover a cama do mouse do MR para a posição original.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o mouse do scanner e devolva-o a uma gaiola de habitação limpa com uma almofada aquecida por baixo para permitir a recuperação em ambiente quente. Forneça comida e água ao rato. O sistema está pronto para o próximo mouse na fila.</li>
	<li>Para reconstruir os dados, selecione a aquisição pet no menu Raw Scan para carregar a varredura PET concluída. Selecione A aquisição mr ponderada t1 para a criação de mapas materiais. Reconstrua os dados descritos acima (ver passo 2.5).</li>
	<li>Siga as normas locais e do instituto sobre o cuidado e manuseio do mouse de imagem pós-PET. Considere todas as seringas/agulhas usadas, luvas, roupas de cama e matéria fecal como resíduos radioativos que requerem manuseio/descarte especial de acordo com as normas locais.</li>
</ol>5. Análise pós-imagem
<ol><li>Abra o software de Análise de Imagem (ver Tabela de Materiais) e clique em Carregar dados DICOM para recuperar as imagens MR e PET correspondentes.</li>
	<li>Realize o co-registro da imagem MR e PET arrastando essas imagens para a janela de exibição. Clique na função Registro Automático .<ol>
<li>Selecione a transformação rígida no menu suspenso da configuração de registro . Verifique Shift e Rotação no menu Rígido/Affine .</li>
		<li>Selecione a aquisição de MR ponderada por T1 como a aquisição de Referência e PET como a Reslice no menu Seleção de Funções Globais.</li>
		<li>Inspecione o registro nas três dimensões para garantir um alinhamento perfeito entre as imagens MR e PET. Para ajustá-lo manualmente, clique em Registro Manual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use ROI de Elipse Interpolada para desenhar VOI no tecido de interesse, ou seja, iBAT e tecido adiposo branco inguinal (iWAT) usando imagem MR para referência. Use a ferramenta pincéis e a ferramenta de borracha para definir a borda VOI; daí, a anatomia dos tecidos. Certifique-se de que não há absorção de sobreposição usando imagem PET para evitar derramamento dos órgãos vizinhos. Repita o processo slide-by-slide até que todo o VOI esteja delineado. Se necessário, edite os VOIs para manter volumes de VOI consistentes entre cada mouse.</li>
	<li>Use Ellipsoid VOI para desenhar um VOI de 3 mm3 no pulmão como órgão de referência. Evite qualquer derramamento do coração e músculo vizinhos.</li>
	<li>Após a conclusão, clique em Mostrar tabela ROI para renomear cada VOI. Grave a radioatividade média com o VOI e o volume de tecido em uma planilha. Arquive os desenhos voi e os dados de imagem em um dispositivo de armazenamento de dados.</li>
	<li>Calcule o valor de absorção padronizado (SUV) para todos os VOIs usando a seguinte equação11: SUVMEAN = Radioatividade VOI no kBq / (Decay - dose injetada corrigida no kBq / peso corporal do rato em kg), assumindo uma densidade tecidual de 1 g/mL.</li>
</ol>

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Cannon, B., Brown Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Review. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Jal Wu,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and.</a> 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+beta3-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a beta3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Ishibashi, J., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+can+be+slimming%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beige can be slimming.</a> Science. 328 (5982), 1113-1114 (2010).</li>
<li>Jal Schulz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown-fat+paucity+due+to+impaired+BMP+signalling+induces+compensatory+browning+of+white+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brown-fat paucity due to impaired BMP signalling induces compensatory browning of white fat.</a> Nature. 495 (7441), 379-383 (2013).</li>
<li>Pal Cohen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li>
<li>Mal Cypess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>Aal vander Lans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+acclimation+recruits+human+brown+fat+and+increases+nonshivering+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cold acclimation recruits human brown fat and increases nonshivering thermogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3395-3403 (2013).</li>
<li>Jal Hanssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+cold+acclimation+improves+insulin+sensitivity+in+patients+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Short-term cold acclimation improves insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Nature Medicine. 21 (8), 863-865 (2015).</li>
<li>Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+brown+fat+in+mice+with+18F-FDG+micro-PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 69, (2012).</li>
<li>Greenwood, H. E., Nyitrai, Z., Mocsai, G., Hobor, S., Witney, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+PET%2FCT+imaging+using+a+multiple-mouse+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%3A+Official+Publication%2C+Scoiety+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput PET/CT imaging using a multiple-mouse imaging system.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Scoiety of Nuclear Medicine. 61 (2), 292-297 (2020).</li>
<li>Carter, L. M., Henry, K. E., Platzman, A., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-printable+platform+for+high-throughput+small-animal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%3A+Official+Publication%2C+Scoiety+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D-printable platform for high-throughput small-animal imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Scoiety of Nuclear Medicine. 61 (11), 1691-1692 (2020).</li>
<li>Jal Andersson,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+cold-induced+brown+adipose+tissue+glucose+uptake+rate+measured+by+%2818%29F-FDG+PET+using+infrared+thermography+and+water-fat+separated+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Estimating the cold-induced brown adipose tissue glucose uptake rate measured by (18)F-FDG PET using infrared thermography and water-fat separated MRI.</a> Scientific Reports. 9 (18), 12358(2019).</li>
<li>Eal Lundstrom,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+estimated+with+the+magnetic+resonance+imaging+fat+fraction+is+associated+with+glucose+metabolism+in+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Obesity%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue estimated with the magnetic resonance imaging fat fraction is associated with glucose metabolism in adolescents.</a> Pediatric Obesity. 14 (9), (2019).</li>
<li>Eal Lundstrom,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+cooling-reheating+protocol+indicates+decreased+fat+fraction+via+lipid+consumption+in+suspected+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging cooling-reheating protocol indicates decreased fat fraction via lipid consumption in suspected brown adipose tissue.</a> PLoS One. 10 (4), 0126705(2015).</li>
<li>Nakamura, Y., Yanagawa, Y., Morrison, S. F., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medullary+reticular+neurons+mediate+neuropeptide+Y-induced+metabolic+inhibition+and+mastication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Medullary reticular neurons mediate neuropeptide Y-induced metabolic inhibition and mastication.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 322-334 (2017).</li>
<li>Jal Fueger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+animal+handling+on+the+results+of+18F-FDG+PET+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%3A+Official+Publication%2C+Scoiety+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Scoiety of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).</li>
<li>Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+mouse+tail-vein+injections+both+qualitatively+and+quantitatively+on+small-animal+PET+tail+scans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine+Technology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans.</a> Journal of Nuclear Medicine Technology. 39 (4), 264-270 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Neste estudo, foi descrita uma imagem baseada em PET/MR e quantificação de tecido adiposo marrom e bege funcional em animais de pequeno porte. Este método utiliza o análogo de glicose não metabolizável [18F]FDG como biomarcador de imagem para identificar os tecidos adiposos com alta demanda de glicose de forma não invasiva. Mr oferece bom contraste de tecido mole e pode diferenciar melhor os tecidos adiposos dos tecidos moles e músculos vizinhos. Quando combinado com PET, isso permite a imagem e quantificação ...

Em resposta às mudanças nas necessidades nutricionais, o tecido adiposo serve como um cache energético para adotar o armazenamento lipíde ou o modo de mobilização para atender às necessidades do corpo1. Além disso, o tecido adiposo também desempenha uma função fundamental na termoregulação, através de um processo chamado termogênese não-trêmica, também chamado de termogênese facultativa. Isso é tipicamente conseguido pelo tecido adiposo marrom (BAT), que expressa um nível abundante de proteína de membrana mitocôndria desacoplamento da proteína 1 (UCP1). Como portador de prótons, o UCP1 gera calor desacoplando o transporte de prótons e a produção ATP2. Após a estimulação a frio, a termogênese no BAT é iniciada pela ativação do sistema nervoso simpático (SNS), seguido pela liberação de norepinefrina (NE). Ne se liga aos receptores β3 adrenérgicos e leva à elevação do AMP cíclico intracelular (cAMP). Como consequência, o engajamento dependente de cAMP/PKA do CREB (proteína vinculante de elemento de resposta cAMP) estimula a transcrição do Ucp1 por meio de vinculação direta aos elementos de resposta creb (CRE)2. Além do BAT, os adipócitos de forma marrom também são encontrados dentro do tecido adiposo branco e são, portanto, chamados de células bege ou brite (marrom-em-branco)1,3. Em resposta a estímulos específicos (como o frio), essas células bege quiescentes são remodeladas para exibir múltiplas características semelhantes a marrons, incluindo gotículas lipídicas multiloculares, mitocôndrias densamente embaladas e expressão aumentada de UCP13,4,5.
Estudos em animais demonstraram que os adipócitos marrons e beges possuem múltiplos benefícios metabólicos além de seu efeito redutor de gordura, incluindo a sensibilização da insulina, redução lipídica, anti-inflamação e anti-aterosclerose6,7. Em humanos, a quantidade de gordura bege/marrom está inversamente correlacionada com a idade, índice de resistência à insulina e distúrbios cardiometabólicos8. Além disso, a ativação de adipócitos bege/marrom em humanos por aclimatação fria ou β3 agonista receptor adrenérgico confere proteção contra uma série de distúrbios metabólicos4,9,10. Essas evidências indicam coletivamente que a indução do tecido adiposo marrom e bege é uma estratégia terapêutica potencial para o manejo da obesidade e suas complicações médicas relacionadas8.
Curiosamente, embora compartilhem função semelhante, adipócitos bege e castanhos clássicos são derivados de diferentes precursores e ativados por mecanismos sobrepostos, mas distintos1. Portanto, a imagem in vivo e a quantificação de adipócitos marrons e beges são essenciais para obter uma melhor compreensão do controle molecular desses tecidos adiposos. Atualmente, a tomografia de emissão de pósitrons (PET) combinada com tomografia computadorizada (TC) continua sendo o padrão ouro para caracterização de células parógênicas e bege termogênicas em estudos clínicos8. A ressonância magnética (MrI) utiliza poderosos campos magnéticos e pulsos de radiofrequência para produzir estruturas anatômicas detalhadas. Em comparação com a tomografia computadorizada, a ressonância magnética gera imagens de órgãos e tecidos moles com maior resolução. Fornecido aqui é um protocolo para visualização e quantificação de adiposos marrons e bege funcionais em modelos de camundongos após aclimatação à exposição a frio, uma maneira comum e mais confiável de induzir o browning adiposo. Este método pode ser aplicado para caracterizar os depósitos de adiposos termogênicos em pequenos modelos animais com alta precisão.

<table><tbody><tr><td>Solução salina estéril a 0,9%</td><td>BBraun</td><td></td><td>0,9% cloreto de sódio infusão intravenosa, 500 mL</td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS05L</td><td>Seringa de 5 mL Calibrador de dose Luer Lock</td></tr><tr><td></td><td>Biodex</td><td></td><td>Atomlab 500</td></tr><tr><td>Lubrificante ocular</td><td>Alcon Duratears</td><td></td><td>Pomada lubrificante ocular estéril, 3,5 g</td></tr><tr><td>Seringa</td> de <td>insulina Terumo</td><td>10ME2913</td><td>Seringa de insulina de 1 mL com agulha</td></tr><tr><td>InterView Fusion software</td><td>Mediso</td><td>Version 3.03</td><td>Software de pós-processamento e análise de imagem</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Chanelle Pharma</td><td></td><td>Iso-Vet, anestésico inalatório, 250 mL</td></tr><tr><td>de cetamina</td><td>Alfasan International B.V.</td><td>HK-37715</td><td>Solução injetável de cetamina a 10%, 10 mL</td></tr> de <tr><td>oxigênio médico</td><td>Linde HKO</td><td>101-HR</td><td>gás comprimido, 99,5% de pureza</td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>5 mg/mL Solução injetável de meloxicam para cães e gatos, 10 mL</td></tr><tr><td>nanoScan PET/MR Scanner</td><td>Mediso</td><td></td><td>3 Tesla MR</td></tr><tr><td>Nucline nanoScan software</td><td>Mediso</td><td>Version 3.0</td><td>Scanner software operacional</td></tr><tr><td>Clipes de ferida</td><td>Reflex 7</td><td>203-100</td><td>7mm Clipes de aço inoxidável, 20 clipes</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfasan International B.V.</td><td>HK-56179</td><td>Solução injetável de xilazina a 2%, 30 mL</td></tr></tbody></table>

visualização e quantificação de tecidos adiposos marrons e bege em camundongos usando [18f]fdg micro-pet/mr imaging

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Os adipócitos marrons e beges são agora reconhecidos como potenciais alvos terapêuticos para obesidade e síndromes metabólicas. Métodos de imagem molecular não invasivos são essenciais para fornecer insights críticos sobre esses depósitos de adiposos termogênicos. Aqui, o protocolo apresenta um método baseado em imagem PET/MR para avaliar a atividade de adipócitos marrons e bege no tecido adiposo marrom interscapular do rato (iBAT) e tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (iWAT). A visualização e quantificação dos depósitos de adiposos termogênicos foram obtidas utilizando-se o FDG ,o análogo de glicose não metabolizável, como o radiotracer, quando combinado com as informações anatômicas precisas fornecidas pela imagem mr. A imagem PET/MR foi realizada 7 dias após a aclimatação a frio e a quantitação do sinal FDG em diferentes depósitos adiposos foi realizada para avaliar a mobilização relativa de tecidos adiposos termogênicos. A remoção do iBAT aumentou substancialmente a captação de FDG evocada a frio no iWAT dos camundongos.

Três grupos de camundongos (n = 3 por grupo) foram submetidos a imagens micro-PET/MR neste estudo, onde estavam alojados em termoneutralidade (30 °C) ou frio (6 °C) durante 7 dias. Um grupo de camundongos (n = 3) teve seu iBAT removido (iBATx) antes do tratamento frio (Figura 1A). Este método levou a uma alteração na atividade do tecido adiposo branco em todos os três camundongos. Em particular, observou-se um aumento notável na absorção de FDG [18F], utilizando-se imagens micro-P...

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods ...

A imagem PET/MR permite medições qualitativas e quantitativas nesses adipócitos marrons e beges metabolicamente ativos em animais vivos para que a atividade desses chamados adipócitos termogênicos possa ser medida de forma funcional. A principal vantagem dessa técnica é que permite a aquisição e combinação de tomografias pet e ressonância magnética sobre o mesmo assunto, possibilitando assim a aquisição precisa e simultânea de adipócitos termogênicos em diferentes depósitos do pequeno animal. Este método pode ser facilmente transferido para qualquer sistema pré-clínico ou modificado em um formato de alto rendimento por imagens simultâneas de múltiplos camundongos, aumentando assim o poder estatístico dos dados de imagem a um custo e tempo reduzidos.Para colher o tecido adiposo marrom interscapular, coloque um rato C57 Black 6 de 8 semanas anestraado em uma almofada de aquecimento e faça uma incisão de 2 centímetros ao longo da linha média dorsal. Remova as almofadas iBAT da região interescapular. Depois que o sangramento parar, use clipes de aço inoxidável de 7 milímetros para fechar a incisão.Quando todo o iBAT for coletado, abriga os ratos em uma unidade de terapia intensiva por 14 dias. Administre 5 miligramas por quilograma de Meloxicam nos camundongos por seis dias e remova os clipes assim que a ferida estiver cicatrizada. Para permitir varreduras automatizadas sequenciais pet/mr antes da sessão de imagem, defina o nível de discriminação para 400 a 600 kiloelectron-volts, o modo de confiança para 1-3, o tempo de digitalização para 20 minutos e o isótopo do estudo para F-18 para definir o fluxo de trabalho para aquisição de PET.Para adquirir ressonância magnética ponderada em T1 para correção de atenuação, defina os parâmetros Gradient Echo-3D. Para adquirir ressonância magnética ponderada em T2 como referência anatômica, defina os parâmetros Echo 2D de giro rápido. Para permitir a reconstrução das imagens PET, use o algoritmo Tera-Tomo 3D com o modo de coincidência definido para 1-3 e com a decadência, tempo de indagável, atenuação aleatória e correções de dispersão definidas para criar imagens com um tamanho geral de voxel de 0,3 milímetros cúbicos.Um dia antes do início do estudo de imagem para verificar a precisão da quantitação PET, coloque o EPI apropriado e encha uma seringa de 5 mililitros com F18-FDG conforme recomendado pelo fabricante. Use um calibrador de dose para registrar a atividade da seringa e observar o tempo da medição. No software, use o ROI de Elipse Interpolada para desenhar um volume de interesse na imagem reconstruída da seringa e comparar a atividade recuperada com o valor medido usando o calibrador de dose.No dia do experimento de imagem, use fórceps para colocar cuidadosamente o frasco de estoque 18F-FDG atrás de um escudo de mesa de bloco L e diluir uma alíquota de radioisótopo em 100 a 150 microlitres de soro fisiológico estéril para uma concentração total de atividade de 200 a 250 microcuries. Desenhe a solução 18F-FDG em uma seringa de 1 mililitro equipada com uma agulha e meça a radioatividade com o calibrador de dose como demonstrado. Registo o peso do mouse a ser imageado antes de injetar a solução 18F-FDG em uma veia traseira.Tome nota do tempo de injeção e da radioatividade residual da seringa para permitir a correção da decadência. Em seguida, coloque o rato de volta em sua gaiola por 60 minutos. Para calcular a atividade injetada 18F-FDG, subtraia a atividade na seringa antes da injeção da atividade medida após a injeção.No final do período de absorção do radioisótopos, ligue o aquecedor de ar para o leito do mouse do scanner micro-PET/MR. Coloque o mouse injetado por FDG anestesiado em uma almofada respiratória na cama do scanner e realize uma visão de batedor para determinar a posição do mouse. Ajuste a posição do leito do rato de modo que todo o corpo possa ser observado, garantindo que o centro do campo de visão da ressonância magnética coincida com o centro do corpo.Em PET Acquisition, selecione Scan Range na Aquisição Anterior para usar a posição de exibição do scout e clique em Preparar para mover o leito animal de MR para PET. Selecione OK para iniciar a varredura PET. Registo da dose de injeção e tempo medido antes e depois da administração 18F-FDG no Editor Radiofarmacêutico e digite o peso do mouse no menu Informações de Assunto.Uma vez concluída a varredura PET, selecione Preparar para mover para imagens mr e concluir todas as aquisições de MR na janela da lista de estudo. Selecione OK para iniciar as varreduras de Mr. Após todo o fluxo de trabalho ter sido concluído, avalie brevemente a qualidade das imagens de MR adquiridas no software pós-processamento e clique em Casa para mover a cama do mouse de MR para a posição original.Quando todos os ratos tiverem sido imagens, para reconstruir os dados no menu Raw Scan, selecione a Aquisição PET para carregar a varredura PET concluída e selecione a aquisição de MR ponderada por T1 para permitir que um mapa de material seja criado. Em seguida, use o algoritmo Tera-Tomo 3D para reconstruir os dados como demonstrado. A remoção do iBAT antes do tratamento a frio altera a atividade do iWAT, como indicado pelo notável aumento na absorção 18F-FDG observada no iWAT por imagens micro-PET/MR.Além disso, os adipócitos multiloculares, que são caracteristicamente observados no tecido adiposo bege, são mais pronunciados no iWAT de camundongos após a remoção do iBAT em comparação com a morfologia adipócito observada no iWAT de animais operados por vergonha. Ratos tratados a frio e operados por vergonha demonstram uma absorção acentuadamente elevada de 18F-FDG no iBAT. Camundongos com seu iBAT removido antes do tratamento frio mostram a maior absorção de 18F-FDG no iWAT.De fato, a exposição ao frio causa um aumento de sete vezes na absorção de 18F-FDG no iBAT de camundongos operados por vergonha, enquanto a remoção do iBAT nos camundongos induzidos a frio resulta em um aumento de oito vezes na absorção de 18F-FDG em comparação com camundongos termo neutros, nos quais apenas um aumento de duas vezes modesto é observado. Ao tentar este procedimento, colocar cada rato em uma mesma posição para cada aquisição pet/mrI é importante para melhorar a visualização e quantificação de adipócitos marrons e bege em diferentes regiões. Usando este método e juntamente com outros métodos de ressonância magnética, como a difusão com imagem ou termometria, mais insights sobre a distribuição espacial e prevalência de adipócitos marrons e beges em camundongos podem começar, o que pode potencialmente ser traduzido em humanos.Este método permite que os pesquisadores estudem a função desses adipócitos castanhos e beges termogênicos. Portanto, são especialmente poderosos quando estudam as vias termogênicas não clínicas em que esses marcadores clássicos não são alterados ou regulados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Análise de conteúdo de gordura é rotineiramente realizada em estudos utilizando modelos murinos obesidade. Métodos emergentes de pequenos animais a tomografia computadorizada ea análise estão fornecendo para longitudinal de análise de conteúdo de gordura riqueza de detalhes. Aqui passo detalhamos por procedimentos passo para a realização de pequenos animais tomografia computadorizada, análise e visualização.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Um método de imagiologia funcional do rato tecido adiposo castanho (BAT), que é descrito no frio estimulada a captação de 18F-fluorodeoxiglicose (FDG) em BAT é avaliada de forma não invasiva com um protocolo padronizado micro-PET/CT. Este método é robusto e sensível para detectar diferenças nas atividades da BAT em modelos do rato.

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Neste relatório em vídeo, mostramos a aplicação da Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) para tecido adiposo marrom interescapular em camundongos sob condições ativadas e deprimidas.

Cerenkov luminescência imagem de Interscapular Brown tecido adiposo

O método aqui apresentado utiliza 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) tomografia por emissão de pósitrons / tomografia computadorizada (PET-CT) e água gordura separada ressonância magnética (MRI), cada digitalizada seguinte 2 exposição hr para termoneutro (24 ° C ) e condições de frio (17 ° C), a fim de mapear tecido adiposo castanho (BAT) em seres humanos adultos.

Brown Human Tissue adiposo Depots automaticamente segmentada por Positron Emission Tomography / Tomografia Computadorizada e registrado ressonância magnética

Utilizando software livre, open-source, desenvolvemos uma abordagem analítica para quantificar o volume total e regional adiposo tecido marrom (BAT) e a atividade metabólica de morcego usando 18F-FDG PET/CT.

Todo o corpo e quantificação Regional de ativo humano marrom tecido adiposo usando 18F-FDG PET-CT

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos e animais de laboratório.

Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

A ultracentrífuga analítica (AUC) célula de amostra detém amostra e tampão de referência e durante as experiências e é exposto a alto vácuo e velocidades de rotor até 60.000 rpm. Este vídeo vai demonstrar a atenção rigorosa ao pormenor necessário para o carregamento, montagem e alinhamento deste componente muito importante de um experimento AUC.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Os métodos tradicionais de avaliação adipogenic diferenciação são baratos e fáceis de usar, mas não são específicos para alterações na expressão gênica. Nós desenvolvemos um ensaio para quantificar a diferenciação de células mesenquimais em adipócitos maduros, usando um marcador específico de linhagem. Este ensaio tem diversas aplicações através de pesquisa básica e clínica médica.

Visualização e quantificação de células mesenquimais Adipogenic diferenciação potencial com um marcador específico da linhagem

Aprenda a visualizar e quantificar tecidos adiposos marrons e bege em camundongos usando imagem micro-PET/MR com [18F]FDG. Este método não invasivo permite avaliar a atividade termogênica in vivo após aclimatação ao frio.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [^18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

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