Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade
11 de novembro de 2025
Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.
Estudamos neutrófilos de baixa densidade dentro de células mononucleares do sangue periférico para caracterizar suas funções e definir seu papel em diferentes doenças. Neutrófilos de baixa densidade são raros em sangue saudável, mas aumentam significativamente em doenças como lúpus eritematoso sistêmico e câncer. Para começar, adicione 10 unidades por mililitro de heparina como anticoagulante em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros.
Depois, adicione dois mililitros de 6% dextrano T500 em PBS. Obtenha 10 mililitros de sangue de um voluntário adulto saudável por meio de venpuntura. Em outro tubo novo de centrífuga de 15 mililitros, adicione cinco mililitros de meio gradiente de densidade.
Pipetee cuidadosamente o plasma sem tocar nos eritrócitos e sobreponha-o sobre o meio para formar duas fases separadas. Centrifuge o tubo a 516 g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Para isolar PBMCs, aspire e descarte o plasma acima da banda PBMC sem perturbar as células.
Colete a faixa da célula mononuclear entre o plasma e o meio, minimizando a coleta do meio. Adicione 20 mililitros de PBS ao tubo contendo PBMCs, depois centrifuge a 400 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e raspe o tubo para separar o pellet.
Adicione 10 mililitros de PBS frio para ressuspender as células. Para isolar neutrófilos, raspe o tubo para separar as células após pipetar o meio. Depois adicione 10 mililitros de PBS frio.
Agora transfira as células para um tubo cônico novo de 50 mililitros e centrífuga. Aspire o sobrenadante e raspe o tubo novamente. Agora pipete 10 mililitros de solução hipotônica fria no tubo e misture suavemente.
Misture suavemente por exatamente um minuto. Adicione rapidamente 10 mililitros de solução hipertônica fria para tornar a solução isotônica. Depois, conte os neutrófilos usando uma câmara de Neubauer e garanta que a pureza seja superior a 95%. Centrifuge a suspensão para obter um pellet celular.
Depois, resuspenda o pellet em PBS frio. Centrifuge as células mononucleares do sangue periférico a 400 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após remover o sobrenadante, ressuspenda as células em 120 microlitros de tampão de lavagem a frio.
Depois, pipeteio 35 microlitros de microesferas magnéticas CD66b para a suspensão celular. Incube a mistura no escuro a quatro graus Celsius por 30 minutos. Agora pipete um mililitro de tampão de lavagem fria no tubo.
Centrifuge o tubo a 400 g por três minutos. Raspe o tubo para separar a pastilha celular após remover o sobrenadante. E resuspendendo as células em um mililitro de buffer de lavagem.
Coloque uma coluna de separação magnética sobre um ímã. Adicione 0,5 mililitros de buffer de lavagem à coluna, permitindo que ela passe completamente. Transfira um mililitro das células ressuspensas para a coluna e deixe o tampão passar gota a gota.
Após a lavagem, transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga. Depois, pipeteie um mililitro de tampão de lavagem na coluna. Agora insira o êmbolo no topo da coluna.
Aplique pressão suavemente para eluir as células. Depois, remova o êmbolo e coloque a coluna em um novo tubo de microcentrífuga. Adicione mais um mililitro de buffer de lavagem à coluna.
Depois, insira novamente o êmbolo e aplique suavemente pressão para eluir as células restantes. Centrifuge ambos os tubos da microcentrífuga a 800 g por três minutos. Ressuspenda os pellets celulares de ambos os tubos em um mililitro de PBS frio.
Mantenha a suspensão da célula no gelo. Ressuspenda as células purificadas em um tampão de marcação feito de soro bovino fetal a 1% em PBS. Transfira 250 microlitros da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Adicione os anticorpos correspondentes contra as moléculas da membrana neutrófila ao tubo. Depois, incube as células por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Agora pipete um mililitro de PBS para o tubo.
Gire o tubo em uma microcentrífuga a 800 g por três minutos. Aspire o sobrenadante. Bata no tubo para quebrar o pellet.
E resuspenda as células em 0,5 mililitros de 1% de paraformaldeído. Depois, mantenha as células a quatro graus Celsius, protegidas da luz até a análise por citometria de fluxo. Analise as amostras usando citometria de fluxo, capturando 10.000 eventos por amostra.
Neutrófilos de baixa densidade em indivíduos saudáveis representaram aproximadamente 5% das células mononucleares do sangue periférico, enquanto o protocolo de isolamento magnético descrito apresentou neutrófilos de baixa densidade com cerca de 98% de recuperação. Neutrófilos expressam os marcadores de membrana CD10, CD11b, CD15, CD62L e CD66b. Neutrófilos de baixa densidade purificados magneticamente expressaram os mesmos marcadores de membrana que neutrófilos.
Neutrófilos purificados de baixa densidade apresentavam um núcleo multilobulado e eram semelhantes em tamanho aos neutrófilos. Tanto neutrófilos quanto neutrófilos de baixa densidade geraram espécies reativas de oxigênio em resposta à estimulação do PMA, com neutrófilos de baixa densidade produzindo níveis mais altos que neutrófilos. Neutrófilos de baixa densidade liberaram armadilhas extracelulares neutrófilas em resposta à estimulação da PMA, como evidenciado pela colocalização do DNA com elastase e citrulina.
Tanto neutrófilos purificados quanto neutrófilos de baixa densidade liberaram NETs com cinética e quantidades semelhantes após o tratamento com PMA. Nosso protocolo oferece uma forma rápida e reprodutível de obter neutrófilos de baixa densidade altamente puros e funcionais. Abordamos a falta de um protocolo padronizado e eficiente em termos de tempo para o isolamento de neutrófilos de baixa densidade do sangue humano.
Esse protocolo não exige treinamento especial para instrumentos complexos, além de ser mais econômico e rápido que o FACS.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo concentra-se em neutrófilos de baixa densidade (LDN) encontrados em células mononucleares do sangue periférico, que são raros em indivíduos saudáveis, mas aumentam significativamente em várias doenças. O artigo apresenta um método prático para isolar LDN puros e viáveis através de técnicas de centrifugação em gradiente de densidade e separação magnética.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Fundo
- Neutrófilos de baixa densidade estão associados a doenças como lúpus eritematoso sistêmico e câncer.
- Compreender os LDN pode fornecer insights sobre seus papéis nos mecanismos das doenças.
- O isolamento de LDN é crucial para estudar suas funções e potencial terapêutico.
- Os métodos atuais para o isolamento de LDN podem não produzir células puras e viáveis.
Propósito do Estudo
- Caracterizar as funções dos neutrófilos de baixa densidade.
- Definir o papel dos LDN em várias doenças.
- Apresentar um método eficiente para isolar LDN do sangue periférico.
Métodos Utilizados
- Uso de heparina como anticoagulante na coleta de sangue.
- Aplicação de dextran T500 para separação em gradiente de densidade.
- Incubação com microesferas magnéticas para classificação celular.
- Separação de LDN usando colunas magnéticas.
Principais Resultados
- O método isola com sucesso neutrófilos de baixa densidade puros e viáveis.
- LDN podem ser caracterizados por seus papéis funcionais na doença.
- O aumento da compreensão sobre LDN pode levar a melhores estratégias terapêuticas.
- A técnica de isolamento pode ser aplicada a vários cenários de pesquisa.
Conclusões
- Isolar LDN é essencial para estudar seu impacto na saúde e na doença.
- O método apresentado melhora a pureza e viabilidade das células isoladas.
- Pesquisas adicionais sobre LDN podem contribuir para avanços na imunologia e abordagens terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
