Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Estudamos neutrófilos de baixa densidade dentro de células mononucleares do sangue periférico para caracterizar suas funções e definir seu papel em diferentes doenças. Neutrófilos de baixa densidade são raros em sangue saudável, mas aumentam significativamente em doenças como lúpus eritematoso sistêmico e câncer. Para começar, adicione 10 unidades por mililitro de heparina como anticoagulante em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros.

Depois, adicione dois mililitros de 6% dextrano T500 em PBS. Obtenha 10 mililitros de sangue de um voluntário adulto saudável por meio de venpuntura. Em outro tubo novo de centrífuga de 15 mililitros, adicione cinco mililitros de meio gradiente de densidade.

Pipetee cuidadosamente o plasma sem tocar nos eritrócitos e sobreponha-o sobre o meio para formar duas fases separadas. Centrifuge o tubo a 516 g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Para isolar PBMCs, aspire e descarte o plasma acima da banda PBMC sem perturbar as células.

Colete a faixa da célula mononuclear entre o plasma e o meio, minimizando a coleta do meio. Adicione 20 mililitros de PBS ao tubo contendo PBMCs, depois centrifuge a 400 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e raspe o tubo para separar o pellet.

Adicione 10 mililitros de PBS frio para ressuspender as células. Para isolar neutrófilos, raspe o tubo para separar as células após pipetar o meio. Depois adicione 10 mililitros de PBS frio.

Agora transfira as células para um tubo cônico novo de 50 mililitros e centrífuga. Aspire o sobrenadante e raspe o tubo novamente. Agora pipete 10 mililitros de solução hipotônica fria no tubo e misture suavemente.

Misture suavemente por exatamente um minuto. Adicione rapidamente 10 mililitros de solução hipertônica fria para tornar a solução isotônica. Depois, conte os neutrófilos usando uma câmara de Neubauer e garanta que a pureza seja superior a 95%. Centrifuge a suspensão para obter um pellet celular.

Depois, resuspenda o pellet em PBS frio. Centrifuge as células mononucleares do sangue periférico a 400 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após remover o sobrenadante, ressuspenda as células em 120 microlitros de tampão de lavagem a frio.

Depois, pipeteio 35 microlitros de microesferas magnéticas CD66b para a suspensão celular. Incube a mistura no escuro a quatro graus Celsius por 30 minutos. Agora pipete um mililitro de tampão de lavagem fria no tubo.

Centrifuge o tubo a 400 g por três minutos. Raspe o tubo para separar a pastilha celular após remover o sobrenadante. E resuspendendo as células em um mililitro de buffer de lavagem.

Coloque uma coluna de separação magnética sobre um ímã. Adicione 0,5 mililitros de buffer de lavagem à coluna, permitindo que ela passe completamente. Transfira um mililitro das células ressuspensas para a coluna e deixe o tampão passar gota a gota.

Após a lavagem, transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga. Depois, pipeteie um mililitro de tampão de lavagem na coluna. Agora insira o êmbolo no topo da coluna.

Aplique pressão suavemente para eluir as células. Depois, remova o êmbolo e coloque a coluna em um novo tubo de microcentrífuga. Adicione mais um mililitro de buffer de lavagem à coluna.

Depois, insira novamente o êmbolo e aplique suavemente pressão para eluir as células restantes. Centrifuge ambos os tubos da microcentrífuga a 800 g por três minutos. Ressuspenda os pellets celulares de ambos os tubos em um mililitro de PBS frio.

Mantenha a suspensão da célula no gelo. Ressuspenda as células purificadas em um tampão de marcação feito de soro bovino fetal a 1% em PBS. Transfira 250 microlitros da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Adicione os anticorpos correspondentes contra as moléculas da membrana neutrófila ao tubo. Depois, incube as células por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Agora pipete um mililitro de PBS para o tubo.

Gire o tubo em uma microcentrífuga a 800 g por três minutos. Aspire o sobrenadante. Bata no tubo para quebrar o pellet.

E resuspenda as células em 0,5 mililitros de 1% de paraformaldeído. Depois, mantenha as células a quatro graus Celsius, protegidas da luz até a análise por citometria de fluxo. Analise as amostras usando citometria de fluxo, capturando 10.000 eventos por amostra.

Neutrófilos de baixa densidade em indivíduos saudáveis representaram aproximadamente 5% das células mononucleares do sangue periférico, enquanto o protocolo de isolamento magnético descrito apresentou neutrófilos de baixa densidade com cerca de 98% de recuperação. Neutrófilos expressam os marcadores de membrana CD10, CD11b, CD15, CD62L e CD66b. Neutrófilos de baixa densidade purificados magneticamente expressaram os mesmos marcadores de membrana que neutrófilos.

Neutrófilos purificados de baixa densidade apresentavam um núcleo multilobulado e eram semelhantes em tamanho aos neutrófilos. Tanto neutrófilos quanto neutrófilos de baixa densidade geraram espécies reativas de oxigênio em resposta à estimulação do PMA, com neutrófilos de baixa densidade produzindo níveis mais altos que neutrófilos. Neutrófilos de baixa densidade liberaram armadilhas extracelulares neutrófilas em resposta à estimulação da PMA, como evidenciado pela colocalização do DNA com elastase e citrulina.

Tanto neutrófilos purificados quanto neutrófilos de baixa densidade liberaram NETs com cinética e quantidades semelhantes após o tratamento com PMA. Nosso protocolo oferece uma forma rápida e reprodutível de obter neutrófilos de baixa densidade altamente puros e funcionais. Abordamos a falta de um protocolo padronizado e eficiente em termos de tempo para o isolamento de neutrófilos de baixa densidade do sangue humano.

Esse protocolo não exige treinamento especial para instrumentos complexos, além de ser mais econômico e rápido que o FACS.