Name: Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda ensaios de transcrição in vitro de Borreliella burgdorferi para estudar mecanismos de regulação gênica. Este método permite analisar fatores que afetam a atividade da RNA polimerase e desenvolver drogas contra a doença de Lyme.

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Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Investimento Estratégico em Ciências da Saúde Faculty Development Grant da Creighton University. A cepa B. burgdorferi RpoC-His10X foi gentilmente cedida pelo Dr. D. Scott Samuels da Universidade de Montana. A cepa de E. coli que abriga o plasmídeo pMAL-C5X que codifica um alelo rpoD marcado com proteína ligadora de maltose foi gentilmente cedida pelo Dr. Frank Gherardini do Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

1. Purificação da RNA polimerase e preparação do estoque de RNA polimerase
<ol><li>Coletar o pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) a uma densidade de2-4 x 107 células/mL utilizando protocolos de coleta celular previamente descritos28,29. Realizar centrifugação a 10.000 x g a 4 °C por 30 min em frascos centrífugos de 500 mL e despejar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 30 mL de tampão HN gelado (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Repita a etapa de centrifugação descrita acima usando um tubo centrífugo de 50 mL e decante o sobrenadante. NOTA: Ponto de parada. Congelar a pastilha celular a -80 °C para armazenar células por até 2 semanas ou proceder imediatamente à lise celular.</li>
	<li>Manter as células, lisar e proteínas purificadas a 4 °C ou no gelo, a menos que congelem. Manter a RNA polimerase em um ambiente redutor adicionando TDT recém-preparado a uma concentração de 2 mM a cada tampão usado neste protocolo e manter o pH 8,0.</li>
	<li>Preparar lisado a partir do pellet de células de B. burgdorferi usando um kit comercial de lise bacteriana seguindo as instruções do kit. Ressuspender o pellet em 10-15 mL de solução de B-PER à temperatura ambiente (TR) sem inibidor de protease e permitir que a lise prossiga por 5 min em gelo. O volume de lise depende do tamanho da pastilha celular, conforme descrito nas instruções do kit.</li>
	<li>Adicionar coquetel de inibidor de protease à solução de lise, seguido de três rodadas de sonicação, conforme descrito na seção de resultados representativos. NOTA: Alternativamente, lise as células em uma célula de pressão francesa, conforme descrito anteriormente24. Pule a etapa 1.4. e passo 1.5.</li>
	<li>Clarificar o lisado celular usando centrifugação e filtração usando um tubo de centrífuga de 50 mL. Encher o volume do tubo até pelo menos 30 ml de volume total adicionando tampão de carregamento da coluna de cobalto (Tabela 1) à solução. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min.</li>
	<li>Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de seringa de 0,45 μm.</li>
	<li>Diluir o lisado em tampão de carga da coluna de cobalto (quadro 1) utilizando uma relação de diluição final de 1:10.</li>
	<li>Realizar cromatografia de afinidade no sobrenadante de lisado celular clarificado usando uma coluna de cobalto ou níquel-resina seguindo as instruções do fabricante. Consulte a seção de resultados representativos para obter um exemplo. Use os buffers listados na Tabela 1. Coletar as amostras de fluxo, lavagem e eluição para análise.</li>
	<li>Trocar imediatamente a RNA polimerase na solução tampão de eluição por uma solução tampão de armazenamento de RNA polimerase (Tabela 1) usando uma coluna de troca de tampão seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Preparar as reservas congeladoras concentrando a RNA polimerase utilizando unidades filtrantes centrífugas de corte de 10 kDa, numa concentração de 0,2-0,4 mg/mL determinada por espectrofotometria (A280nm sem ajuste do coeficiente de extinção [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]).</li>
	<li>O congelador de RNA polimerase Aliquota armazena em volumes de 20-50 μL em tubos de PCR e armazena a RNA polimerase a -80 °C.</li>
	<li>Determinar a qualidade da cromatografia de afinidade por SDS-PAGE e medir o rendimento total de proteínas por espectrofotometria ou ensaio de BCA. Executar as amostras em um gel de poliacrilamida a 7,5% a 120 V por 50 min para uma boa resolução por SDS-PAGE.</li>
</ol>2. Purificação de RpoD recombinante e preparação de material de RpoD
<ol><li>Cultivar e induzir a expressão de B. burgdorferi RpoD recombinante marcado com Maltose Binding Protein (MBP-RpoD) em BL21::MBP-RpoDBb, conforme descrito pelo manual de instruções do sistema de purificação e fusão de proteínas listado na Tabela de Materiais, e coletar as células por centrifugação. NOTA: Ponto de parada. Congele os pellets de células a -80 °C para armazenar células por até 2 semanas ou proceda imediatamente à lise celular.</li>
	<li>Realizar lise usando um kit comercial de lise de células bacterianas ou células de pressão francesas. Veja o exemplo de buffer de lise na Tabela 1.</li>
	<li>Clarificar o lisado celular usando centrifugação e filtração. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 μm.</li>
	<li>Extrair MBP-RpoD utilizando um protocolo de extração de proteínas para o sistema de expressão. Consulte a seção de resultados representativos para obter detalhes e resultados de implementação.</li>
	<li>Determinar a qualidade do processo de cromatografia de afinidade e eluição por SDS-PAGE e medir o rendimento proteico por espectrofotometria (A280nm sem ajuste do coeficiente de extinção [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]). Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.</li>
	<li>Concentrar a MBP-RpoD utilizando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa até uma concentração de >2 mg/mL determinada por espectrofotometria.</li>
	<li>Cleave MBP do RpoD no local de clivagem do Fator Xa. Adicionar CaCl 2 às frações de eluição por cromatografia de afinidade contendo MBP-RpoD na concentração de2 mM. Adicionar 200 μg de Fator Xa Protease para cada 30 mg de proteína purificada. Incubar durante a noite no RT.</li>
	<li>Confirme a clivagem completa da MBP do RpoD por SDS-PAGE. Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.</li>
	<li>Diluir a solução contendo MBP e RpoD na proporção de 1:10 com um tampão de ligação à heparina.</li>
	<li>Separe a PAM e a DPOr na coluna de heparina por FPLC. Consulte a Tabela 2 para obter as configurações de FPLC.</li>
	<li>Determinar a qualidade dos produtos da cromatografia de afinidade por SDS-PAGE e medir o rendimento proteico por espectrofotometria. Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.</li>
	<li>Concentrar as fracções de eluição contendo RpoD utilizando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa para um volume final de 2-3 ml.</li>
	<li>O tampão troca as frações de eluição concentradas de RpoD para o tampão de armazenamento usando uma coluna de filtração em gel.</li>
	<li>Concentrar o estoque de RpoD usando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa para uma concentração de 0,2-0,8 mg/mL, determinada por espectrofotometria.</li>
	<li>Aliquot RpoD estoque em volumes de 20-50 μL em tubos de PCR e armazenar a -80 °C.</li>
</ol>3. Preparação do estoque de modelo de DNA
<ol><li>A PCR amplifica a região de 500 pb ao redor de um sítio promotor impulsionado por RpoD do DNA genômico de B. burgdorferi usando uma reação de 200 μL (Tabela 3).</li>
	<li>Purificar os produtos de PCR usando um kit de purificação PCR comercial. Eluir o DNA em biologia molecular grau H2O.</li>
	<li>Ajustar a concentração molar dos moldes de DNA gerados pela PCR para 100 nM por diluição em biologia molecular grau H2O.</li>
</ol>4. Realizar transcrição in vitro com incorporação de nucleotídeos radiomarcados
<ol><li>Preparar um plano experimental de transcrição in vitro . Determinar as concentrações de RNA polimerase, RpoD e molde de DNA. Determine os volumes de alíquotas e ordens de pipetagem para os tubos de reação. Veja a Tabela 4 e a Figura 1 para obter um exemplo. NOTA: Incluir controles no plano experimental, como reações que não contenham RNA polimerase, polimerase alternativa, nenhum modelo ou modelos alternativos.</li>
	<li>Calcular o volume de α-32P-ATP necessário para o experimento. Incorpore isso no plano experimental. Tipicamente, incluem 2 μCi de atividade por reação de transcrição in vitro para detecção de tela de fósforo.</li>
	<li>Preparar as superfícies de trabalho, incluindo a bancada de radiação, para reduzir o risco de contaminação por radiação.</li>
	<li>Descongelar alíquotas frescas de RNA polimerase, Rpo, 5x tampão NTP e soluções estoque modelo no gelo. Misture bem todos os estoques congelados descongelados antes de pipetar.</li>
	<li>Preparar uma mistura mestre de reação e uma mistura separada de NTP para nucleotídeos radiomarcados de acordo com o plano experimental.</li>
	<li>Dispensar as reações de controle e conjuntos experimentais em tubos de PCR em preparação para adicionar radiomarcação na reação. Distribua suavemente H2O, mistura mestre de reação, RNA polimerase e RpoD em tubos de PCR designados e misture por pipetagem.</li>
	<li>Transfira os materiais preparados para uma bancada de radiação.</li>
	<li>Adicione α-32P-ATP ao NTP e misture por pipetagem suave. CUIDADO: Ao trabalhar com material radioativo, use equipamentos de proteção apropriados e procedimentos de manuseio de isótopos radioativos.</li>
	<li>Adicionar NTP aos tubos contendo as misturas de reacções de transcrição in vitro da etapa 4.6.</li>
	<li>Iniciar a reação de transcrição in vitro com a adição de um molde de DNA. Misture o volume de reação pipetando suavemente.</li>
	<li>Incubar tubos a 37 °C durante 5 min num termociclador ou bloco de calor.</li>
	<li>Remova as reações do termociclador ou bloco de calor e adicione o corante de carregamento de RNA 2x contendo formamida a 50% a um volume de reação igual para interromper as reações de transcrição in vitro .</li>
	<li>Desnaturar as enzimas incubando reações a 65 °C por 5 min em um termociclador ou bloco de calor.</li>
	<li>Separar o RNA na mistura de reação de transcrição in vitro por eletroforese em gel usando géis de poliacrilamida de ureia TBE 10%-15% a 180 V por 30-45 min. NOTA: Dependendo das condições de eletroforese em gel, a solução tampão pode estar contaminada com nucleotídeos radiomarcados ou o gel pode conter a maioria ou todos os nucleotídeos radiomarcados. Planejar o armazenamento ou descarte adequado de radioatividade.</li>
	<li>Imagem do RNA radiomarcado usando fosfotela após a remoção de qualquer porção do gel contendo ATP radiomarcado não incorporado. Expor o gel à fosfotela durante a noite (16 h) e imagem usando um imageador de fosfotela (resolução de 100 μm, tensão do tubo de 700 V PMT).</li>
	<li>Analise os dados por meio de métodos de densitometria24.</li>
</ol>

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<li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li>
<li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li>
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<li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li>
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<li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+RNA+polymerase%3A+Tools+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li>
<li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447(2014).</li>
<li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling-circle+RNA+synthesis%3A+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li>
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<li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Ensaios de transcrição in vitro construídos usando o protocolo apresentado foram recentemente utilizados para estudar o papel de um fator de transcrição em B. burgdorferi e podem ser aplicados para construir experimentos semelhantes usando outros fatores de transcrição, fatores sigma e moléculas23. Uma vez que a RNA polimerase ativa de B. burgdorferi tenha sido obtida e sua atividade detectada, componentes e condições dentro dos ensaios de transcrição in vitro p...

A doença de Lyme e a febre recidivante são causadas por patógenos espiroquetas dos gêneros Borrelia e Borreliella 1,2,3. A doença de Lyme é uma proeminente doença transmitida por vetores na América do Norte e, consequentemente, a Borreliella burgdorferi é um organismo modelo proeminente para estudar a biologia das espiroquetas 4,5. Investigações sobre os mecanismos de regulação transcricional de B. burgdorferi visam compreender melhor suas adaptações às mudanças no ambiente à medida que circula entre seu carrapato vetor e hospedeiros mamíferos 6,7. Alterações no pH, temperatura, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes, ácidos graxos de cadeia curta, ácidos orgânicos e níveis de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono modulam a expressão de genes importantes para a sobrevivência de B. burgdorferi em seu artrópodes vetor e infectar animais 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. A ligação dessas respostas a estímulos com mecanismos regulatórios tem sido um aspecto importante na pesquisa com B. burgdorferi19.
Fatores de transcrição e fatores sigma controlam a transcrição de genes que realizam processos celulares. As espiroquetas de Lyme e febre recidivante abrigam um conjunto relativamente escasso de fatores de transcrição e fatores sigma alternativos. Apesar disso, existem complexas alterações transcricionais direcionando as respostas de B. burgdorferi ao ambiente20,21,22. Os mecanismos específicos que conduzem as mudanças transcricionais em B. burgdorferi em resposta a mudanças ambientais permanecem obscuros. Ensaios de transcrição in vitro são ferramentas poderosas para o emprego de uma abordagem bioquímica para testar a função e os mecanismos regulatórios dos fatores de transcrição e fatores sigma23,24,25,26.
Um sistema de ensaio de transcrição in vitro utilizando a RNA polimerase de B. burgdorferi foi recentemente estabelecido24. Como as bactérias frequentemente têm fisiologias celulares únicas, RNA polimerases de diferentes espécies e gêneros respondem diferentemente às condições de purificação enzimática, armazenamento enzimático e tampão de reação27. B. burgdorferi também está geneticamente distante das muitas espécies bacterianas nas quais RNA polimerases têm sidoestudadas20. Aspectos da preparação enzimática, tais como condições de lise, lavagem e tampão de eluição, tampão de armazenamento, tampão de reação de transcrição in vitro e o método de construção do ensaio podem alterar a atividade da RNA polimerase. Neste trabalho, fornecemos um protocolo para a purificação da RNA polimerase e do fator sigma RpoD, a produção de molde linear de DNA de fita dupla e a construção de ensaios de transcrição in vitro para facilitar a reprodutibilidade entre laboratórios que utilizam este sistema. Detalhamos um exemplo de reação para demonstrar a faixa linear para transcrição dependente de RpoD e discutimos limitações e alternativas para essa abordagem.

<table><tbody><tr><td>Filtro de seringa de 0,45 mícron</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2545</td><td>Etapa 1.7 e 2.3</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>MidSci</td><td>C50B</td><td>Etapa 1.3 e etapas subsequentes</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>3119-0050PK</td><td>Etapa 1.2</td></tr><tr><td>Garrafas de centrífuga de 500 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120-9500PK</td><td>Etapa 1.1</td></tr><tr><td>B-PER e manual de instruções</td><td>Thermo Scientific</td><td>78248</td><td>Etapa 1.4 e 2.2</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Etapa 2.6</td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Corte de 10 Kd</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8010</td><td>Etapa 1.11 e 2.11</td></tr><tr><td>Resina de cobalto e manual de instruções</td><td>Thermo Scientific</td><td>89969</td><td>Etapa 1.9</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Acros Organics</td><td>426380500</td><td>Etapa 1.4 e etapas subsequentes</td></tr><tr><td>Dnase (Nuclease)</td><td>Millipore Sigma</td><td>70746</td><td>Etapa 1.4 e 2.2</td></tr><tr><td>Fator Xa Protease&nbsp;</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCXA-0060</td><td>Etapa 2.6</td></tr><tr><td>GE Typhoon 5 Fosfoimager</td><td>GE lifesciences</td><td>Multiple</td><td>Etapa 4.15</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>Mutiple</td><td>Etapa 1.13 e etapas subsequentes de verificação de qualidade do produto</td></tr><tr><td>H2O para transcrição in vitro</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td>Etapa 3.2 e 3.3</td></tr><tr><td>kit</td> <td>de PCR de alta fidelidadeNew England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>Etapa 3.1</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Etapa 1.1 e etapas subsequentes</td></tr><tr><td>HiTrap Heparina HP 5 x 1 mL</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040601</td><td>Etapa 2.8</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-100G</td><td>Etapa 1.9</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Thermo Scientific</td><td>90082</td><td>Etapa 1.4 e 2.2</td></tr><tr><td>Magnésio cloreto&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25401</td><td>Etapa 4.1</td></tr><tr><td>Cloreto de manganês</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25418</td><td>Etapa 4.1</td></tr><tr><td>Mini tetracélula proteica</td><td>Bio-Rad</td><td>Mutiple</td><td>Etapa 1.13 e etapas subsequentes de verificação de qualidade do produto</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td>Etapa 4.1</td></tr><tr><td>Mistura NTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td>Etapa 4.1</td></tr><tr><td>PCR kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td>Etapa 3.2</td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>MidSci</td><td>PR-PCR28ACF</td><td>Etapa 1.12</td></tr><tr><td>PD-10 Coluna de troca de tampão Sephadex e manual de instruções</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Etapa 1.10 e 2.10 (coluna de filtragem de gel)</td></tr> <tr><td>pMAL Protein Fusion e Sistema de Purificação Manual de instruções</td><td>New England Biolabs</td><td>E8200S</td><td>Etapa 2.1</td></tr><tr><td>Géis de poliacrilamida AnyKD</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8125</td><td>Etapa 1.13 e etapas subsequentes de verificação de qualidade do protien</td></tr><tr><td>Glutamato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>Etapa 4.1</td></tr><tr><td>Inibidor de protease</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td>Etapa 1.4 e 2.2</td></tr><tr><td>ATP radiomarcado</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU503H</td><td>Etapa 4.2</td></tr><tr><td>Corante de carregamento de RNA, (2x)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>Etapa 4.13</td></tr><tr><td>Inibidor de Rnase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>Etapa 4.1</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Biotek</td><td>Mutiple</td><td>Etapa 1.13 e etapas subsequentes de verificação de qualidade</td></tr><tr><td>TBE-Ureia géis 10 por cento</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td>Etapa 4.14</td></tr></tbody></table>

componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de borreliella (borrelia) burgdorferi

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Borreliella burgdorferi é um patógeno bacteriano com repertórios metabólicos e genômicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados e carrapatos e remodela dramaticamente seu perfil transcricional para sobreviver em ambientes díspares durante a infecção. Um foco dos estudos de B. burgdorferi é entender claramente como a bactéria responde ao seu ambiente através de mudanças transcricionais. Ensaios de transcrição in vitro permitem dissecar bioquimicamente os mecanismos básicos de regulação transcricional. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo purificação e armazenamento da polimerase de RNA de B. burgdorferi , purificação do fator sigma, geração de molde de DNA e ensaios de transcrição in vitro . O protocolo descreve o uso da RNA polimerase purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC é uma cepa publicada anteriormente que abriga um 10XHis-tag no gene rpoC que codifica a maior subunidade da RNA polimerase. Os ensaios de transcrição in vitro consistem na RNA polimerase purificada da cepa 5A4-RpoC, uma versão recombinante do fator sigma housekeeping RpoD e um molde de DNA de fita dupla gerado por PCR. Enquanto as técnicas de purificação de proteínas e as abordagens para montagem de ensaios de transcrição in vitro são conceitualmente bem compreendidas e relativamente comuns, as considerações de manuseio para RNA polimerases frequentemente diferem de organismo para organismo. O protocolo aqui apresentado destina-se a estudos enzimáticos da RNA polimerase de B. burgdorferi. O método pode ser adaptado para testar o papel de fatores de transcrição, promotores e modificações pós-traducionais na atividade da RNA polimerase.

Em uma reação de transcrição in vitro em que a etapa limitante da reação é o início da transcrição mediada pelo fator sigma, a atividade de transcrição deve aumentar linearmente com a quantidade de fator sigma. Apresentamos a preparação de experimentos de transcrição in vitro testando uma faixa de concentrações de RpoD juntamente com duas concentrações de RNA polimerase para observar o sinal variável resultante da incorporação de nucleotídeos radiomarcados em produtos de RNA. Resultados representativos ...

Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.

Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

O sistema de ensaio de transcrição in vitro para Borreliella burgdorferi fornece uma ferramenta bioquímica para investigadores estudarem mecanismos e fatores regulatórios gênicos que governam a atividade enzimática da RNA polimerase. O sistema nos permite testar como fatores de transcrição, cofatores, concentrações de sal e pH afetam a função da RNA polimerase da Borreliella burgdorferi, o que contribui para nossa compreensão geral dos mecanismos de regulação gênica. Esta técnica poderosa também pode nos permitir rastrear drogas que inibem seletivamente a RNA polimerase, abrindo as portas para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a borreliose de Lyme.Para começar, colete o pellet celular de dois a quatro litros de Borreliella burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico a uma densidade de duas a quatro vezes 10 constantes por mililitros. Pastilha as células a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius em frascos centrífugos de 500 mililitros e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 30 mililitros de tampão HN gelado, repita a etapa de centrifugação e decante o sobrenadante.Enquanto trabalha, mantenha as célula

essential-components-borreliella-borrelia-burgdorferi-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Eggers, C. H. Manipulação genética mediada por phage da espiroqueta da doença de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura de Borrelia burgdorferi geneticamente modificada com DNA de bacteriófago dormente carregando um gene de resistência a antibióticos. Após a seleção e incubação de antibióticos, um indutor químico desencadeia danos ao DNA, levando à excisão, replicação e montagem de novos vírions contendo o gene de resistência. Após...

Preparação e Indução de Culturas de Borrelia burgdorferi para Produção de Partículas Virais

Source: Berthold, A., et al. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp.(2022)This video demonstrates the cultivation of pathogenic spirochetes from infected skin tissue to model dermal infection. It highlights their localization in the dermis, interaction with the extracellular matrix, and survival during selective culture conditions.

Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

PCR aninhado é uma técnica simples, sensível e específica que pode ser aplicada a escala que DNA extrai para sondar para Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme. A experiência inicial da PCR usa primeiras demão gene-específico para gerar amplicons longo, que em seguida tornar-se modelos para uma reação subsequente usando iniciadores internos.

Detectando a doença de Lyme espiroqueta, a Borrelia Burgdorferi, em carrapatos usando PCR aninhado

A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.

Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi

O cultivo in vitro é um método de detecção direta da presença de bactérias vivas. Este protocolo descreve métodos para o cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluindo as do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, espécies de Borrelia de febre recidivante e Borrelia miyamotoi.  Estas espécies são fastidiosas e de crescimento lento, mas podem ser cultivadas.

Métodos de Cultivo de Espiroquetas do Complexo Borrelia burgdorferi Sensu Lato e Borrelia de Febre Recidivante

Um sistema de análise de fluxo de fluorescência de três canais de duplo repórter foi usado para desenvolver um imunoensaio multiplex baseado em esferas que avalia simultaneamente amostras de soro para IgG e IgM eliciadas contra múltiplos antígenos de diferentes espécies de Borrelia que causam borreliose de Lyme na Europa e América do Norte.

Detecção Simultânea de Diferentes Classes de Anticorpos em um Teste Sorológico Multiplexado

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Aprenda ensaios de transcrição in vitro de Borreliella burgdorferi para estudar mecanismos de regulação gênica. Este método permite analisar fatores que afetam a atividade da RNA polimerase e desenvolver drogas contra a doença de Lyme.

Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

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