Name: Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a identificar e validar elementos reguladores genômicos chamados enhancers usando análise de ChIP-seq e ensaios de luciferase em células-tronco embrionárias. Este protocolo adaptável auxilia pesquisadores em estudos de regulação gênica.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint e membros do laboratório Nagy pelas discussões e comentários sobre o manuscrito. L.N é apoiado por doações do Fundo Húngaro de Pesquisa Científica (OTKA K100196 e K111941) e cofinanciado pelo Fundo Social Europeu e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional e Programa Húngaro de Pesquisa do Cérebro - Grant No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Selecção Enhancer Com base na análise das microplacas-SEQ <ol><li> Baixe o arquivo fastq dados brutos RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) a partir http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ </li><li> Faça o download e extraia o arquivo de índice BWA necessário para o alinhamento (no nosso caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz NOTA: Visita à https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts para obter mais informações sobre as etapas de análise bioinformática e para baixar os scripts usados ​​abaixo. </li><li> Alinhar o arquivo de exemplo fastq ao genoma MM10 (use o script: perform_alignment.sh). Isto irá criar uma pasta com um arquivo .bam e estatísticas do alinhamento. Alinhadas RXR dados Chip-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) e o arquivo de índice correspondente (.bai) estão disponíveis aqui: http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ NOTA: BWA é um pacote de software que alinha relativamente sequências curtas (por exemplo, os resultados Chip-SEQ) para uma base de dados de sequência, tais como o genoma do rato de referência (por exemplo, MM10) 13. </li><li> Executar o script (callpeaks.sh) para o pico de chamadas e análise motivo de novo. Use o arquivo .bam como a entrada. O roteiro é baseado em Homer findPeaks 14. NOTA: Os arquivos de saída nos dar informações sobre o número total de picos, o enriquecimento dos motivos, a percentagem do fundo, e as sequências alvo com motivos, etc. (Figura 1). Normalmente vários motivos são listados em ordem de importância. </li><li> Remapear o # 1 motivo classificado (NR metade `AGGTCA`) (use o script: remap_motif.sh) NOTA: Como o resultado, o script gera um arquivo .bed que irá mostrar qual chip-picos estão cobrindo regiões genômicas que contêm o local de ligação canônica do factor de transcrição de interesse. </li><li> Faça o download e visualizar os resultados da lê RXR ChIP-seq alinhados (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (também baixar o .bai)) e as ocorrências AGGTCA motivo (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) por Integrative Genomics Viewer (IGV) 15 para identificar RAR putativo / sítios de ligação RXR (Figura 2 e Figura 3). NOTA: Integração de vários dados Chip-seq ajudará a mais prever com precisão boas potenciadores candidatos 16,17. Estudos recentes revelaram que potenciadores activas são tipicamente enriquecido para P300 e correlacionar com H3K4me1 e H3K27ac, e estão localizados em regiões de cromatina abertas, exibindo, assim, ADNase-I hipersensibilidade também é recomendado 18-21. </li><li> Use &quot;definir uma região de interesse&quot; em IGV 15 para obter 200-400 pb de sequência da região genómica seleccionado e utilizar estas sequências para modelos de iniciadores subsequentes. </li></ol> Ensaio 2. Reporter NOTA: O sistema luciferina / luciferase é utilizadacomo um ensaio de repórter muito sensível para a regulação da transcrição. Dependendo da enzima luciferase actividade potenciadora é produzido que irá catalisar a oxidação da luciferina para oxiluciferina, resultando em bioluminescense, que pode ser detectado. Como um primeiro passo, sequências potenciadoras putativos identificados devem ser subclonada num vector repórter (eg, luciferase TK-22, ou pGL3 NanoLuc). <ol><li> projeto Primer <ol><li> Primers projeto de PCR para amplificação de 200-400 bp das regiões potenciador putativos por Primer3 (disponível aqui: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 </li><li> Copie e cole a sequência genómica de IGV que inclui o sítio de ligação putativo em Primer3 (veja o passo 1.7). Definir intervalo de tamanho de produto para 250-300 pb em Primer3. </li><li> Validar os iniciadores de PCR usando o navegador UCSC Genome está em silico ferramenta de PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 NOTA: Este protocolo em uma etapa posterior usa HindIII e BamHI as enzimas de restrição para clonagem. Verificar se a sequência amplificada por PCR como previsto pela ferramenta de PCR UCSC in silico irá conter locais de restrição AAGCTT ou GGATCC (por exemplo, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> Obter os iniciadores necessários de um fornecedor comercial. </li></ol></li><li> PCR A amplificação de Enhancer Sequência de DNA genômico <ol><li> Purifica-se o ADN genómico a partir de células primárias do modelo (por exemplo, fibroblastos embrionários primários). Use kit comercial para isolamento gDNA e siga as instruções do fabricante. NOTA: alta qualidade de gDNA é essencial para a amplificação bem sucedida. clones BAC apropriados podem ser utilizados se a PCR não é fácil a partir de ADNg. </li><li> Preparar 50 uL da reacção de PCR contendo 100 ng de gDNA, 5 ul de tampão 10X, 3 uL MgSO4 (25 mM), dNTP 5 ul (2 mM de cada), 1,5 ul Fwd iniciador (10? M), 1,5 ul Rev iniciador (10? M) , polimerase de ADN de 1 ul <li> Definir o ciclo de PCR (2 minutos a 95 ° C, (20 s 95 ° C, 10 s 58-65 ° C, 18 seg 70 ° C) x25 repetição, 2 min 70 ° C, sempre 4 ° C). Ajuste a temperatura de recozimento com a consideração do primer de valores previstos Tm. </li><li> Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR comercial e seguir as instruções do fabricante. </li><li> Introduzir os locais de restrição para clonagem, repetindo o PCR com os iniciadores, como utilizado acima, mas a adição de saliências nas suas extremidades 5 &#39;(por exemplo, Enc: 5&#39;-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3&#39; (HindIII), Rev: 5&#39;-GGATCC TATA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 &#39;(BamHI)). </li><li> Executar 5 ul do produto de PCR em gel de agarose para verificar a existência de produtos de PCR não específicos. NOTA: Se forem detectados mais bandas, executar todo o produto de PCR e purificar a banda apropriada por um kit de extracção de gel comercial. </li></ol&gt; </li><li> Restrição NOTA: Para clonar inserção a montante do promotor TK 22, o produto de PCR purificado e o vector (por exemplo, TK-Luc) deve ser digerido com HindIII e BamHI. <ol><li> Prepara-se uma mistura reaccional de 50 ul contendo 1 ug de produto de PCR purificado, 1 ul HindIII (20 U / ul), 1 ul BamHI (20 U / ul) e 5 ul de tampão 10X. </li><li> Preparar um vector contendo 250 ul de mistura de reacção 5 ug (TK Luc, ou vector repórter alternativa), 5 ul de HindIII (20 U / ul), 5 ul BamHI (20 U / ul), 5 ul termossensível de fosfatase alcalina (1 U / ul) e 25 ul de tampão 10X. NOTA: AP tratamento do vector diminui grandemente a auto-ligação do vector de digeridos e, assim, o fundo. </li><li> Incubar as misturas de reacção durante 4 horas a 37 ° C, em seguida, purificar os produtos da PCR digerido e o vector com um kit de purificação de PCR comercial. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Configurar a reação de ligação em tubos de PCR incluindo 2 ul 10x T4 tampão DNA ligase, 10 ng TK-Luc vector, inserção 50 ng (produto de PCR digerido), 1 ul DNA ligase de T4 (400 U / L) e livre de nuclease de água até 20 ul. NOTA: Preparar um controlo negativo em que a reacção não contém inserção. </li><li> Misture suavemente a reação pipetando cima e para baixo, girar brevemente os tubos de PCR utilizando mini-centrífuga e, em seguida, incubar a RT durante 10 min. </li><li> Inactivar pelo calor a 65 ° C durante 10 min, em seguida, em gelo e relaxar utilizar 5 uL do produto de transformação em 50 ul de células competentes (por exemplo, DH5a). </li><li> Use procedimento de choque térmico padrão para transformar bactérias, pegar colônias e isolamento de DNA com um kit comercial. Validar todas as construções por sequenciação antes das próximas etapas. </li></ol></li><li> A transfecção de células ES <ol><li> Utilizar placas de 48 poços. Adicionar 200 ul de 0,1% de gelatina solutião / poço 30 min antes do plaqueamento de células. </li><li> Placa estaminais embrionárias (ES), as células de um dia antes da transfecção. Utilização de células ES livre de alimentação e da placa a uma densidade de 3 x 10 4 culas por po em 250 uL meios ES / poço. </li><li> Preparar as misturas de plasmídeos (cada mistura é calculado para 8 poços, 4 não tratado e 4 tratadas com ácido retinóico) Misturar 1:. 1250 ng TK-Luc vazio (controlo negativo), 950 ng β-Galactosidase codificar o vector de (βGal), mistura de dois : 1.250 ng TK-Luc Hoxa1 potenciador (controle positivo), 950 ng βGal, Mix 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 potenciador (região de interesse), 950 ng βGal. NOTA: células ES expressar os fatores de transcrição desejados (RAR / RXR). Deixar poços não transf ectadas para determinar os valores de base mais tarde durante a luciferase e a β-galactosidase medições. </li><li> Adicionar meio de soro reduzido de qualidade transfecção para cada plasmídeo misturar até 106 ul volume total (suficiente para 8 poços). </li><li> Adicionar 4,5 mL transfecção qualidade ESreagente ion em seguida, misture com cuidado pipetando 15 vezes para cima e para baixo. Incubar a mistura de transfecção durante 10 min à TA. </li><li> Adicionar 13 ul da mistura de transfecção às células por poço, homogeneiza-se por pipetagem. Colocar as células de volta na incubadora (37 ° C) O / N antes do tratamento ligando. </li><li> Remova a mídia cuidadosamente por aspiração a partir de células e adicionar 250 ul fresco media / poço contendo 0,01 - 1 PM all-trans ácido retinóico (RA) como a concentração final ou DMSO como veículo. Incubar as células a 24 - 48 h. NOTA: O ácido retinóico é sensível à luz. </li></ol></li><li> Preparação de Lisados ​​celulares <ol><li> Diluir 5x Tampão de Lise (1,25 ml de Tris 0,5 M pH = 7,8, 1 ml de 1 M de ditiotreitol (DTT) (em H 2 O), 10 ml de EDTA 0,1 M pH = 8,0, 50 ml de glicerol, 5 mL de Triton X-100, estéril água até 100 mL) até 1x usando água estéril, adicionar 20 ul de DTT 1 M / 10 ml e equilibrar à temperatura ambiente antes de utilização. Preparar 10 ml de uma placa de 48 poços no dia do ensaio. </li&gt; <li> Remova a mídia cuidadosamente por aspiração a partir de células. Lavar as células uma vez com PBS 1x. Adicionar 200 ul de 1x tampão de lise / poço directamente para as células. </li><li> Agitar durante 2 h à RT (a lise química). Congelar os lisados ​​celulares na placa à temperatura de -80 ° C (lise mecânica). Os lisados ​​podem ser armazenados a -80 ° C durante vários dias. </li><li> Descongelar os lisados. Após descongelação completa, transferir os lisados ​​de células para uma placa de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal electrónica. Transferir 80 uL de ligado de células a placas de 96 poços para ensaio claro β-galactosidase e 40 ul de lisado celular a uma placa de branco para a medição da luciferase. Evitar a formação de bolhas. </li></ol></li><li> β-galactosidase Ensaio NOTA: galactosidase Beta ou segundo repórteres alternativos devem ser utilizados como um controlo interno para a conta de variações experimentais não-específicas. <ol><li> Preparar tampão substrato β-galactosidase: 80,0 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g de KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, fazer até 1.000 ml com água estéril. Ajustar o pH para 7,4. Filtrar Esterilizar (0,2 micron) e armazenar a 4 ° C </li><li> Misture tampão de substrato de 1 ml β-galactosidase com 4 mg de ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactosidase). Adicionar 3,5 ul de 2-mercaptoetanol (βME) por 1 ml de tampão imediatamente antes da utilização. Adicionar 100 ul de tampão de substrato β-galactosidase de 80 ul lisado celular. </li><li> Incubam-se as reacções a 37 ° C até que uma cor amarelo pálido foi desenvolvido. Ler a absorvância a OD 420 nm num leitor de placas e exportação de dados. NOTA: O tempo varia dependendo da eficiência de transfecção, geralmente não mais do que 30 min. </li></ol></li><li> Ensaio de luciferase <ol><li> Prepare 50 ml de luciferina reagente substrato: 15,1 mg de sal D-luciferina, 82,7 mg de sal ATP, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, adicionar ao tubo de 50 ml de polipropileno,em seguida, adicionar 1,5 ml de tampão M HEPES 1, 48,5 ml ATP água livre, vortex, certifique-se todos os compostos dissolver completamente. Manter 5 - 10 mL de alíquotas a -80 ° C. </li><li> Quente 5 ml de reagente de substrato de luciferina para a TA antes de iniciar. Pipeta reagente de substrato de 100 ul a cada poço da placa de branco contendo 40 ul de lisado celular e medir o sinal imediatamente utilizando uma máquina contador luminescente. </li><li> Obter as actividades de pelo menos três experiências independentes em transfecções em triplicado. </li><li> Calcular primeiro a actividade de luciferase normalizada base e valores normalizados β-galactosidase para cada poço de base, subtraindo os valores médios obtidos para as células não transf ectadas de cada valor medido. Em seguida, calcular a proporção da actividade de luciferase / β-galactosidase. </li></ol></li></ol> 3. Caracterização de ARN Enhancer NOTA: Um indicador mais direta da atividade potenciador emergiu recente genoma-wide estudos que identificaram muitas RNAs não-codificantes curtas, que variam em tamanho de 50 a 2000 nt, que são transcritas a partir de intensif icadores, e são denominados RNAs estimuladoras (Ernas) 16,25,26 (Figura 4). indução Erna altamente correlacionada com a indução de genes codificadores de exões adjacentes. Assim, a actividade intensif icador dependente de sinal pode ser quantificado in vivo por meio da comparação da produção Erna entre várias condições por RT-qPCR. <ol><li> Diretrizes para Primer design para detecção Erna por RT-qPCR <ol><li> Selecione regiões genômicas para medições Erna que são pelo menos 1,5-2 kb longe dos locais de início da transcrição anotados. NOTA: É importante, elevados níveis de transcrição de ARNm através potenciadores intragênicos evitar a quantificação precisa de Erna na orientação com sentido, anti-sentido em Ernas intragênicos potenciadores são detectáveis ​​e são semelhantes em nível de Ernas em extragênicos potenciadores. </li><li> Como regra geral, use regiões 200 - 1.000 bp from o centro do factor de transcrição sítio de interesse para o desenho de primers em qualquer sentido ou cadeia anti-sentido (Figura 4 e Figura 6) de ligação. NOTA: Se GRO-SEQ, DNase-SEQ, H3K4me1, H3K4me3 ou dados H3K27ac ChIP-seq estão disponíveis a partir dos tipos de células desejadas e condições que podem ser utilizadas para a concepção de iniciadores mais preciso. Ernas são transcritos a partir de regiões potenciador putativos caracterizadas por altos níveis de H3K4me1 e me3. Expressão de Ernas correlaciona-se positivamente com o enriquecimento de activado marca potenciador histona H3K27ac. </li><li> Primers projeto PCR para medição de RT-qPCR de Ernas baseada em corante fluorescente por Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Gerar sequência anti-sense (complemento da cadeia sentido inverso) para desenho de primers como por: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Insira 200-300 bp de sentido ou anti-sentido sequência para o projeto primer. </li></ol></li><li> Medição de Erna Transcrição </strong&gt; <ol><li> Isolar o ARN total a partir de células tratadas com fenol acídico comercial reagente de extracção / à base de clorofórmio de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Use ADNasel para tratar ARN isolado antes de os usar na reacção de transcrição reversa. Inativar DNase de acordo com a recomendação do fabricante antes da transcrição reversa. </li><li> Medir a concentração de ARN após tratamento com DNase I e usar 1000 ng por reacção de RT. Use alta qualidade transcriptase reversa. NOTA: Como grande número de Ernas não pode ser poliadenilado, a transcrição inversa requer a utilização de iniciadores aleatórios. </li><li> Detectar a transcrição reversa Erna por RT-qPCR utilizando um processo padronizado. Medir um ARNm não dependente de tratamento para a normalização (por exemplo, 36B4, Ppia, GAPDH, ACTB). </li></ol></li></ol>

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<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nos últimos anos, os avanços na tecnologia de sequenciamento permitiram previsões em larga escala de intensificadores em muitos tipos de células e tecidos 7-9. O fluxo de trabalho descrito acima permite realizar a caracterização primária de intensificadores candidatos escolhidos com base em dados ChIP-seq. As etapas e notas detalhadas ajudarão qualquer pessoa a configurar uma validação de intensificador de rotina no laboratório.
A etapa mais crítica no ensaio repórter de luciferase ...

O desenvolvimento de um organismo multicelular requer a expressão regulada com precisão de milhares de genes nos tecidos em desenvolvimento. A regulação da expressão gênica é realizada em grande parte por intensificadores. Os intensificadores são elementos curtos de DNA não codificantes que podem ser ligados a fatores de transcrição (TFs) e agir à distância para ativar a transcrição de um gene alvo1. Os intensificadores são geralmente de ação cis e mais frequentemente encontrados logo a montante do local de início da transcrição (TSS), mas estudos recentes também descreveram exemplos em que os intensificadores foram encontrados muito mais a montante, no 3 'do gene ou mesmo dentro dos íntrons e éxons2. 
Existem centenas de milhares de potenciadores potenciais nos genomas dos vertebrados1. Métodos recentes baseados na imunoprecipitação da cromatina (ChIP) fornecem dados de alto rendimento de todo o genoma que podem ser usados para análise de intensificadores3-9. Embora os dados obtidos por experimentos ChIP-seq aumentem muito a probabilidade de identificar intensificadores específicos de células e tecidos, é importante ter em mente que os locais de ligação detectados não identificam necessariamente a ligação direta ao DNA e/ou intensificadores funcionais. Assim, uma análise funcional adicional de intensificadores recém-identificados é indispensável. Neste trabalho, apresentamos um processo básico de três etapas de identificação e validação de potenciadores ativos putativos. Isso inclui: 1) seleção de locais de ligação do fator de transcrição putativos por análise de bioinformática de dados ChIP-seq, 2) clonagem e validação dessas sequências regulatórias em construtos repórteres, e 3) medição de RNA intensificador (eRNA). 
A exposição de células-tronco embrionárias (ES) ao ácido retinóico (AR) é freqüentemente usada para promover a diferenciação neural das células pluripotentes 10. A AR exerce seus efeitos ligando-se aos receptores AR (RARα, β, γ) e aos receptores retinóide X (RXRα, β, γ). RARs e RXRs em uma forma de heterodímero se ligam a motivos de DNA chamados elementos de resposta RA, que normalmente são organizados como repetições diretas da sequência AGGTCA (chamada de meio sítio) e regulam a transcrição. Experimentos de tratamento com ligantes permitiram a identificação de vários genes regulados pelo ácido retinóico em células ES 11,12. No entanto, elementos potenciadores para muitos desses genes ainda não foram descritos. Para demonstrar como o fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para identificação e validação de potenciadores, mostramos passo a passo a seleção e caracterização de dois intensificadores dependentes de ácido retinóico em células-tronco embrionárias.

<table><tbody><tr><td>Polimerase Merck Millipore</td><td>71085-3 do</td> <td>ADN de KOD</td><td>para a amplificação do PCR do realçador do sangue & do gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Kit de lenços de papel</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>para isolamento de DNA genômico</td></tr><tr><td>QIAquick kit de purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>para purificação de produtos de PCR</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>para extração de gel se houver mais produto de PCR</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>enzima de restrição</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td></td></tr><tr><td>enzima de restrição FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>liberação de grupos 5 '- e 3'-fosfato do DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>para ligação</td></tr><tr><td>QIAprep Kit Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>para isolamento de plasmídeo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES mídia</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES mídia</td></tr><tr><td>MEM Aminoácido Não Essencial</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES mídia</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES mídia</td></tr><tr><td>Beta Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Reagente de transfecção</td> <td>Promega</td><td>E2311</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>para transfecção</td></tr><tr><td>Ácido retinóico totalmente trans</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ligante, para ativação de placa transparente de RAR/RXR</td></tr><tr><td>655101</td> de<td>96 poços</td><td>para</td> ensaio de <td>beta galactosidase</td></tr><tr><td>Placa branca de 96 poços</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>para ensaio de luciferase</td></tr><tr><td>D-luciferina, sal de potássio</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>para o sal</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td> do<td>ATP</td> do ensaio da <td>luciferase para o ensaio</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>para ensaio de luciferase</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>para ensaio de luciferase</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>para ensaio de beta-galactosidase</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>para ensaio de beta galactosidase</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>para ensaio de beta galactosidase</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>para ensaio de beta galactosidase</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-&beta;-D-galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>para ensaio de beta galactosidase</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>transcrição reversa de eRNA</td></tr><tr><td>Dnase livre de</td><td>Rnase Promega</td><td>M6101</td><td>Tratamento Dnase</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; Sistema de detecção de PCR em tempo real</td> Máquina de <td>qPCR</td><td>BioRad</td><td></td> Leitor</tr> de <tr><td>microplacas BioTek Synergy 4</td><td>Contador luminescente BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

previsão e validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias diferenciação celular

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

O desenvolvimento embrionário é um processo de múltiplos passos que envolve a activação e de repressão de muitos genes. elementos intensificadores no genoma são conhecidos por contribuir para o tecido e tipo celular específico regulação da expressão do gene durante a diferenciação celular. Assim, a sua identificação e posterior investigação é importante, a fim de compreender como o destino celular é determinada. A integração de dados de expressão de genes (por exemplo, microarray ou ARN-SEQ) e os resultados de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) -based estudos de todo o genoma (ChIP-SEQ) permite a identificação de grande escala dessas regiões reguladoras. No entanto, a validação funcional de potenciadores específicos do tipo de célula requer mais in vitro e em procedimentos experimentais in vivo. Aqui descrevemos como potenciadores activos podem ser identificados e validados experimentalmente. Este protocolo prevê um fluxo de trabalho passo-a-passo, que inclui: 1) identificação de regiões reguladoras por análise de dados do chip-seq, 2) clonagem e expervalidação imental de potencial regulador putativo das sequências genómicas identificados num ensaio de repórter, e 3) A determinação da actividade potenciadora in vivo através da medição do nível transcrito de ARN potenciador. O protocolo apresentado é detalhado o suficiente para ajudar alguém a criar esse fluxo de trabalho no laboratório. Importantemente, o protocolo pode ser facilmente adaptado e utilizado em qualquer sistema de modelo celular.

Foi utilizado um anticorpo RXR pan-específico, a fim de identificar quais genes regulados por RA genome-wide tem enriquecimento receptor em sua proximidade. Análise bioinformática de dados do chip-SEQ RXR obtidos a partir de células ES tratadas com ácido retinóico revelaram o enriquecimento da metade sítio do receptor nuclear (AGGTCA) sob a RXR ocupada locais (Figura 1). Utilizando um algoritmo de bioinformática que mapeada para trás o resultado da pesquisa para o motivo...

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

O objetivo geral deste vídeo é fornecer um conjunto integrado de métodos para identificar e validar experimentalmente elementos reguladores genômicos, chamados enhancers. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a transcrição e regulação de eventos biológicos, incluindo seleção e uso de enhancers, durante a diferenciação celular ou em resposta a estímulos externos. A principal vantagem do fluxo de trabalho apresentado é que o protocolo pode ser facilmente adaptado e utilizado em qualquer sistema de modelo celular.Eu demonstrarei as etapas do procedimento. Para começar, escolha um potencial enhancer com base em uma análise pré-existente de chip seq. Utilize um navegador genômico para visualizar os resultados do experimento de chip seq desejado e identifique os sítios de ligação na proximidade do gene de interesse.Escolha Definir uma Região de Interesse para obter uma sequência de 200 a 400 pares de bases da região genômica selecionada e utilize as sequências para o projeto subsequente de primers. Com técnicas padrão de biologia molecular, amplifique e clone a região genômica selecionada em um vetor plasmidial repórter. Para testar a atividade de enhancer, transfete

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Nós descrevemos um ensaio repórter de fluorescência para rapidamente identificar e caracterizar genes que regulam a manutenção do mouse células-tronco embrionárias e auto-renovação.

Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação

O vídeo demonstra o método para induzir a diferenciação de células-tronco em progenitores neurais usando ácido retinóico e o método de cultura de gota suspensa.

Diferenciando células do corpo embrióide em progenitores neurais usando ácido retinóico

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade do ácido retinóico em embriões de camundongos. Ao isolar as células dos embriões de camundongo, as células são co-cultivadas com células repórteres de ácido retinóico (RA). As células embrionárias produzem AR, que induz a expressão de beta-galactosidase nas células repórteres, indicando atividade de AR nas células embrionárias.

Empregando células repórter em uma co-cultura para estudar a produção de ácido retinóico por células embrionárias de camundongos

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

Não existem métodos para medir com precisão os níveis de ácido retinóico (AR) em pequenas quantidades de tecido. Este protocolo descreve a medição fácil e quantitativa dos níveis relativos de AR em embriões e neuroesferas E8.5 usando uma linha de células repórter de AR.

Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

O ensaio de contas encharcada envolve a entrega direcionada de reagente de teste em qualquer ponto de desenvolvimento para estudar a regulação da diferenciação celular e morfogênese. Um protocolo detalhado, aplicável a qualquer modelo animal experimental, para preparar três tipos diferentes de contas encharcadas e implantá-las no interdigit de um embrião de frango é apresentado.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

Aprenda a identificar e validar elementos reguladores genômicos chamados enhancers usando análise de ChIP-seq e ensaios de luciferase em células-tronco embrionárias. Este protocolo adaptável auxilia pesquisadores em estudos de regulação gênica.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular (Vídeo) | JoVE Journal

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

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