Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Este estudo tem como objetivo desenvolver tecidos cardíacos 3D biométricos usando andaimes elétricos fundidos e células cardíacas derivadas de iPSC humanas para melhorar a modelagem de doenças, testes de drogas e aplicações de medicina regenerativa. O relato induzido pelo homem em cardiomiócitos de células-tronco permanece imaturo, limitando sua funcionalidade. Além disso, é um desafio reproduzir a severa complexidade necessária para modelar o tecido cardíaco em 3D.

Este modelo imita melhor o miocárdio nativo, permitindo interações complexas de matriz extracelular 3D para modelagem de doenças, testes de drogas e aplicações específicas do paciente. Ele oferece uma alternativa mais relevante para culturas 2D e modelos animais. No futuro, nossa pesquisa se concentrará na investigação de modelos de cardiomicologia, aprimorando os protocolos de maturação de tecidos 3D e desenvolvendo construções maiores para terapias pré-clínicas de infarto do miocárdio em modelos animais de grande porte, como porcos.

Para começar, conecte a seringa a um tubo de suprimento de nitrogênio pressurizado e introduza-a dentro da câmara de aquecimento. Ligue o equipamento de escrita eletrogiratória e ajuste os reguladores de temperatura para 80 graus Celsius para a câmara e 65 graus Celsius para o bico. Após 30 minutos, mova a placa coletora até que a cabeça de impressão esteja posicionada em uma borda da placa ou em qualquer local desejado.

Ajuste a distância entre a câmara de aquecimento e a placa coletora manualmente para 10 milímetros no plano z. Feche a porta do equipamento, que conecta automaticamente a alimentação do campo elétrico. Defina a tensão para sete quilovolts em pressão de nitrogênio para dois bar para extrusão através da ponta de calibre 23.

Carregue o código G do projeto no software para imprimir andaimes com uma geometria de padrão quadrado. Ajuste a velocidade do coletor para 1080 milímetros por minuto. Em seguida, pressione o botão Cycle Start para iniciar a impressão.

Após a conclusão da impressão, remova cuidadosamente o andaime do coletor. Corte a malha impressa usando um punção de seis milímetros de diâmetro para obter os andaimes finais para a fabricação de tecidos. Trate os andaimes por cinco minutos com plasma de oxigênio.

Esterilize as malhas mergulhando-as em etanol a 70% por 30 minutos. Lave extensivamente com água destilada estéril por 30 minutos e deixe secar. Depois de desprender os cardiomiócitos iPSC humanos, ressuspender o pellet celular no meio de geração de tecido e contar as células usando a câmara de Neubauer.

Da mesma forma, após destacar os fibroblastos cardíacos iPSC humanos, ressuspenda o pellet celular no meio de geração de tecido e conte as células. Misture as células totais necessárias em um novo tubo e consulte o conteúdo como Cell Mix. E centrifugue a 300G por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, ressuspenda a mistura de células no volume necessário de meio de geração de tecido. Para gerar a mistura de hidrogel, adicione o volume necessário de fibrinogênio ao tubo em temperatura ambiente e misture cuidadosamente. Semeie a mistura de hidrogel em uma superfície de politetrafluoretileno para evitar a adesão da fibrina à placa.

Pipete metade do volume do tecido, deixando-o como uma gota. Coloque um andaime de policaprolactona, ou PCL, em cima de cada gota e adicione o volume restante ao andaime. Agora, adicione a quantidade necessária de trombina e misture rapidamente o hidrogel, evitando bolhas com cuidado.

Incube os tecidos a 37 graus Celsius por uma hora para completar a polimerização da fibrina. Pegue suavemente cada tecido pela borda usando uma pinça estéril e transfira-os para placas de 12 poços contendo meio de geração de tecido suplementado com aprotinina. Incubar os tecidos a 37 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, refresque o meio com dois mililitros de meio de manutenção tecidual, removendo os resíduos de KSR e Y-27. A semeadura de uma mistura de oito a dois de cardiomiócitos iPSC humanos e fibroblastos cardíacos iPSC humanos em hidrogéis de fibrina resulta em distribuição celular uniforme através dos poros do andaime dentro de uma hora após a polimerização. As imagens de imunofluorescência confocal mostraram uma distribuição celular mista das células através do tecido 3D interagindo com o andaime PCL com a maioria dos cardiomiócitos iPSC humanos corados para actinina sarcomérica intercalados com fibroblastos cardíacos iPSC humanos marcados com vimentina.

Os cardiomiócitos iPSC humanos exibem uma estrutura de sarcômero bem organizada pela proteína actinina sarcomérica regularmente espaçada. As células começaram a bater espontaneamente no segundo dia com uma frequência média de batimentos de 30 batimentos por minuto no sétimo dia, mostrando contração estabilizada em toda a malha. Um declínio gradual foi observado ao longo do tempo, atingindo 17 BPM no dia 14.

Apesar disso, a atividade metabólica permaneceu estável entre o sétimo e o 14º dia, confirmando a viabilidade celular sustentada. Finalmente, a análise do ponto de rastreamento dos tecidos de batimento mostrou uma velocidade de contração de 38 micrômetros por segundo e uma amplitude de contração de 29 micrômetros.