Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

O objetivo geral deste vídeo é fornecer um conjunto integrado de métodos para identificar e validar experimentalmente os elementos reguladores geneômicos, os chamados intensificadores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na transcrição e regulação de eventos biológicos, incluindo seleção e uso de intensificadores, usando diferenciação celular ou em resposta a estímulos externos. A principal vantagem do fluxo de trabalho apresentado é que um protocolo pode ser facilmente adaptado e usado em qualquer sistema de modelo celular.

Vou demonstrar as etapas do procedimento. Para começar, escolha um aprimorador candidato com base na análise de seqüência de chips pré-existente. Use um navegador de genoma para visualizar os resultados do experimento de seqüência de chip desejado e identificar locais de ligação nas proximidades do gene de interesse.

Escolha Definir uma região de interesse para obter uma sequência de 200 a 400 pares de bases da região genômica selecionada e use as sequências para o design de primer subsequente. Com técnicas padrão de biologia molecular, amplifique e clone a região genômica selecionada em uma construção de plasmídeo repórter. Para testar a atividade intensificadora, transfecte as construções repórter em células-tronco embrionárias em massa, adicionando primeiro 200 microlitros de solução de gelatina a 0,1% por poço a placas de 48 poços.

Incube as placas por 30 minutos antes do revestimento. No dia anterior à transfecção, alimentador-de-placa-embrionário livre, ou células ES, em 250 micro litros de meio ES a uma densidade de três vezes 10 elevado a quarto células por poço. No dia da transfecção, prepare as misturas de plasmídeo, fazendo o suficiente para oito poços de cada mistura.

Adicione meio de soro reduzido de qualidade de transfecção a cada mistura de plasmídeo para aumentar o volume para 106 microlitros. Em seguida, adicione 4,5 micro litros de reagente de transfecção de qualidade ES e misture cuidadosamente pipetando 15 vezes para cima e para baixo. Incube a mistura de transfecção por 15 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, adicione 13 micro litros por poço da mistura de transfecção às células e misture bem por pipetagem. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora durante a noite antes do tratamento com líquen. A eficiência da transfecção é uma etapa crítica.

Se outro tipo de célula for usado, esta etapa exigirá otimização. Use o tipo de célula mais relevante para testar a atividade do intensificador para minimizar os efeitos dependentes do contexto. No dia seguinte, remova cuidadosamente o meio por aspiração e adicione 250 microlitros de meio fresco por poço contendo um micromolar todo ácido trans-retinóico, ou DMSO como veículo.

Incube as células por 24-48 horas. Depois de preparar o tampão de lise de acordo com o protocolo de texto, aspire cuidadosamente o meio das células. Use 1X PBS para aumentar as células uma vez e, em seguida, adicione 200 micro litros de tampão de lise 1X por poço.

Agite as células em temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, para uma lise celular completa, congele os lisados celulares na placa a 80 graus Celsius. Depois de descongelar completamente os lisatos, use uma pipeta eletrônica multicanal para transferir 80 microlitros do lisado celular para uma placa transparente de 96 poços para a beta galactosidase e 40 microlitros do lisado para uma placa branca para medição de luciferase.

Para realizar a beta galactosidase, misture um mililitro do tampão substrato beta gal com quatro miligramas de OMPG. Em seguida, adicione 3,5 micro litros de beta mercaptoetanol à mistura e adicione imediatamente 100 micro litros do tampão aos 80 micro litros de lisado celular. Incube as reações a 37 graus Celsius até que a cor amarela fraca se desenvolva.

Leia a absorbância a 420 nanômetros em um leitor de placas e exporte os dados. Para realizar o ensaio de luciferase, depois de preparar o reagente de substrato de acordo com o protocolo de texto, aqueça o reagente de substrato de luciferase à temperatura ambiente antes de iniciar. Em seguida, pipete 100 microlitros em cada poço da placa branca contendo os 40 microlitros de lisado celular.

Use imediatamente uma máquina de contador luminescente para medir o sinal. Obtenha as atividades de pelo menos três transfecções e experimentos independentes. Realize cálculos para ambos os ensaios de acordo com o protocolo de texto.

Para projetar os primers para detecção de eRNA por RTCPR, selecione uma região genômica que esteja a pelo menos 1,5 a dois quilobases de distância de qualquer transcrição de gene anotada. Identifique a direção relativa do gene e determine a posição das transcrições de sentido e anti-sentido. Para projetar primers para a quantificação do RNA intensificador, escolha as regiões 200-1.000 pares de bases do centro do local de ligação do fator de transcrição.

Se o gene estiver localizado na fita negativa, copie 200-300 pares de bases da fita positiva e converta a sequência para obter a sequência do complemento reverso. Em seguida, use essa sequência para o design subsequente do primer. Defina a Faixa de tamanho do produto entre 80 e 150 pares de bases.

Para medir a transcrição do eRNA, após isolar o RNA total das células tratadas de acordo com o protocolo de texto, detecte o eRNA transcrito reverso por RTCPR usando um procedimento padrão. Meça um mRNA não dependente de tratamento para normalização. Como mostrado aqui, a análise de bioinformática dos dados de seqüência de chips RXR obtidos de células ES tratadas com ácido retinóico revelou o enriquecimento do meio sítio do receptor nuclear sob os locais ocupados por RXR.

Usando um algoritmo de bioinformática, os resultados da pesquisa de motivos para o meio local foram mapeados de volta para os dados de seqüência do chip RXR. Esta análise identificou picos de chip sobrepostos aos locais de ligação do receptor nuclear canônico. A visualização dos locais no IGV indicou enriquecimento dos fatores de transcrição próximos a Hoxa1.

Um alvo RAR RXR previamente caracterizado. Um intensificador punitivo para uma nova cadeia alvo de RA, PRMT8, também foi identificado. As regiões intensificadoras identificadas foram clonadas no vetor repórter de luciferase TK, e as células ES foram transfectadas com essas construções.

A atividade da luciferase foi medida na ausência e presença de AR. As construções contendo o elemento de resposta AR, ou RARE, mostraram aumento da intensidade do sinal da luciferase após o tratamento com AR, enquanto a construção sem o RARE não foi induzida. Para verificar se a expressão de eRNA de sentido e anti-sentido do intensificador de ligação Hoxa1 RAR RXR se correlaciona com a expressão de mRNA do gene, o nível de eRNA de Hoxa1 também foi medido. Os resultados confirmaram que a atividade intensificadora é induzida pelo tratamento de AR de curto prazo.

Uma vez dominada, essa carga de trabalho pode ser feita em poucos dias, realizando o experimento de armadilha de intensificador descrito e a quantificação do intensificador, pode-se fornecer fortes evidências funcionais para a atividade do intensificador. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar e caracterizar intensificadores punitivos. Uma vez que um intensificador é identificado e validado, outros métodos, como captura de confirmação cromossômica, ou CCC, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais importantes, como qual gene é regulado pelo intensificador validado?