Name: Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a separar subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa usando imunomarcadores e FACS. Este método permite analisar respostas imunes específicas.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7222059) e pelo Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).

Amostras de sangue foram obtidas de pacientes com MI (n = 3), portadores saudáveis de EBV (n = 3) e crianças não infectadas por EBV (n = 3). Os voluntários foram recrutados do Hospital Infantil de Pequim, da Universidade Médica da Capital, e todos os estudos foram aprovados eticamente. A aprovação ética foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: [2021]-E-056-Y). O consentimento informado dos pacientes foi dispensado, pois o estudo utilizou apenas as amostras restantes para testes clínicos. Todos os dados foram totalmente desidentificados e anonimizados para proteger a privacidade do paciente.
1. Isolamento de PBMCs do sangue periférico
<ol><li>Coletar sangue periférico fresco (2 mL) de pacientes com MI em tubos de EDTA K3por punção venosa padrão. NOTA: O processo precisa ser rápido para manter a viabilidade celular.</li>
	<li>Diluir o sangue periférico em volume duplo com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e colocá-lo em camadas sobre o meio de separação de linfócitos humanos (densidade: 1,077 ± 0,001 g/mL) em um tubo de centrífuga de 15 mL. NOTA: A razão de volume de sangue, PBS e meio de separação foi de 1:1:1. Adicione o sangue lentamente ao meio de separação e centrifugar imediatamente para evitar que o sangue se deposite no meio de separação.</li>
	<li>Centrífuga a 800 × g durante 20 min à temperatura ambiente. Transfira a camada intermediária (PBMCs enriquecidos) para outro tubo de centrífuga de 15 mL. NOTA: Após a centrifugação, na parte inferior do tubo estão os eritrócitos, a camada intermediária é o meio de separação, a camada superior é o plasma, e entre a camada plasmática e a camada líquida de separação estavam os PBMCs (incluindo linfócitos e monócitos).</li>
	<li>Lavar os PBMCs com 10 mL de PBS e centrifugar a 800 × g por 20 min à temperatura ambiente; descarte o sobrenadante com cuidado.</li>
	<li>Repetir a lavagem e centrifugação (passo 1.4) 2 x. Ressuscite os PBMCs com 1 mL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e conte as células com um contador automatizado à base de azul de tripano.</li>
</ol>2. Isolamento de monócitos CD14+ de PBMCs usando microesferas CD14
<ol><li>Preparar uma solução tampão contendo 0,5% de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de EDTA em PBS (pH 7,2). Mantenha o tampão frio (2−8 °C). NOTA: Desgaseifique o buffer antes de usar como bolhas de ar pode bloquear a coluna. Mantenha as células frias para evitar o tamponamento dos anticorpos na superfície celular e a marcação celular inespecífica.</li>
	<li>Centrifugar os PBMCs a 300 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado. Ressuspenda as células com 80 μL do tampão. Adicione 20 μL de microesferas CD14 à suspensão celular. NOTA: Se houver ≤107 PBMCs, use o volume indicado acima. Se houver >107 PBMCs, aumente proporcionalmente todos os volumes de reagentes e o volume total.</li>
	<li>Misture bem as microesferas CD14 e as células no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incube por 15 min em geladeira a 4 °C. Lavar os PBMCs com 1 mL de tampão e centrífuga a 300 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte completamente o sobrenadante. Ressuspenda as células com 500 μL do tampão. NOTA: Se houver ≤108 PBMCs, use o volume indicado acima. Se houver >108 PBMCs, aumente proporcionalmente o volume do buffer.</li>
	<li>Separação magnética com colunas:<ol><li>Coloque a coluna no separador magnético do talão e lave a coluna com 3 mL de tampão. Adicione a suspensão da célula (da etapa 2.3) à coluna.</li>
		<li>Recolher as células não marcadas que passam através da coluna para um tubo de centrífuga de 15 ml e lavar a coluna com 3 ml de tampão. Lave a coluna com 3 x 3 mL de tampão. Coletar o efluente total no tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão à coluna. Empurre o êmbolo firmemente para dentro da coluna para liberar imediatamente as células marcadas magneticamente para o tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugar as células marcadas magneticamente a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 μL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para uso no sequenciamento subsequente do transcriptoma.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Separação de populações de linfócitos de PBMCs por coloração de anticorpos marcados fluorescentemente e FACS
<ol><li>Centrifugar as células não marcadas (passo 2.4.2) a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 μL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 2 μL de cada anticorpo marcado (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) aos 100 μL de suspensão celular (os volumes e as informações conjugadas de fluoróforo dos anticorpos são mostrados na Tabela 1), incubar no gelo por 30 minutos e proteger da luz.</li>
	<li>Lavar as células 2 x adicionando 1 mL de PBS e centrifugando a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 500 μL de PBS no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vórtice a suspensão celular suavemente antes de adquirir dados em um citômetro classificador de células de fluxo.</li>
</ol>4. Ajuste dos parâmetros da citometria de fluxo
<ol><li>Recolher 100 μL da suspensão celular (ver secção 1) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, conforme necessário, e configurar uma amostra de controlo negativo, uma amostra de coloração única de CD3, uma amostra de coloração única de CD4, uma amostra de coloração única de CD8, uma amostra de coloração única de CD19 e uma amostra de coloração de CD56/CD16.</li>
	<li>Adicionar 2 μL do anticorpo marcado fluorescentemente correspondente por 100 μL da suspensão celular e do vórtice. Incube no gelo por 30 minutos no escuro. Centrifugar durante 5 min a 300 × g e aspirar o sobrenadante. Ressuscite os pellets com 500 μL de PBS e vórtice.</li>
	<li>Comissione o fluxo de classificação e atrase as gotículas usando as esferas fluorescentes da seguinte forma:<ol><li>Abra o sistema de classificação de células, execute o programa de inicialização, instale o bocal de 85 μm e abra o fluxo de classificação. Defina a tensão de classificação para 4.500 V e a frequência para 47.</li>
		<li>Ajuste os parâmetros principalmente ajustando o ponto de interrupção da gota de fluxo principal e o atraso da gota de acordo com as instruções do fabricante12. Configure a primeira posição do ponto de interrupção do droplet (Drop1) para 275 e a Gap para 8 na janela Breakoff . Ative o modo de classificação automática Sweet Spot para permitir que a citometria determine automaticamente o valor da amplitude das gotículas para estabilizar o fluxo.</li>
		<li>Ajuste o atraso da gota para 30,31 na janela Side Stream carregando as esferas fluorescentes, garantindo que as contas atinjam uma deflexão de fluxo lateral de >99% no modo inicial ou de ajuste fino.</li>
	</ol></li>
	<li>Consulte a estratégia de gating mostrada na Figura 1 para executar o gating da seguinte maneira:<ol><li>Usando um gráfico de pontos de área de dispersão para frente (FSC-A)/área de dispersão lateral (SSC-A), desenhe a porta do polígono (P1) para identificar a população de linfócitos intacta .</li>
		<li>Usando um gráfico de pontos FSC-A/FSC-height (FSC-H), desenhe a porta do polígono (P2) para identificar as células simples e excluir os duplos (Figura 1A).</li>
		<li>Usando um gráfico de pontos CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, desenhe a porta retangular (P3) para selecionar células T CD3+ e células B CD19+ (Figura 1A,B). </li>
		<li>Usando um gráfico de pontos CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, desenhe uma porta retangular para selecionar células T CD4+ e células T CD8+ (células com alta fluorescência para esses marcadores, respectivamente).</li>
		<li>Usando um gráfico de pontos CD56/CD16 APC-A/SSC-A, desenhe uma porta retangular para selecionar células NK CD56+/CD16+ (Figura 1C).</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste os parâmetros instrumentais usando a amostra de controle negativo:<ol><li>Instale o tubo de controle negativo na porta de carregamento e clique em Carregar no Painel de Aquisição. Selecione as Configurações do citômetro no software.</li>
		<li>Na janela Inspetor, clique na guia Parâmetros e ajuste as tensões de FSC, SSC e diferentes corantes fluorescentes; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cianina 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cianina 5.5: 663.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustar a compensação usando as amostras de coloração única13.<ol><li>Carregue os tubos de coloração única na citometria sequencialmente e selecione Configurações do citômetro no software. Clique na guia Compensação para ajustar a compensação. NOTA: A referência de compensação da citometria de fluxo é mostrada na Tabela 2.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Classificação e coleta de dados de células via citometria de fluxo
<ol><li>Vórtice da suspensão celular (PBMCs separados de acordo com as seções 1–3) brevemente para ressuspender as células antes de carregar o tubo no citômetro. Mantenha os tubos restantes no gelo.</li>
	<li>Adicione 200 μL de FBS a quatro tubos de fluxo de coleta para evitar a aderência das células classificadas à parede do tubo e coloque-as na câmara de coleta do citômetro.</li>
	<li>Coletar células T CD3+CD4+, células T CD3+CD8+, células B CD3−CD19+ e células NK CD3− CD56+/CD16+ separadamente da amostra de um paciente com MI nos quatro tubos de fluxo (Figura 2A).</li>
	<li>Centrifugar as células separadas a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Adicione 200 μL de reagente de isolamento de RNA às células para sequenciamento do transcriptoma.</li>
	<li>Separe as subpopulações de células imunes das amostras de portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV de acordo com as etapas acima (Figura 2B, C).</li>
</ol>

<ol><li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60(2016).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li>
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<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+International%22%5BJournal%5D)">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li>
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<li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus%3A+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li>
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<li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+CD8%2B+T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110(2018).</li>
<li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations%3A+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753(2020).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este protocolo representa uma maneira eficiente de classificar as subpopulações de células imunes do sangue periférico. Neste estudo, amostras de sangue venoso de pacientes com MI, portadores de EBV saudáveis e crianças não infectadas por EBV foram selecionadas como objetivo da pesquisa. Este trabalho utilizando o sangue periférico de pacientes com MI concentra-se principalmente em analisar e determinar as proporções de diferentes subconjuntos celulares através da citometria de fluxo multicolorida. O sequenciamento do tr...

O vírus Epstein-Barr (EBV), um γ-herpesvírus também conhecido como vírus do herpes humano tipo 4, é onipresente na população humana e estabelece infecção latente ao longo da vida em mais de 90% da população adulta1. A maioria das infecções primárias por EBV ocorre durante a infância e adolescência, com uma fração de pacientes manifestando mononucleose infecciosa (IM)2, mostrando imunopatologia característica, incluindo uma resposta imune ativada com células T CD8+ no sangue e uma proliferação transitória de células B infectadas por EBV na orofaringe3. O curso da MI pode durar de 2 a 6 semanas e a maioria dos pacientes se recupera bem4. No entanto, alguns indivíduos desenvolvem sintomas persistentes ou recorrentes semelhantes aos MI com alta morbidade e mortalidade, que é classificada como infecção crônica ativa por EBV (CAEBV)5. Além disso, o EBV é um importante vírus oncogênico, que está intimamente relacionado a uma variedade de malignidades, incluindo malignidades epitelióides e linfoides, como carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (LH) e linfoma de células T/NK6. Embora o EBV tenha sido estudado por mais de 50 anos, sua patogênese e o mecanismo pelo qual induz a proliferação de linfócitos não foram totalmente elucidados.
Diversos estudos têm investigado as assinaturas moleculares para a imunopatologia da infecção por EBV por sequenciamento de transcriptoma. Zhong et al. analisaram o perfil do transcriptoma completo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de crianças chinesas com MI ou CAEBV para descobrir que a expansão das células T CD8 + foi predominantemente encontrada no grupo IM7, sugerindo que as células T CD8 + podem desempenhar um papel importante na MI. Da mesma forma, outro estudo encontrou menores proporções de células T e CD19+ citotóxicas específicas para EBV e maiores porcentagens de células T CD8+ em pacientes com MI causada por infecção primária por EBV do que em pacientes com IM causada tanto pela reativação do EBV quanto por outros agentes8. As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. Al Tabaa et al. encontraram que as células B eram policlonalmente ativadas e diferenciadas em plasmoblastos (CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmócitos (CD19+, CD27+ e CD20−, e CD138+) durante o IM9. Além disso, Zhong et al. descobriram que os marcadores de monócitos CD14 e CD64 foram regulados positivamente no CAEBV, sugerindo que os monócitos podem desempenhar um papel importante na resposta imune celular do CAEBV através da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose hiperativa7. Alka et al. caracterizaram o transcriptoma de células NK CD56 dim CD16+ classificadas por MACS de quatro pacientes de IM ou HL e descobriram que as células NK de IM e HL tinham imunidade inata e genes de sinalização de quimiocinas desregulados, o que poderia ser responsável pela hiporresponsividade das células NK10. Além disso, Greenough et al. analisaram a expressão gênica de células T CD8+ classificadas de 10 PBMCs de indivíduos com MI. Relataram que uma grande proporção de células T CD8+ na MI eram específicas do vírus, ativadas, dividindo-se e preparadas para exercer atividades efetoras11. Tanto as respostas específicas do EBV mediadas por células T quanto as respostas inespecíficas mediadas por células NK desempenham papéis essenciais durante a infecção primária por EBV. No entanto, esses estudos investigaram apenas os resultados do transcriptoma da mistura diversificada de células imunes ou apenas uma certa subpopulação de linfócitos, o que não é suficiente para a comparação abrangente das características moleculares e funções de diferentes subpopulações de células imunes em crianças com MI no mesmo estado de doença.
Este artigo descreve um método que combina contas imunomagnéticas e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de PBMCs (monócitos, células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas usando um separador magnético e FACS ou analisadas por citometria de fluxo. O RNA pode ser extraído das células purificadas para sequenciamento do transcriptoma. Este método permitirá a caracterização e expressão gênica de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão da imunopatologia da infecção por EBV.

<table><tbody><tr><td>APC anti-humano CD16</td><td>Biolegend</td><td>302012</td><td>Anticorpo fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>APC anti-humano CD56 (NCAM)</td><td>Biolegend</td><td>362504</td><td>Anticorpo fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anti-humano CD4</td><td>Biolegend</td><td>344616</td><td>Anticorpo fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>BIO RAD</td><td>TC20</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>BD FACSAria ativada por fluorescência&nbsp; fluxo&nbsp; célula&nbsp; citômetro-classificador (BD FACSAria II)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>644832</td><td>Cell sort</td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>microesferas</td></tr><tr><td>Lâminas de células</td><td>CTNG BIO RAD</td><td>1450016</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Falcon</td><td>35209715</td><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td></tr><tr><td>EDTA (&ge; 99%, BioPremium)</td><td>Beyotime</td><td>ST1303</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Tubos anticoagulantes de ácido tetra acético (EDTA) de etileno diamina</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>&nbsp; 367862&nbsp;</td><td>Tubos anticoagulantes EDTA</td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD19</td><td>Biolegend</td><td>302206</td><td>Anticorpo fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>Soro Fetal Bovino</td></tr><tr><td>&nbsp; Alta velocidade&nbsp; centrífuga</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; Centrifugação de células 3K15</td><td>para tubo de centrífuga de 15 mL</td></tr><tr><td>&nbsp; Alta velocidade&nbsp; centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Centrifugação celular para tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Meio de separação de linfócitos humanos</td><td>Dakewe</td><td>DKW-KLSH-0100</td><td>Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>LS&nbsp; Separação&nbsp; colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Separação&nbsp; colunas</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Separador de esferas magnéticas</td></tr><tr><td>PE anti-humano CD8</td><td>Biolegend</td><td>344706</td><td>Anticorpo fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 anti-humano CD3</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>Fluorescente anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>BI</td><td>02-024-1ACS</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>tubo de 5 mL para citômetro de fluxo FACS</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Ambion</td><td>15596024</td><td>Lyse células para extração de RNA</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de viabilidade celular de coloração azul de tripano</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td><td>Coloração azul de tripano</td></tr></tbody></table>

separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

A mononucleose infecciosa (MI) é uma síndrome aguda associada principalmente à infecção primária pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Os principais sintomas clínicos incluem febre irregular, linfadenopatia e linfócitos significativamente aumentados no sangue periférico. O mecanismo patogênico da MI ainda não está claro; não existe um método de tratamento eficaz para o efeito, estando disponíveis principalmente terapias sintomáticas. A principal questão na imunobiologia do EBV é por que apenas um pequeno subconjunto de indivíduos infectados apresenta sintomas clínicos graves e até desenvolve malignidades associadas ao EBV, enquanto a maioria dos indivíduos é assintomática por toda a vida com o vírus.
As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. As células natural killer (NK) são linfócitos inatos citotóxicos que são importantes para matar as células infectadas pelo EBV. A proporção de células T CD4+ diminui, enquanto a de células T CD8+ se expande dramaticamente durante a infecção aguda por EBV, e a persistência de células T CD8+ é importante para o controle vitalício da MI. Essas células imunes desempenham papéis importantes na MI, e suas funções precisam ser identificadas separadamente. Para este propósito, os monócitos são separados primeiro das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos IM usando microesferas CD14, uma coluna e um separador magnético.
Os PBMCs restantes são corados com peridinina-clorofila-proteína (PerCP)/Cianina 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/Cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e APC anti-CD16 para classificar células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK usando um citômetro de fluxo. Além disso, o sequenciamento do transcriptoma de cinco subpopulações foi realizado para explorar suas funções e mecanismos patogênicos na MI.

Referência da estratégia de confinamento A estratégia de gating utilizada para classificar as quatro subpopulações de linfócitos é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os linfócitos são selecionados (P1) em um gráfico de pontos mostrando a granulosidade (SSC-A) versus o tamanho (FSC-A). Em seguida, as células simples são selecionadas (P2) em um gráfico de pontos mostrando o tamanho (FSC-A) versus dispersão para frente (FSC-H), enquanto as células duplas são excluídas. As ...

Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Este método permitirá a caracterização de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão do mecanismo de infecção por EBV. Demonstrando o procedimento estará Linlin Zhang, um médico do nosso laboratório. Para começar, pegue os PBMCs isolados anteriormente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire-o a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 80 microlitros do tampão preparado. Em seguida, adicione 20 microlitros de microesferas CD 14 à suspensão celular, bem misturadas por pipetagem, e incube o tubo por 15 minutos no gelo. Em seguida, lave os PBMCs usando um mililitro de tampão e centrífuga a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente.Descarte todo o sobrenadante e ressuspenda as células com 500 microlitros do buffer. Para separação magnética, coloque uma coluna no separador de contas magnéticas e prepare a coluna lavando-a com três mililitros do buffer. Em seguida, adicione a suspensão da célula à coluna.Deixe-o passar e colete as células não rotuladas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com três mililitros do tampão e colete todo o efluente em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Agora, coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de buffer à coluna.Empurre o êmbolo firmemente para dentro da coluna para liberar as células marcadas magneticamente no tubo. Centrifugar as células marcadas magneticamente a 300 G durante cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante, ressuspeite as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para posterior sequenciamento do transcriptoma.Pellet as células coletadas não marcadas por centrifugação a 300 G por cinco minutos, e ressuspender as células em 100 microlitros de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione dois microlitros de cada anticorpo marcado à suspensão celular e incube no gelo por 30 minutos, protegido da luz. Em seguida, alíquota de 100 microlitros da suspensão de células PBMC em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para configurar uma amostra de controle negativo CD 3, CD 4, CD 8 e CD 19, amostras de coloração única e uma amostra de coloração CD 56 ou CD 16.Em seguida, adicione dois microlitros do anticorpo marcado fluorescentemente correspondente a cada tubo e incube no gelo por 30 minutos, protegido da luz. Após a incubação, lave todas as células com PBS, como demonstrado anteriormente, e ressuspeite em 500 microlitros de PBS. Abra o sistema de classificação de células e execute o programa power on.Em seguida, instale o bocal de 85 micrômetros e abra o fluxo de classificação. Defina a tensão de classificação para 4, 500 volts e a frequência para 47. Configure o intervalo como 8 na janela de interrupção e ative o modo de classificação automática de ponto ideal para determinar o valor da amplitude do gota automaticamente.Finalmente, ajuste o atraso da gota para 30,31 na janela de fluxo lateral. Usando um gráfico de pontos de dispersão para frente versus lateral, desenhe a porta do polígono P1 para identificar a população de linfócitos intacta. Em seguida, usando uma área de dispersão para frente versus gráfico de pontos de altura, desenhe a porta do polígono P2 para identificar as células individuais e exclua os dubletos.Em seguida, usando uma área FITC CD 19 versus CD 3 por gráfico de pontos de área CPCY 5.5, desenhe a porta retangular P3 para selecionar células T positivas para CD 3 e células B positivas para CD 19. Em seguida, usando um gráfico de pontos de área APCCY 7 do CD 4 versus área do CD 8 PE, desenhe uma porta retangular para selecionar as células T positivas do CD 4 e do CD 8. Finalmente, usando uma área de dispersão lateral versus gráfico de pontos de área APC CD 56 ou CD 16, desenhe uma porta retangular para selecionar células natural killer positivas para CD 56 ou CD 16.Para o tubo de controle negativo, clique em carregar no painel de aquisição e selecione as configurações do citômetro no software. Na janela do inspetor, clique na guia parâmetros e ajuste as tensões de dispersão para frente, dispersão lateral e corantes fluorescentes diferentes. Depois de carregar os tubos de coloração única no citômetro, clique em carregar no painel de aquisição e, em seguida, clique na guia de compensação para ajustar a compensação, conforme descrito no texto.Vórtice a suspensão celular suavemente, antes de carregar o tubo no citômetro. Adicione 200 microlitros de FBS a quatro tubos de fluxo de coleta e vortex os tubos. Coloque-os na câmara de coleta do citômetro.Colete os diferentes tipos de células separadamente nos quatro tubos de fluxo. Gire as células separadas a 300 G por cinco minutos e adicione 200 microlitros de reagente de isolamento de RNA à paleta celular para sequenciamento do transcriptoma. No presente estudo, subpopulações de células imunes de sangue periférico de diferentes amostras foram classificadas de forma eficiente, combinando as técnicas de esferas imunomagnéticas e triagem de células ativadas por fluorescência.É importante ressaltar que, neste protocolo, a etapa de classificação de células foi otimizada para melhorar a viabilidade celular. As células imunes classificadas mostraram uma proporção aumentada de células T positivas para CD 3, CD 8 em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com os portadores saudáveis do vírus Epstein-Barr e amostras não infectadas. Em contraste, proporções diminuídas de células T positivas para CD 3, CD 4 e células B positivas para CD 19 foram observadas em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV.Além disso, foram observadas proporções diminuídas de células natural killer positivas para CD 56 ou CD 16 em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com crianças não infectadas por EBV. Manter a viabilidade celular é vital para experimentos subsequentes. Manter as células no gelo ou na geladeira durante o processo de classificação é benéfico para a viabilidade celular.

separation-immune-cell-subpopulations-peripheral-blood-samples-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.

Isolamento de neutrófilos Protocolo

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de monócitos do sangue humano total por separação imunomagnética negativa. Os monócitos isolados podem ser usados para análises posteriores a jusante.

Isolamento de Monócitos de Sangue Total por Seleção Imunomagnética Negativa

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs, contendo monócitos e linfócitos de um revestimento leucocitário humano por centrifugação com gradiente de densidade. Os PBMCs isolados podem ser usados para análise posterior.

Isolamento de células mononucleares do sangue periférico de revestimentos de buffy humanos

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4+ e CD8+, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

Um ensaio de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de células imunes em células mononucleares do sangue periférico

Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

As amígdalas palatinas são uma rica fonte de linfócitos B e T. Aqui fornecemos um protocolo fácil, eficiente e rápido para isolar linfócitos B e T de amígdalas palatinas humanas. O método descrito foi adaptado especificamente para estudos da etiologia viral da inflamação das amígdalas conhecida como amigdalite.

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Apresentamos um protocolo simples para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico de sangue inteiro obtidos de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sézary, seguido pela seleção de células T CD4+, sua estimulação com phorbol12-myristate13-acetato e ionóforo A23187, e preparação de RNA para perfil transcriômico.

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Este protocolo detalha um método compatível com automação de alto rendimento para isolar células mononucleares do sangue periférico humano para biobancos e outros fins.

Isolando células mononucleares do sangue periférico humano de Buffy Coats por meio de separação de esferas imunomagnéticas de alto rendimento

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Aprenda a separar subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa usando imunomarcadores e FACS. Este método permite analisar respostas imunes específicas.

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

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