Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais
June 30th, 2023
Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para a propagação, diferenciação e coloração de células SH-SY5Y cultivadas e neurônios primários do hipocampo de ratos para visualização e análise da ultraestrutura mitocondrial usando microscopia de depleção de emissão estimulada (STED).
Nosso programa de pesquisa se concentra em aspectos estruturais e funcionais das mitocôndrias, particularmente no que se refere à disfunção relacionada ao envelhecimento. Para isso, utilizamos uma ampla gama de técnicas biofísicas, bioquímicas e estruturais para explorar os mecanismos básicos do envelhecimento mitocondrial e desenvolver intervenções terapêuticas para preservar e restaurar a saúde mitocondrial. A função e a estrutura mitocondrial estão inextricavelmente relacionadas.
As técnicas padrão de microscopia de luz são adequadas para medir características mitocondriais em larga escala, como morfologia básica e estruturas de rede. A análise da ultraestrutura mitocondrial ou de características que exigem maior resolução do que a proporcionada pela microscopia óptica tradicional é tipicamente feita usando microscopia eletrônica ou tomografia em amostras fixas. A microscopia de superresolução é uma técnica de imagem baseada em fluorescência que mede características além do limite de difração.
Para mitocôndrias, isso inclui medidas de distribuição de proteínas em escala nano e arquitetura de cristas. O protocolo de imagem estável descrito aqui permite que os pesquisadores meçam a estrutura detalhada da membrana interna em células vivas. A imagem de células vivas permite observar e analisar quantitativamente características complexas de cristas em condições fisiologicamente relevantes sem a necessidade de fixação da amostra.
Isso dará aos pesquisadores novos insights sobre as mudanças dinâmicas que ocorrem em características ultra-estruturais e suas respostas temporais a estressores e compostos farmacológicos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para a propagação, diferenciação e coloração de células SH-SY5Y e neurônios hipocampais primários de rato. O objetivo é visualizar e analisar a ultraestrutura mitocondrial usando microscopia de depleção por emissão estimulada (STED), fornecendo insights sobre a dinâmica estrutural das mitocôndrias em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa Mitocondrial
Fundo
- A estrutura e função das mitocôndrias são cruciais para a saúde celular.
- A microscopia tradicional é limitada em resolução para análise ultraestrutural.
- A microscopia de super resolução permite uma imagem mais detalhada das características mitocondriais.
- Entender as mudanças mitocondriais pode fornecer insights sobre o envelhecimento e a disfunção.
Propósito do Estudo
- Estabelecer um método confiável para estudar a ultraestrutura mitocondrial em células vivas.
- Permitir que pesquisadores analisem mudanças dinâmicas na morfologia mitocondrial.
- Fornecer uma base para investigar as respostas mitocondriais a vários tratamentos.
Métodos Utilizados
- Cultivo celular e diferenciação de células de neuroblastoma SH-SY5Y.
- Preparação de neurônios hipocampais primários de rato.
- Utilização de microscopia STED para imagem de alta resolução.
- Passos-chave incluem descongelamento celular, revestimento de lâminas de cobertura e coloração com PKMO.
- Aquisição e análise de imagem através de software e plugins específicos.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de estruturas mitocondriais em resolução nanométrica.
- Insights sobre a arquitetura das cristas e distribuição de proteínas dentro das mitocôndrias.
- Análise quantitativa das mudanças nas características mitocondriais sob condições fisiológicas.
- Descobertas potencialmente significativas sobre a resposta das mitocôndrias a compostos farmacológicos.
Conclusões
- O estudo demonstra uma técnica valiosa para investigar a dinâmica mitocondrial em células vivas.
- Contribui para a compreensão do papel das mitocôndrias no envelhecimento e saúde celular.
- Implicações para intervenções terapêuticas visando restaurar a função mitocondrial.
