Name: Isolamento de neutrófilos Protocolo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos humanos do sangue total usando gradiente de densidade. Este protocolo padronizado permite estudar respostas inflamatórias e funções imunes com reprodutibilidade em laboratório.

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Financiamento do NIH R01 HL56621.

Isolamento de neutrófilos Protocolo <ol><li> Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente. </li><li> Coletar 5,0 ml de meios de isolamento de neutrófilos no tubo de centrifugação. Cuidadosamente camada de 5,0 ml de sangue sobre a mídia separação. Realizar esta etapa lenta e cuidadosamente, e com a ponta da pipeta perto da superfície da mídia para evitar a mistura do sangue e da mídia. </li><li> Centrifugar a 500 RCF por 35 min a 20-25 ° C. O sangue deve separar em 6 bandas distintas: plasma, monócitos, meios de isolamento, neutrófilos, media mais de isolamento, e os glóbulos vermelhos pellet (Figura 1). Se essas bandas não são claras, o processo de separação não foi limpa e terá de ser repetido. </li><li> Remova cuidadosamente os três camadas (plasma, monócitos e meios de isolamento), utilizando uma pipeta. Elimine essas camadas. </li><li> Pipeta com cuidado a camada de neutrófilos e de todos os meios de isolamento sob o neutrófilos. Coloque a solução em um tubo de ensaio limpo. </li><li> Diluir a solução de neutrófilos para 10 ml com HBSS sem + / ​​Mg 2 + Ca 2. Inverter o tubo várias vezes para suspender as células. </li><li> Centrifugar a solução de neutrófilos em 350 RCF por 10 minutos. A pelota vermelha deve estar presente no fundo do tubo, contendo neutrófilos e residual glóbulos vermelhos (hemácias). Remover o sobrenadante com uma pipeta com cuidado para que a pelota não é perturbado. </li><li> Para lisar as hemácias residual, adicionar 2 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos no tubo. Para ressuspender o sedimento, vortex do frasco com um ajuste de 3-4. Evitar o aumento da configuração vórtice acima de 4, já que isso pode causar o neutrófilos para ativar. Pode ser necessário vortex por alguns segundos, ou a &quot;pulso&quot; do vórtice para dissolver o sedimento. </li><li> Centrifugar o tubo a 250 rcf durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta. Repita o processo de lise, se necessário. </li><li> Adicionar 500 mL HBSS sem Ca 2 + / Mg 2 + para cada tubo. Mais uma vez, vórtice para ressuspender o sedimento em uma configuração de 3-4. Diluir para 10 ml com HBSS sem + / ​​Mg 2 + Ca 2. </li><li> Centrifugar os tubos a 250 rcf durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e descartar. </li><li> Ressuspender o sedimento em 250 mL HBSS / Solução HSA (2% HSA). Células podem então ser contados e ajustados a concentração desejada. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

A densidade método de separação de gradiente é usado para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. Este método é baseado no método de separação de leucócitos mononucleares por Boyum (1968) que foi modificado para a separação de neutrófilos por Ferrante e Thong (1980). Após a coleta de um doador, o sangue total pode ser anticoagulados com EDTA, citrato ou heparina. Uma vez que eles são de curta duração, os neutrófilos deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta...

<table><tbody><tr><td>Linfócito Poly(R)</td><td>Reagente</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM pode ser usado como uma alternativa</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Solução Salina Balanceada sem Cloreto de Cálcio</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina Sérica Humana</td><td>Reagente</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Lise de Células Vermelhas</td><td>Reagente</td><td>Grupo Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugar</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur e bulbo</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Reagente</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Reagente alternativo ao Linfócito-Poli (R)</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Outro</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, esterilizável por gama</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Solução Salina Balanceada com Cloreto de Cálcio</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de neutrófilos protocolo

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrófilos granulócitos polimorfonucleares (PMN) são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos e entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória. Devido ao seu papel fundamental na inflamação, as funções de neutrófilos, como locomoção, produção de citocinas, fagocitose e combate de células tumorais são amplamente estudados. Para caracterizar as funções específicas de neutrófilos, um método limpo, rápido e confiável de separá-los de outras células sanguíneas é desejável para os estudos in vitro, especialmente desde que os neutrófilos têm vida curta e deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. Aqui, nós demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando a mídia separação comercialmente disponível que é uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspenso em tampão de concentração desejada. Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos&gt; 95% com&gt; viabilidade de 95%.

Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.

Isolamento de neutrófilos Protocolo

Os granulócitos polimorfonucleares de neutrófilos (PMN) são os leucócitos mais abundantes em humanos e estão entre as primeiras células a chegar ao local da inflamação...

Protocolo de isolamento de neutrófilos. Este procedimento irá extrair células sanguíneas brancas de uma amostra de sangue total usando equipamentos como centrífuga e frascos. Vortex, seringa com agulha e filtro de seringa.Milli para marca MX gv 0,22 materiais micrométricos. A solução salina de Hank e a solução para separação de neutrófilos requerem dois tipos de soluções HBSS. HBSS com cloreto de cálcio será usada para preparar uma solução com albumina sérica humana.HBSS sem cloreto de cálcio será usado para suspender e lavar os neutrófilos. Tenha cuidado especial para usar a solução de HBSS apropriada neste procedimento. A albumina sérica humana ou HSA é uma proteína no plasma sanguíneo que mantém o pH e a pressão osmótica.Não utilize o tampão de lise de hemácias contendo amálgama de soro bovino. Este é fabricado pela Roche Diagnostics, meio de isolamento de neutrófilos NIM Cedar Line Labs, meio de separação Lymph light Poly, protegido da luz e mantido sob refrigeração para melhores resultados. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente no momento do uso.Retire os reagentes da geladeira uma hora antes do experimento. Prepare a solução H-B-S-S-H-S-A para separação de neu

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar a interação neutrófilo-biofilme. As bactérias patogênicas embutidas no biofilme e neutrófilos isolados foram marcadas usando marcadores fluorescentes, e a resposta imune pelos neutrófilos e a evasão da resposta imune pelas bactérias foram avaliadas usando um microscópio de fluorescência.

Um ensaio in vitro para estudar a interação entre neutrófilos e biofilme

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Os neutrófilos são o tipo mais abundante de glóbulos brancos. O isolamento de neutrófilos do sangue humano pelo método de separação por gradiente de densidade e a diferenciação de células promielocíticas humanas (HL60) ao longo da via granulocítica são descritos aqui; testar seu papel na sensibilidade das células do linfoma aos agentes antilinfoma.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Descrevemos aqui um método para a obtenção e a identificação de uma subpopulação recentemente caracterizada de fagócitos gigantes derivadas de neutrófilos. Estas células desenvolver em cultura a partir de neutrófilos sangue humano fresco, e são caracterizados por fagocitose, autofagia, tamanho extremamente grande, e tempo de vida prolongado. Este método é essencial para investigar ainda mais este subpopulação derivadas de neutrófilos original.

Desenvolvimento e Identificação de uma subpopulação Novel dos fagócitos Human Giant neutrófilos derivado In Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo detalha um método para o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro, casacos de buffy ou membranas de leucemia, alcançando bom rendimento, alta pureza e ativação celular mínima. Utilizamos purificação de gradiente, sedimentação de glóbulos vermelhos (RBC) e lise RBC para obter uma preparação de neutrófilo de alta qualidade/pureza.

Isolamento de neutrófilos humanos de whole blood e buffy coats

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Aqui, fornecemos uma abordagem confiável para isolar neutrófilos de baixa e normal densidade de sangue total usando isolamento magnético (seleção negativa) e meio de gradiente de densidade descontínuo. Ele garante o isolamento intocado de células de alta pureza (≥93%), facilitando a análise precisa a jusante das subpopulações de neutrófilos, cruciais para entender seus papéis na saúde e na doença.

O Isolamento e Caracterização de Neutrófilos de Baixa e Densidade Normal do Sangue Total

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Aprenda a isolar neutrófilos humanos do sangue total usando gradiente de densidade. Este protocolo padronizado permite estudar respostas inflamatórias e funções imunes com reprodutibilidade em laboratório.

Isolamento de neutrófilos Protocolo

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