Name: Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a usar micro-CT in vivo para monitorar a progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica em modelo murino. Este método não invasivo analisa a rede vascular hepática e parâmetros de patologia.

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A Figura 1 foi criada com BioRender.com. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (#3222 a A.C.). Anna Hadjihambi é financiada pelo Instituto Roger Williams de Hepatologia, Fundação para Pesquisa do Fígado.

Os autores não têm nada a revelar.

O método atualmente recomendado para o diagnóstico e estadiamento da DHGNA em humanos é a biópsia hepática, que abriga o risco de complexidades hemorrágicas, bem como imprecisões deamostragem40. Ao contrário, em modelos animais, esse diagnóstico é realizado por histologia post-mortem, embora protocolos para biópsia hepática de sobrevivência já estejam disponíveis e sejam recomendados quando o desenho do estudopermitir41. O uso da histologia post-mortem significa que um gran...

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma doença metabólica que afeta aproximadamente 25% da população e >80% das pessoas obesas mórbidas1. Estima-se que um terço desses indivíduos evolua para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), que se caracteriza por esteatose hepática, inflamação e fibrose2. A EHNA é um estágio da doença com risco significativamente maior para o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC)3,4. Por essa razão, a EHNA é atualmente a segunda causa mais comum de transplante hepático, e espera-se que em breve se torne o mais importante preditor de transplante hepático 5,6,7. Apesar de sua prevalência e gravidade, nenhuma terapia doença-específica está disponível para a DHGNA, e os tratamentos existentes visam apenas combater patologias associadas à doença, como resistência insulínica e hiperlipidemia 5,6.
Nos últimos anos, o papel fisiopatológico e as adaptações do endotélio e, em geral, da rede vascular de tecidos metabólicos, como o tecido adiposo e o fígado, vêm ganhando maior importância nas pesquisas, principalmente durante a obesidade e a desregulaçãometabólica7,8. O endotélio é uma monocamada celular que reveste internamente a rede vascular, atuando como barreira funcional e estrutural. Também contribui para vários processos fisiológicos e patológicos, como trombose, transporte de metabólitos, inflamação e angiogênese 9,10. No caso do fígado, a rede vascular caracteriza-se, entre outras características, pela presença de células altamente especializadas, definidas como células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs). Essas células não possuem membrana basal e possuem múltiplas fenestras, permitindo a transferência mais fácil de substratos entre o parênquima sanguíneo e hepático. Devido à sua localização anatômica e características distintas, os LSECs provavelmente têm um papel crucial nos processos fisiopatológicos do fígado, incluindo o desenvolvimento de inflamação e fibrose hepática durante a DHGNA/EHNA. De fato, as adaptações patológicas, moleculares e celulares que os LSECs sofrem no curso da DHGNA contribuem para a progressão da doença11. Especificamente, a angiogênese hepática dependente de LSEC que ocorre durante a DHGNA está significativamente associada ao desenvolvimento de inflamação e à progressão da doença para EHNA ou mesmo CHC12. Além disso, a DHGNA precoce relacionada à obesidade é caracterizada pelo desenvolvimento de resistência insulínica nos LSECs, que precede o desenvolvimento de inflamação hepática ou outros sinais avançados de DHGNA13.
Além disso, os LSECs emergiram recentemente como reguladores centrais do fluxo sanguíneo hepático e adaptações da rede vascular durante doenças hepáticas de diversas etiologias14,15. De fato, a doença hepática crônica é caracterizada por proeminente vasoconstrição intra-hepática e aumento da resistência ao fluxo sanguíneo, que contribuem para o desenvolvimento da hipertensão portal16. No caso da DHGNA, vários mecanismos relacionados à LSEC contribuem para esse fenômeno. Por exemplo, a resistência insulínica específica para LSC, como mencionado acima, está associada à redução da vasodilatação insulino-dependente da vasculatura hepática13. Além disso, com o curso da doença, a vasculatura hepática torna-se mais sensível aos vasoconstritores, contribuindo ainda mais para o comprometimento do fluxo sanguíneo hepático e levando ao surgimento de estresse de cisalhamento, que resultam em ruptura da microcirculação sinusoidal17. Esses fatos sugerem que a vasculatura é um alvo chave na doença hepática. No entanto, fatores limitantes que dificultam o diagnóstico e o monitoramento oportunos da DHGNA/EHNA, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias, são as inadequações na caracterização consistente do microambiente hepático e da estrutura (micro)vascular, bem como a pontuação do estágio da doença de forma espaço-temporal e não invasiva.
A microtomografia computadorizada (TC) é atualmente o método de imagem não invasivo padrão-ouro para retratar com precisão informações anatômicas dentro de um organismo vivo. A micro-TC e a RM representam dois métodos de imagem complementares que podem cobrir uma vasta gama de patologias e fornecer resolução e detalhes excepcionais nas estruturas e tecidos imageados. A micro-TC, em particular, é uma ferramenta muito rápida e precisa, sendo frequentemente utilizada para estudar patologias como doenças ósseas e alterações da superfície óssea associadas18, avaliar a progressão da fibrose pulmonar ao longo dotempo19, diagnosticar câncer de pulmão e seuestadiamento20, ou mesmo examinar patologiasdentárias21, sem qualquer preparo especial (ou destruição) das amostras que estão sendo analisadas.
A tecnologia de imagem da micro-TC baseia-se nas diferentes propriedades de atenuação de vários órgãos em termos de interação dos raios X com a matéria. Órgãos com altas diferenças de atenuação radiográfica são representados com alto contraste nas imagens de TC (ou seja, os pulmões parecem escuros e os ossos claros). Órgãos com propriedades atenuantes muito semelhantes (diferentes tecidos moles) são difíceis de distinguir nas imagens de TC22. Para resolver essa limitação, agentes de contraste especializados à base de iodo, ouro e bismuto têm sido extensivamente investigados para uso in vivo . Esses agentes alteram as propriedades atenuantes dos tecidos nos quais se acumulam, são eliminados lentamente da circulação e permitem a opacificação uniforme e estável de todo o sistema vascular ou tecidosescolhidos 23.
No diagnóstico humano, a TC e técnicas comparáveis, como a fração gorda de densidade de prótons derivada da RM, já são utilizadas para a determinação do conteúdo de gordura hepática24,25. No contexto da DHGNA, o alto contraste de partes moles é essencial para distinguir com precisão lesões patológicas ou pequenos vasos. Para isso, são utilizados agentes de contraste que proporcionam maior contraste nas características do tecido hepático. Tais ferramentas e materiais permitem o estudo de múltiplas características hepáticas e possíveis expressões patológicas, tais como a arquitetura e densidade da rede vascular, deposição/esteatose lipídica e captação tecidual funcional/transferência de lipídios (quilomícrons) no fígado. Além disso, o volume sanguíneo relativo hepático e o diâmetro da veia porta também podem ser avaliados. Em um tempo de exame muito curto, todos esses parâmetros fornecem informações diferentes e complementares sobre a avaliação e a progressão da DHGNA, que podem ser usadas para desenvolver um diagnóstico não invasivo e detalhado.
Neste artigo, apresentamos um protocolo passo a passo para o uso de novas técnicas de imagem por micro-TC in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA. Por meio desse protocolo, a análise longitudinal da esteatose hepática e da captação tecidual funcional, bem como a avaliação do volume sanguíneo relativo, diâmetro da veia porta e densidade da rede vascular, podem ser realizadas e aplicadas em modelos murinos de hepatopatia.

<table><tbody><tr><td>eXIA160</td><td>Binitio Biomedical, Inc.</td><td></td><td>https://www.binitio.com/?Page=Products</td></tr><tr><td>Dieta rica em gordura com 60% das quilocalorias provenientes de gordura</td><td>Research Diets, New Brunswick, NJ, EUA</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Xarope de milho rico em frutose&nbsp;</td><td>Melhores sabores, CA</td><td>hfcs-1gallon</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Oftálmica Lacrinorm&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta normal com 10% de quilocalorias de gordura&nbsp;</td><td>Research Diets, New Brunswick, NJ, EUA</td><td>D12450</td><td></td></tr><tr><td>Viscover ExiTron nano 12000&nbsp;</td><td>Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-095-698</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-CUBE&nbsp;</td><td>Molecubes, Bélgica</td><td></td><td>https://www.molecubes.com/systems/</td></tr></tbody></table>

novas técnicas de imagem por microtomografia computadorizada in vivo para avaliação da progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é um crescente problema de saúde global, e o impacto da DHGNA é agravado pela atual falta de tratamentos eficazes. Consideráveis fatores limitantes que dificultam o diagnóstico oportuno e preciso (incluindo a graduação) e o monitoramento da DHGNA, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias, são as atuais inadequações na caracterização da estrutura do microambiente hepático e na pontuação do estágio da doença de forma espaço-temporal e não invasiva. Usando um modelo de camundongo com DHGNA induzida por dieta, investigamos o uso de técnicas de imagem de microtomografia computadorizada (TC) in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA. Essa metodologia de imagem permite a análise longitudinal da esteatose hepática e da captação tecidual funcional, bem como a avaliação do volume sanguíneo relativo, do diâmetro da veia porta e da densidade da rede vascular. Compreender as adaptações da rede vascular hepática durante a progressão da DHGNA e correlacioná-la com outras formas de caracterizar a progressão da doença (esteatose, inflamação, fibrose) usando o método proposto pode abrir caminho para o estabelecimento de novas abordagens, mais eficientes e reprodutíveis para a pesquisa da DHGNA em camundongos. Espera-se também que este protocolo atualize o valor dos modelos animais pré-clínicos para investigar o desenvolvimento de novas terapias contra a progressão da doença.

Neste estudo representativo, a micro-TC sem contraste indicou maior percentual de gordura hepática em camundongos com DHGNA em relação aos controles (Tabela 2), confirmando a patologia. Usando o contraste ExiTron e a análise da arquitetura e densidade da rede vascular hepática descrita acima, a densidade de volume total da rede vascular hepática foi maior em camundongos com DHGNA em comparação com controles saudáveis (Figura 6, Tabela 2). Camundongos com DHG...

Usando um modelo de camundongo com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida por dieta, descrevemos o uso de novas técnicas de microtomografia computadorizada in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA.

Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective ...

Consideramos este protocolo significativo, pois demonstra um método não invasivo, simples e fácil de avaliar ao longo do tempo indicadores-chave para o diagnóstico da doença hepática. Esta metodologia de imagem permite a análise ao longo do tempo do estado hepático, avaliação do volume sanguíneo relativo, diâmetro da veia porta, intensidade da rede vascular, todos os parâmetros importantes da patologia hepática. Compreender as adaptações da rede vascular hepática durante a progressão da DHGNA e correlacioná-la com marcadores específicos como esteatose, inflamação e fibrose pode ajudar a estabelecer novos esquemas terapêuticos eficazes.Essa técnica auxilia na identificação desses marcadores e também atualiza o valor de camundongos em estudos pré-clínicos com foco no desenvolvimento de novas terapias contra a progressão da doença. Para começar, coloque o animal anestesiado no berço do tomógrafo. Aplique pomada oftálmica, prenda o cone do nariz e defina os parâmetros de varredura no tomógrafo.Prepare o cateter da veia caudal e coloque o mouse em uma cama para aquecer a cauda em água morna. Inserir o cateter na veia caudal e administrar o primeiro contraste através de uma injeção, realizada de forma lenta e manual com duração de um a três minutos. Em seguida, adquira varreduras de corpo inteiro e fígado em diferentes pontos de tempo.Seguir o mesmo procedimento para a administração do segundo meio de contraste, 10 dias após a leitura final com o primeiro meio de contraste. Depois de carregar o arquivo DICOM da varredura pré-contraste, ajuste o contraste para ver o fígado, o baço e o tecido adiposo branco claramente. Na ferramenta ROI 3D, selecione adicionar ROI para gerar várias ROIs para realizar a amostragem nas áreas onde o fígado, o baço e o tecido adiposo parecem claros, sem vasos sanguíneos e gordura aparentes.No modo de pintura, escolha Esfera. Marque a caixa somente 2D e selecione um diâmetro de oito pixels no menu suspenso para pintar o ROI sobre os dados. A partir do recurso de dilatação de erosão, escolha menos um erode.Realize a amostragem segmentando as ROIs 2D nas áreas de interesse usando a ferramenta Esfera no plano transversal. Vá para navegação e selecione mostrar tabela para exibir a tabela de quantificação que contém os valores de unidade de campo de cães calculados para cada ROI. Em seguida, conecte os valores a essa equação.Calcule a porcentagem de gordura no fígado. Carregue o arquivo DICOM de varredura eXIA e ajuste o contraste para ver o fígado, o baço e o ventrículo esquerdo claramente. Na ferramenta ROI 3D, selecione adicionar ROI para segmentar vários ROIS para o fígado.No modo de pintura, selecione Somente 2D e escolha Esfera adicionar um diâmetro de oito pixels para pintar o ROI sobre os dados. A partir do recurso de dilatação de erosão, escolha menos um erode. Especifique um nome e uma cor para cada ROI e selecione mostrar tabela para exibir a tabela de quantificação contendo os valores de UH calculados para cada ROI.Após repetir esses passos para obtenção do órgão PV t0, insira os valores na equação mostrada na tela para extrair a porcentagem de contraste correspondente à captação funcional do tecido de transferência lipídica. Carregue o arquivo DICOM de varredura ExiTron e ajuste o contraste para ver a rede vascular do fígado claramente. Selecione adicionar ROI para gerar um ROI 3D para o fígado.Defina o ROI do fígado marcando a área desejada. Em seguida, escolha o ROI em segundo plano no seletor de ROI. Clique no ícone Executar corte, para remover o fundo sem alterar o ROI do fígado.Ative o visualizador de projeção de intensidade máxima. Em seguida, sob algoritmos de segmentação indicados pelo ícone da varinha mágica, selecione o limiar conectado para resegmentar o ROI do fígado. Definir os limiares inserindo os valores mínimos e máximos e obter a rede vascular.Novamente, remova o tecido hepático de fundo para obter uma representação clara da rede vascular. Depois de carregar o arquivo DICOM de varredura ExiTron, ajuste o contraste para ver o fígado, o baço e o ventrículo esquerdo claramente. Selecione adicionar ROI e segmentar ROIs para o fígado e um grande vaso sanguíneo.Defina as camadas de segmentação para gerar ROIs 2D para cada tecido. Repita as etapas do arquivo DICOM pré-contraste para obter o brilho médio do fígado antes da injeção do meio de contraste. Para o diâmetro da veia porta, localize os planos transversais de três a quatro cortes acima da junção das veias mesentérica superior e esplênica e, em seguida, vá para navegação seguida de saneamento da distância, selecione linha para medir a distância exata entre dois pontos.Os valores médios de contraste são apresentados por esses dados agrupados. O ensaio de captação tecidual funcional indicou maior acúmulo e depuração mais lenta do contraste eXIA em camundongos com doença hepática gordurosa não alcoólica em comparação com controles saudáveis. Esses resultados representativos indicam as diferenças na porcentagem de gordura hepática, volume da rede vascular hepática, diâmetro da veia porta e volume sanguíneo relativo hepático entre camundongos com doença hepática gordurosa não alcoólica e controles saudáveis.A micro-TC sem contraste indicou maior percentual de gordura hepática em camundongos com doença hepática gordurosa não alcoólica em comparação aos controles. Da mesma forma, um maior volume da rede vascular hepática, volume sanguíneo relativo hepático e um maior diâmetro da veia porta foram encontrados em camundongos com doença hepática gordurosa não alcoólica em comparação com controles saudáveis. A coisa mais importante a lembrar ao tentar esta técnica é ser constantemente preciso na região anatômica selecionada.A escolha do ponto anatômico errado pode levar a resultados não precisos. Seguindo essa metodologia e protocolo, uma avaliação precisa do estadiamento da doença hepática pode ser realizada. Assim, pode atuar como uma plataforma específica para avaliar a eficácia de novos medicamentos.Essa técnica abre caminho para maneiras novas, mais fáceis e mais precisas de avaliar patologias hepáticas e iniciar ensaios relevantes de desenvolvimento de medicamentos.

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Biology

Biologia

Este método descreve o uso da Microtomografia Computadorizada Quântica (MicroCT) para avaliar a morfologia, função, perfusão, metabolismo e viabilidade cardíaca com contraste iodado em camundongos com isquemia miocárdica induzida experimentalmente. A técnica pode ser aplicada para imagens longitudinais in vivo não destrutivas de alto rendimento de vários modelos animais de doenças cardíacas humanas.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

A montagem e o uso de um microendoscópio multimodal são descritos, que podem co-registrar dados de imagem de tecido superficial com parâmetros fisiológicos do tecido, incluindo concentração de hemoglobina, concentração de melanina e saturação de oxigênio. Essa técnica pode ser útil para avaliar a estrutura e a perfusão do tecido e pode ser otimizada para as necessidades individuais do investigador.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Aqui, são descritos métodos otimizados para gerar modelos in vivo e in vitro de esteatose hepática e analisar os fenótipos esteatóticos e parâmetros fisiológicos relacionados.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Descrevemos um não-invasivo multimodal de imagem abordagem baseada na Micro-CT e fluorescência molecular tomografia computadorizada para avaliação longitudinal do rato modelo fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal duplo da bleomicina.

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Este protocolo descreve o uso de uma técnica de ultrassom aprimorada para observar e quantificar invasivamente as alterações nos tecidos hepáticos em modelos de roedores de doença hepática gordurosa não alcoólica.

Aplicação de Ultrassom e Elastografia de Ondas de Cisalhamento em um modelo de rato de NAFLD/NASH

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

O presente estudo descreve metodologias baseadas na decelularização para visualizar e quantificar a deposição de tecido adiposo intramuscular (IMAT) através do volume muscular intacto, bem como quantificar métricas de adipócitos individuais que compõem o IMAT.

Quantificação da Infiltração Gordurosa do Músculo Esquelético Baseada na Decelularização

Neste protocolo, discutimos a implementação de um modelo de transplante ortotópico de fígado (THO) bem-sucedido em camundongos. Além disso, são discutidos também os adjuvantes para analisar melhor a patência do aloenxerto após o sucesso do TOL em camundongos, especificamente utilizando exames de microtomografia computadorizada (microTC).

Transplante Ortotópico de Fígado em Camundongos Utilizando Angiotomografia Microcomputadorizada

Este estudo introduz um método único de quantificação 3D para a distribuição da fração de gordura hepática (LFF) usando a Ressonância Magnética de Dixon (Dixon MRI). Os mapas de LFF, derivados de imagens em fase e em fase hídrica, são integrados com contornos hepáticos 3D para diferenciar os padrões de LFF entre fígados normais e esteatóticos, permitindo uma avaliação precisa do conteúdo de gordura hepática.

Uma Técnica de Quantificação 3D para Análise da Distribuição da Fração de Gordura no Fígado Usando a Ressonância Magnética de Dixon

Esse protocolo introduz uma Ferramenta de Imagem Hepática Reutilizável (RHIT) de ponta para microscopia intravital (IVM) de camundongos vivos, que aprimora a estabilidade dos tecidos para experimentos rápidos e agudos. O design impresso em 3D do RHIT oferece produção, escalabilidade e versatilidade com custo-benefício, permitindo observação prolongada dos processos metabólicos em camundongos de vários tamanhos.

Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática: Uma Ferramenta Reutilizável Impressa em 3D para Microscopia Intravital Hepática

Aprenda a usar micro-CT in vivo para monitorar a progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica em modelo murino. Este método não invasivo analisa a rede vascular hepática e parâmetros de patologia.

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