Isolamento de neutrófilos Protocolo
July 23rd, 2008
Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.
Protocolo de isolamento de neutrófilos. Este procedimento extrairá glóbulos brancos de uma centrífuga e frascos de equipamento de amostra de sangue total. Filtro de agulha e seringa Vortex senhor.
Milli pour marca MX gv 0.22 Micrômetro materiais. A separação de neutrófilos de solução salina e salina requer dois tipos de soluções HBSS. HBSS com cloreto de cálcio será usado para fazer uma solução com albumina sérica humana.
HBSS sem cloreto de cálcio será usado para suspender e lavar os neutrófilos. Tome cuidado especial para usar a solução HBSS apropriada neste procedimento. A albumina sérica humana ou HSA é uma proteína no plasma sanguíneo que mantém o pH e a pressão SMO.
Não use tampão de lise de glóbulos vermelhos de amalgamato de soro bovino. Este é fabricado pela Roche Diagnostics, Mídia de isolamento de neutrófilos NIM Cedar Line Labs Meio de separação de poli luz protegido da luz e mantido na geladeira para melhores resultados. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente no momento da utilização.
Remova os reagentes da geladeira uma hora antes do experimento. Prepare a solução H-B-S-S-H-S-A para separação de neutrófilos. Pipete HBSS com cloreto de cálcio para o frasco para injetáveis.
Puxe o HSA para a seringa. Evite prender bolhas de ar. Remova a agulha da seringa e substitua-a pelo filtro.
Injete HSA através do filtro no vórtice de frasco HBSS duas misturas quando tiver seus outros materiais prontos e em temperatura ambiente, adquira cerca de 15 mililitros de sangue total. Isso produzirá de 10 a 15 mililitros de 10 elevado ao oitavo neutrófilo. O doador não deve ter consumido álcool ou medicamentos de venda livre por 24 horas antes de doar a amostra de sangue.
Isso pode atrapalhar o processo de separação. O sangue total pode ser anticoagulado com citrato de EDTA ou heparina adicionando nove partes de sangue a uma parte K, três EDTA, citrato de sódio ou heparina seguindo as instruções do fabricante. As etapas a seguir serão descritas neste procedimento.
Separe e remova o plasma e os monócitos. Separe e adquira uma camada de neutrófilos lisando glóbulos vermelhos livres suspender neutrófilos primeira separação. Adquira neutrófilos na camada NIM.
Colete cinco mililitros de meios de isolamento no tubo da centrífuga. Colocar o meio de isolamento mais baixo no tubo permite que ele atue como um filtro, pois a centrífuga forçará o sangue para baixo através dele com cuidado. Coloque cinco mililitros de sangue sobre o NIM para uma separação limpa.
Tenha muito cuidado para evitar misturar as soluções. Execute esta etapa lenta e cuidadosamente e com a ponta da pipeta próxima à superfície do meio de resolução para evitar a mistura da centrífuga. A solução a 500 RCF durante 35 minutos.
De 20 a 25 graus Celsius, o sangue deve se separar em seis bandas distintas. As seis bandas são monócitos plasmáticos, meios de isolamento, neutrófilos, mais meios de isolamento e o grânulo vermelho na parte inferior. Se essas seis bandas não forem claras e distintas, o processo de separação não foi limpo e precisaria ser repetido.
As causas comuns de má separação incluem doador de mídia de isolamento antigo que consumiu álcool nas últimas 72 horas ou doador que consumiu outro medicamento, como Tylenol ou aspirina. Remova e descarte cuidadosamente os monócitos plasmáticos e os meios de isolamento. Coloque essas camadas em um tubo selável e descarte cuidadosamente a camada de neutrófilos e todos os meios de isolamento abaixo dos neutrófilos em uma lima de centrífuga limpa para recuperar o maior número possível de neutrófilos.
Geralmente, é mais fácil incluir alguns dos meios de isolamento da camada abaixo também. Não perturbe o palete na parte inferior. Segunda declaração, refinar a camada de neutrófilos.
Diluir a solução de neutrófilos a 10 mililitros com HBSS sem cálcio. Inverta o tubo algumas vezes para suspender a centrífuga das células. A solução de neutrófilos.
350 RCF por 10 minutos. A 20 a 25 graus Celsius, um grânulo vermelho deve estar presente no fundo do tubo contendo neutrófilos e glóbulos vermelhos residuais. Remova o supra natin com a pipeta.
Tenha cuidado. para perturbar o pellet na parte inferior. Lise dos glóbulos vermelhos.
Os glóbulos vermelhos da amostra devem agora ser destruídos por lise. Para analisar os glóbulos vermelhos residuais, adicione dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos ao tubo para resus. Suspenda o vórtice do pellet no frasco para injetáveis em uma configuração de três a quatro.
Evite aumentar a configuração do vórtice acima de quatro, pois isso pode fazer com que os neutrófilos sejam ativados. Pode ser necessário fazer vórtice por vários segundos ou pulsar o vórtice para dissolver o palato. Centrifugar a solução de lise a 250 RCF durante cinco minutos.
Use a opção de partida suave para minimizar os danos à amostra. Remova o supra natin com pipeta. Repita o processo de lisagem.
Se necessário, libere a suspensão de neutrófilos, adicione 500 microlitros de HBSS sem cálcio a cada tubo. Vortex o pellet em uma configuração de três a quatro, diluir para 10 mililitros com HPSS sem centrífuga de cálcio. Os neutrófilos a 250 RCF por cinco minutos aspiram o snat e descartam.
Suspenda novamente o pellet em 250 microlitros de HBSS com solução HSA, duas vezes 10 elevado a seis. Neutrófilos por mililitro são normalmente coletados.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando uma técnica padrão de separação por gradiente de densidade. Os neutrófilos desempenham um papel crucial na resposta imune inflamatória, e entender sua isolação é vital para pesquisas adicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Neurociência
Fundo
- Os neutrófilos estão entre os primeiros respondentes em respostas inflamatórias.
- Sua funções e mecanismos têm sido extensivamente estudados in vitro.
- Técnicas de isolamento são essenciais para estudar o comportamento e as funções dos neutrófilos.
- Métodos padronizados melhoram a reprodutibilidade na pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para isolar neutrófilos do sangue humano.
- Facilitar pesquisas adicionais sobre as funções dos neutrófilos na inflamação.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente adotado em laboratórios.
Métodos Usados
- Método de separação por gradiente de densidade.
- Uso de meios de separação comercialmente disponíveis.
- Equipamento inclui centrífuga e frascos.
- Preparação de soluções usando HBSS com cloreto de cálcio e albumina sérica humana.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de neutrófilos de amostras de sangue total.
- Demonstração da eficácia do método de separação.
- Fornecimento de um protocolo claro para pesquisadores.
- Aplicações potenciais no estudo do comportamento dos neutrófilos em várias condições.
Conclusões
- O método apresentado é eficaz para a isolação de neutrófilos.
- Este protocolo pode melhorar a pesquisa sobre respostas imunes.
- Estudos adicionais podem se basear nesta técnica de isolamento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
