Name: Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a gerar, manter e caracterizar organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Este protocolo melhora a reprodutibilidade, escalabilidade e eficiência na pesquisa de biologia de células-tronco.

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<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1%</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubo Corning de 15 mL</td><td>Falcão</td><td>21008-918</td><td>N/A</td></tr><tr><td>30% de sacarose</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito em PBS.</td></tr><tr><td>5% de soro de burro normal</td><td>Laboratório de ImunoPesquisa Jackson</td><td>017-000-121</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubo Corning de 50 mL</td><td>Falcão</td><td>21008-951</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Científico</td><td>A1110501</td><td>Solução de descolamento celular; alíquota de 5 mL de Accutase em tubos de 10 mL totalizando 20 tubos e armazenar a -20 &deg; C por até 6 meses. Coloque em 4 &graus; C durante a noite antes de usar.</td></tr><tr><td>Ativina A</td><td>Sistemas de orientação celular</td><td>GFH6-100x10</td><td>Reconstitua o pó liofilizado a 100 &micro; g/mL em PBS estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA). Alíquota 38 &micro; L de Activina A em tubos de microcentrífuga pré-resfriados e armazenar a -80 &deg; C (Os tubos expiram 12 meses a partir da data de recebimento).</td></tr><tr><td>Activin Dia 1 médio (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Use aminoácidos não essenciais (NEAA, Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 1: 500 mL de RPMI 1640 e 500 mL de NEAA. Ao preparar o meio Activin Day 1, adicione 13 mL de meio básico dia 1, 13 &micro; l de Activina A (100 &micro; g/mL) e 2 &micro; l de BMP4 (100 &micro; g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.</td></tr><tr><td>Activin Dia 2 médio (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03T</td><td>Use aminoácidos não essenciais (Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 2: 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA e 1 mL de soro a 0,2%. Ao preparar o meio Activin Day 2, adicione 12,5 mL de meio básico dia 2 e 12,5 &micro; L de Activin A (100 &micro; g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.</td></tr><tr><td>Activin Dia 3 médio (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03T</td><td>Use aminoácidos não essenciais (Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 3: 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA e 10 mL de soro a 2%. Ao preparar o meio Activin Day 3, adicione 12,5 mL de dia básico 3 e 12,5 &micro; L de Activin A (100 &micro; g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-cabra</td><td>Thermo Científico</td><td>Rolamento A11055</td><td>Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-Coelho</td><td>Thermo Científico</td><td>A21206</td><td>Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Burro anti-rato</td><td>Thermo Científico</td><td>Resposta A10036</td><td>Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Burro anti-rato</td><td>Thermo Científico</td><td>Resposta 31571</td><td>Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)</td></tr><tr><td>Molde de base</td><td>Pescador</td><td>22-363-552</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Meio intestinal básico (DMEM avançado)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>&nbsp; Ao preparar o meio intestinal básico, adicione 500 mL de DMEM, 500 mL de N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL de B27 (Gibco), 500 mL de L-Glutamina para obter 2 mM de L-Glutamina (Corning A2916801), 5 mL de 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina (Gibco 15-140-122) e 7,5 mL de&nbsp; HEPES de 1 M para obter HEPES de 15 mM.&nbsp; O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.</td></tr><tr><td>Sistema de detecção de PCR em tempo real Biorad CFX96 Touch</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td>Outros sistemas qRT-PCR podem ser usados.</td></tr><tr><td>Solução de recuperação celular</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Solução degradante de ECM</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>4000410</td><td>Reconstitua adicionando 2,15 mL de DMSO a 10 mM. Prepare 50 &micro; L alíquotas e armazenar a -20 &deg;C.&nbsp; Armazene o pó a 4 & graus; C, protegido da luz.</td></tr><tr><td>Meio de padronização CTRL HIO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Meio intestinal básico e 100 ng/mL EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Diluição 1:100 (anticorpo secundário)</td></tr><tr><td>Monocamada DE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>A monocamada foi gerada em etapas anteriores (Seção 4.4).</td></tr><tr><td>Exibir</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td>Ressuspenda o pó liofilizado em Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) até uma concentração final de 1 mg / mL. Filtre a solução para esterilização aspirando usando um tubo de esterilização com filtro Millipore. Faça alíquotas de 10 mL (1 mg / mL) e armazene a -20 graus; C por até 6 meses. Coloque em 4 &graus; C durante a noite antes de usar.</td></tr><tr><td>FEG</td><td>Thermo Científico</td><td>236-EG-01M</td><td>Ao preparar 100 ng/mL EGF reconstituir 500 &micro; g/mL em PBS estéril. Em seguida, adicione 2 mL de PBS estéril a 1 mg de EGF e faça 500 &micro; g/mL de solução EGF. Alíquota 100 &micro; L de EGF em 20 tubos.</td></tr><tr><td>Placas de Petri Fisherbrand 6 cm com tampa transparente</td><td>Pescador</td><td>FB0875713A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Levantador de células Fisherbrand</td><td>Pescador</td><td>08-100-240</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Frascos de vidro transparente Fisherbrand Classe B com fechos anexados</td><td>Pescador</td><td>03-338B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipeta de Pasteur de Vidro Borossilicato Descartável Fisherbrand</td><td>Pescador</td><td>13-678-2D0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fluoromount G Meio de Montagem Deslizante</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Gibco avançado DMEM</td><td>Gibco</td><td>12-491-023</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cabra anti-E-Caderina</td><td>R& D</td><td>AF648</td><td>Diluição 1:400 (anticorpo primário)</td></tr><tr><td>Cabra anti-SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>Diluição de 1:500 (anticorpo primário)</td></tr><tr><td>HCOs padronizando o meio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Meio intestinal básico, 100 ng/mL EGF e 100 ng/mL BMP2. Ao preparar o BMP2, adicione 1 mL de HCl 4 mM estéril 0,1% BSA aos frascos para injetáveis de BMP2 (100 &micro; g). Alíquota 25 &micro; L de solução BMP4 em 4 tubos. O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)</td><td>Instalação de células-tronco pluripotentes</td><td>N/A</td><td>Células semeadas em uma placa de 24 poços revestida com Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).</td></tr><tr><td>Solução gelada de paraformaldeído a 4% (PFA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O pH deve ser 7,4.</td></tr><tr><td>Caneta de barreira hidrofóbica ImmEdge</td><td>Laboratórios de vetores</td><td>101098-065</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)</td><td>Instalação de células-tronco pluripotentes (Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati)</td><td>N/A</td><td>Outras linhas hESC ou iPSC podem ser usadas, mas o protocolo precisa ser otimizado para cada linha celular.</td></tr><tr><td>Micrótomo Leica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>LSM 880</td><td></td><td></td><td>microscópio confocal</td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Embasal Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Matriz qualificada por Matrigel hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Prepare 4 alíquotas de Matrigel que correspondem a volumes suficientes para fazer Matrigel diluído suficiente para pratos de 4 x 6 poços.</td></tr><tr><td>Meio de indução do intestino médio (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Aminoácidos não essenciais (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 &micro; M CHIR99021 e 500 ng/mL FGF4. O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.</td></tr><tr><td>Esferoides do intestino grosso</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Unidades de filtro a vácuo descartáveis estéreis MilliporeSigma Steriflip</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGP00525</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mouse anti-CDX2</td><td>BioGenex</td><td>MU392-UC</td><td>Diluição de 1:300 (anticorpo primário)</td></tr><tr><td>Rato anti-FOXA2</td><td>Abnova/Novus</td><td>H00003170-M01</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>mTeSR1 meio de crescimento completo</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>85870</td><td>Adicione 100 mL de suplemento de mTeSR (85870) em um meio de 400 mL de mTeSR (85870) e alíquota em tubos de 50 mL, evitando contaminação. Armazene a 4&deg; C até o uso.</td></tr><tr><td>Solução clara de Murray (também conhecida como BABB)</td><td>Murray</td><td>N/A</td><td>benzoato de benzilo 1:2 e álcool benzílico.</td></tr><tr><td>Meio de padronização NOG HIO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Meio intestinal básico, 100 ng/mL EGF e 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 &micro; g de NOGGIN em 250 &micro; l PBS estéril com 0,1% BSA).</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA</td><td>Takara</td><td>740955.25</td><td>Outros kits de isolamento de RNA podem ser usados.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 24 poços (Nunc)</td><td>Thermo Científico</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 24 poços revestida com Matrigel</td><td>Thermo Científico</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 6 poços (Nunc)</td><td>Thermo Científico</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 6-poços revestidos com&nbsp; Matrigel.</td><td>Thermo Científico</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Meio de crescimento para HIOs, CTRL HIOs e HCOs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Meio intestinal básico e 100 ng/mL EGF (concentração final)</td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino, 0,5% Triton X (PBS-T)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Tecnologias de DNA integradas, Inc. (IDT)</td><td>N/A</td><td>Os primers estão listados na Tabela 2 do protocolo.</td></tr><tr><td>Coelho anti-CDX2</td><td>Marca de célula</td><td>EPR22764Y</td><td>Diluição 1:100 (anticorpo primário)</td></tr><tr><td>Coelho anti-SATB2</td><td>Marca de célula</td><td>EP281</td><td>Diluição 1:100 (anticorpo primário)</td></tr><tr><td>Proteína BMP-4 humana recombinante</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td>Reconstitua o pó liofilizado a 100 &micro; g/mL em HCl 4 mM estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA). Adicione 4,17 mL de solução de HCl a 45,83 mL de água molecular, totalizando 50 mL de 1 M de HCl. Em seguida, adicione 200 &micro; L de 1 M HCl a 49,8 mL de água de grau molecular, totalizando 50 mL de 4 mM HCl. Em seguida, adicione 0,05 g de BSA a 50 mL de HCl 4 mM e filtre para tornar estéril. Alíquota estéril 4 mM HCl 0,1% BSA para 33 tubos de microcentrífuga totalizando e armazenando a -20 ° C. Adicionar 100 ° C; l de HCl 4 mM estéril 0,1% BSA para os frascos BMP4 (10 &micro; g) fazer solução BMP4 a 100 &micro; g/mL.</td></tr><tr><td>Proteína FGF-4 humana recombinante</td><td>R& D</td><td>235-F4-01M</td><td>Reconstituir a 100 &micro; g/mL em PBS estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina. Adicione 0,05 g de BSA em 50 mL de PBS para obter 0,1% de BSA. Filtro 0.22 &micro; M BSA para esterilizar o BSA. Alíquota 10 mL de BSA 0,1% em 5 tubos. Adicione 1 mg de FGF-4 em 10 mL de BSA estéril a 0,1%. Alíquota 250 &micro; L em tubos de microcentrífuga pré-resfriados 40 e armazene a -80 ° C.</td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>A concentração final é de 10 mM (10 mmol/L). Ressuspender em DMSO a 10 mM e esterilizar com filtro. Adicione 3 mL de PBS estéril a cada frasco. Aliqout 100 &micro; L de inibidor de ROCK em 30 tubos e armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA SuperScript VILO</td><td>Thermo Científico</td><td>11-754-250</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio SuperFrost Plus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Composto Tissue Tek OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

A geração bem-sucedida de esferoides durante o estágio de indução do intestino médio / posterior é indicativa de padronização bem-sucedida. Execute a coloração IF para CDX2 em esferoides flutuantes e na monocamada para confirmar se o padrão está correto. Embora a coloração no estágio de endoderme definitiva (DE) possa indicar a eficácia da indução de ED, a geração de esferoides não é possível sem uma indução eficiente de ED. Para testar a eficiência da indução de DE, realize coloração IF e/ou RT-qPCR para FOXA2 e SOX17.<...

Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

O protocolo a seguir descreve uma geração de organoides intestinais e colônicos humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Esta técnica permitirá ao usuário interrogar as vias envolvidas na padronização intestinal. Essa técnica permite que o usuário gere organoides específicos da região que são isogênicos. Este protocolo pode fornecer informações sobre os fatores que regulam o estabelecimento e a manutenção do padrão intestinal.[Narrador] Comece colocando uma matriz extracelular ou placa de 24 poços revestida com ECM dentro de um gabinete de biossegurança por 30 minutos para permitir que ela atinja a temperatura ambiente. Coloque a solução completa de descolamento de células médias mTeSR1 e o DMEM avançado dentro de um banho de esferas a 37 graus Celsius e deixe-os aquecer por 30 minutos. Prepare o meio de plaqueamento em um tubo cônico de 50 mililitros adicionando 13 mililitros de mTeSR1 e 13 microlitros de proteína quinase associada a Rho Y-27632 de 10 milimolares ou inibidor de ROCK. Para coletar células da placa de seis poços, aspire o meio de três a quatro poços e lave uma vez com dois mililitros de DMEM avançado por poço. Aspirar o DMEM avançado e distribuir um mililitro da solução de dissociação celular em cada alvéolo. Incube a placa por cinco a sete minutos dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Dissocie quaisquer aglomerados de células pipetando para cima e para baixo quatro a cinco vezes usando uma pipeta de cinco mililitros para preparar a suspensão celular. Adicione dois mililitros de DMEM avançado em cada poço. Pipete suavemente para cima e para baixo quatro a cinco vezes e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Gire as células a 300 G por três minutos em temperatura ambiente. Aspirar o meio do tubo sem aspirar o sedimento celular. E adicione seis mililitros do meio preparado de mTeSR1 mais inibidor de ROCK. Ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes. Em seguida, transfira a suspensão para o resto do mTeSR1 e do meio inibidor de ROCK dentro do tubo de 50 mililitros. Ressuspenda vigorosamente quatro a cinco vezes e conte as células usando um hemocitômetro. Aspire o ECM da placa de 24 poços antes de plaquear as células. Ressuspenda as células novamente pipetando para cima e para baixo duas a três vezes e dispense 0,5 mililitros da suspensão celular em cada poço. Balance suavemente a placa três vezes no sentido horário, três vezes no sentido anti-horário, três vezes para frente e para trás e três vezes de um lado para o outro para dispersar uniformemente as células. Transfira a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e incube por 24 horas. Após 24 horas, aspirar o meio gasto. Adicione 0,5 mililitros por poço de mTeSR1 e incube novamente por 24 horas nas mesmas condições. Prepare o meio completo de Activin no primeiro dia diluindo a solução estoque de 100 microgramas por mililitro de Activin A e 100 microgramas por mililitro de BMP4 em meio de primeiro dia de Activin em um tubo cônico. Aqueça o meio em um banho de esferas de 37 graus Celsius. Aspire o meio mTeSR1 da placa de 24 poços e adicione 0,5 mililitros de meio Activin dia um por poço. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 5% e incube por 24 horas. Verifique as células após 24 horas. Prepare o meio completo de Activina no segundo dia diluindo a solução estoque de 100 microgramas por mililitro de Ativina A em meio de Ativina no segundo dia em um tubo cônico e coloque o tubo em um banho de esferas de 37 graus Celsius. Remova a placa de diferenciação de 24 poços da incubadora de dióxido de carbono e remova o meio gasto. Dispense 0,5 mililitros de meio pré-aquecido Activin dia dois por poço e coloque a placa de volta dentro da incubadora de dióxido de carbono por 24 horas. Prepare o meio completo do terceiro dia de Activin diluindo a solução estoque de 100 microgramas por mililitro de Activin A no meio de terceiro dia de Activin em um tubo cônico e coloque o tubo em um banho de esferas de 37 graus Celsius. Remova o meio gasto e dispense 0,5 mililitros de meio Activin dia três por poço. Para começar com a diferenciação do endoderma definitivo em esferóides do intestino médio, adicione 25 mililitros de meio de indução do intestino médio com FGF4 em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque-o em um banho de esferas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para preparar o meio de indução completo do intestino médio, adicione 7,5 microlitros de CHIR99021 após o meio estar quente. Remova o meio gasto, dispense 0,5 mililitros de meio de indução do intestino médio por poço e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a condensação das células dentro da monocamada ocorrer no dia seguinte, substitua o meio gasto por um meio de indução fresco do intestino médio e coloque a placa de volta para incubação por 24 horas. Para evitar descartar os esferóides flutuantes durante a troca do meio, transfira o meio antigo para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 300 G por um minuto. Ressuspenda os esferóides em 12,5 mililitros de meio de indução do intestino médio fresco, adicione 0,5 mililitros por poço na mesma placa de 24 poços e incube por 24 horas na incubadora. No quarto dia de indução do intestino grosso, colha esferóides flutuantes dos poços das placas, coletando o meio em um tubo de 15 mililitros, seguido de centrifugação a 300 G por um minuto. A eficiência da indução definitiva do endoderme foi avaliada por meio da realização de coloração por imunofluorescência para FOXA2 e SOX17. A expressão de mRNA do fator HOX anterior HOXD3 foi considerada a mais alta em organoides intestinais humanos tratados com Noggin ou HIOs, menos no fator de crescimento epitelial ou HIOs tratados com EGF e mais baixa em organoides colônicos humanos tratados com BMP ou HCOs. Por outro lado, as expressões de mRNA de HOXA13 e HOXD13 foram baixas em HIOs e altas em HCOs. A coloração por imunofluorescência foi realizada para SATB2, CDX2 e CDH1 para determinar se o epitélio HCO estava adequadamente padronizado.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

Os organoides tornaram-se ferramentas valiosas para a modelagem de doenças. A matriz extracelular (MEC) orienta o destino da célula durante a geração de organoides, e o uso de um sistema que se assemelha ao tecido nativo pode melhorar a precisão do modelo. Este estudo compara a geração de organoides intestinais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas em ECM derivada de animais e hidrogéis livres de xeno.

Estudo Comparativo de Matrizes de Membrana Basal para Manutenção de Células-Tronco Humanas e Geração de Organoides Intestinais

Os organoides intestinais humanos devem ser inervados para melhor recapitular a estrutura e a função do intestino humano nativo. Aqui, apresentamos um método para incorporar um sistema nervoso entérico a essas construções.

Inervação de organoides intestinais humanos

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar organoides intestinais apicais a partir de culturas organoides incorporadas à matriz padrão. Ele também descreve a incorporação subsequente de EdU em células de proliferação ativa e a quantificação semiautomática de células EdU-positivas.

Geração de organoides intestinais apicais e avaliação da taxa de proliferação de organoides usando marcação EdU

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Aprenda a gerar, manter e caracterizar organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Este protocolo melhora a reprodutibilidade, escalabilidade e eficiência na pesquisa de biologia de células-tronco.

Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

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