Um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos

Estamos interessados em decodificar o genoma não codificante para entender como os genes são regulados, para serem expressos na hora certa e no lugar certo. Desenvolvemos protocolos fáceis de usar usando ferramentas genômicas baseadas na web para tornar a descoberta aprimorada acessível a todos os biólogos. Ampla disponibilidade de dados multimodais que podem ajudar a restringir a localização dos intensificadores e o fácil acesso a esses dados por meio de interfaces da Web de código aberto.

Isso permite a identificação abrangente do intensificador sem exigir experiência em programação dos pesquisadores. Este protocolo fornece uma base para qualquer pessoa sem experiência em biologia de intensificadores começar a navegar em conjuntos de dados disponíveis publicamente para recuperar intensificadores para os genes de interesse. Usamos o TBX5, um jogador bem conhecido na biologia do coração, como um estudo de caso.

Nosso fluxo de trabalho identificou 21 potenciadores, que podem lançar luz sobre os mecanismos de desenvolvimento do coração e doenças cardíacas congênitas. Expandiremos nosso protocolo com novas fontes de dados, incluindo genômica espacial, enquanto desenvolvemos ferramentas adicionais fáceis de usar para biólogos. Para começar, abra o Ensembl Genome Browser.

Selecione a montagem do genoma que corresponde à espécie e à versão de interesse. Digite o gene de interesse no campo de pesquisa e clique em Ir.Nos resultados, clique no ID do gene Ensembl apropriado.Em seguida, role até a seção Resumo" e clique no link Região em detalhes" para visualizar a região circundante do gene de interesse. Agora, procure os dois genes que flanqueiam o gene de interesse usando a trilha Gene Legend.

Esses genes aparecem como elementos visuais que representam as anotações mescladas de Ensembl e Havana dentro das anotações básicas de genes da trilha GENCODE. Determine a direcionalidade do gene de interesse observando os sinais maior ou menor que ao lado dos nomes dos genes. Clique e arraste o cursor pela região intergênica entre esses genes e, em seguida, clique em Ir para a região" na caixa pop-up para visualizar a região selecionada.

Personalize a exibição clicando em Adicionar"ou Remover faixas"na parte superior do visualizador de faixas. Use os controles de zoom e navegação para ajustar a visualização e melhorar a visualização da região. Na região em detalhes"visualizador de guias, clique em Configurar esta página"na barra lateral.

Na barra lateral Configurar imagem da região, em Regulamento, selecione Atividade por célula ou tecido. Use a barra de pesquisa de células ou tecidos para encontrar e selecionar os tecidos desejados ou use o índice alfabético abaixo da barra. Clique na guia Experimentos "adjacente à opção Célula ou Tecido".

Escolha H3K4me1 e H3K27ac como um marcador para intensificadores e H3K4me3 como um marcador para promotores e clique em Configurar exibição de faixa. Em seguida, selecione Exibir trilhas para visualizar as regiões marcadas por H3K4me1 dentro da região de detecção do intensificador e as regiões marcadas por H3K4me3 a montante do gene de interesse. Clique nos elementos visuais ou de caixa coloridos na trilha H3K4me1 para recuperar as coordenadas genômicas das regiões marcadas na região de detecção definida.

Isso abre o pop-up Hists e Pols, que exibe a localização genômica do elemento em pares de bases. Como alternativa, defina manualmente as regiões de interesse para cada recurso genômico clicando e arrastando na trilha para incluir os picos do gráfico nas trilhas H3K4me1 ou H3K27ac. Em seguida, copie as coordenadas de localização genômica em um arquivo de texto e salve o arquivo no formato BED.

Acesse o Portal de Dados 4DN. Na página inicial, certifique-se de que Conjuntos de experimentos "está selecionado como o eixo Y da barra empilhada principal, Tipo de experimento" está selecionado como o eixo X e o gráfico é agrupado por organismo. Localize a barra In Situ Hi-C ao longo do eixo X e clique na parte que representa os conjuntos de experimentos humanos.

No pop-up, clique no botão Procurar"e selecione mioblastos do músculo cardíaco"e nosso gene de interesse, TBX5, associado à organogênese cardíaca. Clique no link na coluna "Título" da amostra biológica relevante correspondente ao tecido de interesse. Em seguida, na guia Arquivos processados, clique em Explorar dados"para examinar o conjunto de dados Hi-C com mais detalhes.

Insira as coordenadas do promotor identificado no tecido de interesse e clique com o botão direito do mouse no mapa de calor para marcar a região horizontalmente. Essas linhas permitem que a região promotora seja rastreada visualmente em todo o mapa de calor. Se necessário, ajuste a exibição arrastando-a verticalmente até que os limites superior e inferior nas coordenadas Y da barra de pesquisa se alinhem com os limites da região de interesse.

Para remover quaisquer linhas indesejadas, clique com o botão direito do mouse na linha e selecione Horizontal "ou Regra Vertical e clique em Fechar Série. Insira as coordenadas de todos os intensificadores de controle validados experimentalmente para calcular o limite de interação com base em seus valores mínimos de interação. Exiba os três intensificadores de controle da literatura ao lado da região promotora do Ensembl usando a visualização pré-preparada.

Em seguida, defina o limite do intensificador do promotor usando esses intensificadores de controle selecionando a pontuação de interação diferente de zero mais baixa, conforme indicado pela chave de cor no lado direito da matriz do mapa de calor. Insira as coordenadas genômicas de todas as regiões intensificadoras associadas a H3K4me1 e marque verticalmente no mapa de calor Hi-C. Filtre as regiões de interação fraca comparando as pontuações de interação das regiões marcadas com H3K4me3 com o limite de interação.

Selecione as coordenadas genômicas que mostram as frequências de interação acima desse limite, que aparecem como sinais mais concentrados ou mais escuros no mapa de calor, e salve-as no formato BED. Três dos quatro intensificadores cardíacos identificados no VISTA Cardiac Enhancer Browser, HS2329, mm1282 e mm370, se sobrepuseram às regiões previstas pelo protocolo de detecção de intensificador baseado na web. O Enhancer Two se sobrepôs a uma região prevista pelo protocolo de detecção do enhancer e a um enhancer validado experimentalmente.

O Enhancer 16 mostrou sobreposição com as regiões do potenciador previstas e com dados experimentais anteriores. O Enhancer Nine não se sobrepôs a nenhum intensificador previsto do pipeline, mas mostrou enriquecimento parcial do sinal H3K4me1.