Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

O protocolo a seguir descreve uma geração de organoides intestinais e colônicos humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Esta técnica permitirá ao usuário interrogar as vias envolvidas na padronização intestinal. Essa técnica permite que o usuário gere organoides específicos da região que são isogênicos. Este protocolo pode fornecer informações sobre os fatores que regulam o estabelecimento e a manutenção do padrão intestinal.

[Narrador] Comece colocando uma matriz extracelular ou placa de 24 poços revestida com ECM dentro de um gabinete de biossegurança por 30 minutos para permitir que ela atinja a temperatura ambiente. Coloque a solução completa de descolamento de células médias mTeSR1 e o DMEM avançado dentro de um banho de esferas a 37 graus Celsius e deixe-os aquecer por 30 minutos. Prepare o meio de plaqueamento em um tubo cônico de 50 mililitros adicionando 13 mililitros de mTeSR1 e 13 microlitros de proteína quinase associada a Rho Y-27632 de 10 milimolares ou inibidor de ROCK. Para coletar células da placa de seis poços, aspire o meio de três a quatro poços e lave uma vez com dois mililitros de DMEM avançado por poço. Aspirar o DMEM avançado e distribuir um mililitro da solução de dissociação celular em cada alvéolo. Incube a placa por cinco a sete minutos dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Dissocie quaisquer aglomerados de células pipetando para cima e para baixo quatro a cinco vezes usando uma pipeta de cinco mililitros para preparar a suspensão celular. Adicione dois mililitros de DMEM avançado em cada poço. Pipete suavemente para cima e para baixo quatro a cinco vezes e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Gire as células a 300 G por três minutos em temperatura ambiente. Aspirar o meio do tubo sem aspirar o sedimento celular. E adicione seis mililitros do meio preparado de mTeSR1 mais inibidor de ROCK. Ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes. Em seguida, transfira a suspensão para o resto do mTeSR1 e do meio inibidor de ROCK dentro do tubo de 50 mililitros. Ressuspenda vigorosamente quatro a cinco vezes e conte as células usando um hemocitômetro. Aspire o ECM da placa de 24 poços antes de plaquear as células. Ressuspenda as células novamente pipetando para cima e para baixo duas a três vezes e dispense 0,5 mililitros da suspensão celular em cada poço. Balance suavemente a placa três vezes no sentido horário, três vezes no sentido anti-horário, três vezes para frente e para trás e três vezes de um lado para o outro para dispersar uniformemente as células. Transfira a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e incube por 24 horas. Após 24 horas, aspirar o meio gasto. Adicione 0,5 mililitros por poço de mTeSR1 e incube novamente por 24 horas nas mesmas condições. Prepare o meio completo de Activin no primeiro dia diluindo a solução estoque de 100 microgramas por mililitro de Activin A e 100 microgramas por mililitro de BMP4 em meio de primeiro dia de Activin em um tubo cônico. Aqueça o meio em um banho de esferas de 37 graus Celsius. Aspire o meio mTeSR1 da placa de 24 poços e adicione 0,5 mililitros de meio Activin dia um por poço. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 5% e incube por 24 horas. Verifique as células após 24 horas. Prepare o meio completo de Activina no segundo dia diluindo a solução estoque de 100 microgramas por mililitro de Ativina A em meio de Ativina no segundo dia em um tubo cônico e coloque o tubo em um banho de esferas de 37 graus Celsius. Remova a placa de diferenciação de 24 poços da incubadora de dióxido de carbono e remova o meio gasto. Dispense 0,5 mililitros de meio pré-aquecido Activin dia dois por poço e coloque a placa de volta dentro da incubadora de dióxido de carbono por 24 horas. Prepare o meio completo do terceiro dia de Activin diluindo a solução estoque de 100 microgramas por mililitro de Activin A no meio de terceiro dia de Activin em um tubo cônico e coloque o tubo em um banho de esferas de 37 graus Celsius. Remova o meio gasto e dispense 0,5 mililitros de meio Activin dia três por poço. Para começar com a diferenciação do endoderma definitivo em esferóides do intestino médio, adicione 25 mililitros de meio de indução do intestino médio com FGF4 em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque-o em um banho de esferas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para preparar o meio de indução completo do intestino médio, adicione 7,5 microlitros de CHIR99021 após o meio estar quente. Remova o meio gasto, dispense 0,5 mililitros de meio de indução do intestino médio por poço e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a condensação das células dentro da monocamada ocorrer no dia seguinte, substitua o meio gasto por um meio de indução fresco do intestino médio e coloque a placa de volta para incubação por 24 horas. Para evitar descartar os esferóides flutuantes durante a troca do meio, transfira o meio antigo para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 300 G por um minuto. Ressuspenda os esferóides em 12,5 mililitros de meio de indução do intestino médio fresco, adicione 0,5 mililitros por poço na mesma placa de 24 poços e incube por 24 horas na incubadora. No quarto dia de indução do intestino grosso, colha esferóides flutuantes dos poços das placas, coletando o meio em um tubo de 15 mililitros, seguido de centrifugação a 300 G por um minuto. A eficiência da indução definitiva do endoderme foi avaliada por meio da realização de coloração por imunofluorescência para FOXA2 e SOX17. A expressão de mRNA do fator HOX anterior HOXD3 foi considerada a mais alta em organoides intestinais humanos tratados com Noggin ou HIOs, menos no fator de crescimento epitelial ou HIOs tratados com EGF e mais baixa em organoides colônicos humanos tratados com BMP ou HCOs. Por outro lado, as expressões de mRNA de HOXA13 e HOXD13 foram baixas em HIOs e altas em HCOs. A coloração por imunofluorescência foi realizada para SATB2, CDX2 e CDH1 para determinar se o epitélio HCO estava adequadamente padronizado.