Análises Morfométricas de Forma: A Caixa de Ferramentas de Software de Análise para Quantificação de Formas Craniofaciais em Peixe-Zebra
February 27th, 2026
Este trabalho descreve um protocolo para quantificar a forma da cartilagem craniofacial usando software livre (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) para medir mudanças na estrutura facial em larvas de peixe-zebra.
Nossa pesquisa utiliza software morfométrico para quantificar se etanol e bmp7a interagem para causar defeitos craniofaciais sutis em peixes-zebra. Medidas lineares deixam passar mudanças sutis. Com esse método, usamos marcos para quantificar mudanças de forma enquanto controlamos as diferenças de tamanho.
Para começar, abra o software tpsDigs2. Clique em Input Source, depois em Arquivo, e selecione o arquivo salvo do TPS Notepad. Clique em Opções para visualizar a opção Ferramentas de Imagem.
Defina o comprimento de referência para 100 micrômetros e pressione em Definir escala. Clique em OK para confirmar os parâmetros de escala, depois saia da janela das ferramentas de imagem. Depois, clique no símbolo de mira e coloque o primeiro ponto de referência na articulação média entre as cartilagens do Meckel.
Coloque os segundos pontos de referência nas articulações bilaterais entre as cartilagens de Meckel e palatoquadradas. Coloque o terceiro ponto de referência na articulação média entre as cartilagens cerato-heiais e o quarto ponto de referência nas articulações bilaterais, entre as cartilagens palatoquadrada e cerato-ital. Depois, coloque os quintos pontos de referência na extremidade distal das cartilagens hiomandibulares, garantindo que os pontos de referência estejam na mesma ordem para cada imagem.
Após posicionar pontos de referência, clique em Arquivo para abrir o menu suspenso. Selecione Salvar dados e depois Sobrescrever para salvar o arquivo atualizado. Saia do software tpsDigs2.
Inicie o software MorphoJ. Clique em Arquivo, selecione Criar Novo Conjunto de Dados e atribua um nome ao conjunto de dados. Clique em TPS e selecione o arquivo Notepad contendo os novos pontos de dados adicionados.
Depois, crie o conjunto de dados. Na Árvore de Projetos, clique no conjunto de dados. Selecione Preliminares, depois Novo Ajuste Procruste.
Escolha Alinhar por eixos principais e clique em Executar Ajuste de Procrustes. Em Preliminares, selecione Gerar Matriz de Covariância para obter coordenadas do procreste. Execute a função quando solicitado.
Agora, selecione Criar ou Editar Wireframe e vincule os pontos nas imagens. Clique nos pontos vinculados e aceite ou crie a imagem, depois edite os classificadores conforme necessário. Abra um programa de planilha enquanto mantém o MorphoJ aberto.
Insira informações do classificador como GENÓTIPO, TRATAMENTO e GENOTIPO TRATAMENTO E salve o arquivo como um arquivo CSV. No MorphoJ, clique em Arquivo e selecione Importar Variáveis do Classificador para importar o arquivo CSV. Volte para a Árvore de Projetos e clique no conjunto de dados.
Em Preliminares, selecione Editar Classificadores para confirmar que todas as imagens estão incluídas. Na Árvore de Projetos, selecione CovMatrix e clique em Variação no topo da página. Selecione Análise de Componentes Principais para calcular as pontuações dos componentes principais.
Clique em pontuações no PC para exibir o gráfico gerado. Clique com o botão direito no gráfico e selecione Elipse de Confiança para adicionar o classificador desejado. Selecione Pontos de Dados de Cor, atribua cores e clique em OK para aplicar alterações.
Em Preliminares, selecione Opções de Conjunto para o Gráfico de Formas localizado na parte inferior da tela. Escolha Gráficos de Wireframe e modifique as cores da forma alvo, da forma inicial e dos números. Selecione variação e depois escolha Procrustes ANOVA.
Exporte os resultados do procrustes ANOVA para o arquivo de planilha previamente criado. No MorphoJ, selecione o conjunto de dados original na Árvore do Projeto. Clique em Comparação, depois em Análise de Variações Canônicas.
Selecione as variáveis classificadoras GENOTYPE TREATMENT e execute a função. Para exportar os resultados, clique na aba Resultados e clique com o botão direito na página de resultados. Selecione Exportar para Arquivo e salve os resultados.
Na Árvore de Projetos, selecione Análise Variada Canônica, depois pontuações. Clique em Arquivo, escolha Exportar Conjunto de Dados, selecione o tipo de dado e TRATAMENTO DO GENÓTIPO. Salve as pontuações CVA como um arquivo TXT.
Para preparar o arquivo para o software PAST, abra as pontuações CVA salvas em um editor de texto. Substitua o termo id no canto superior esquerdo por Rótulo e salve o arquivo editado. Abra o software PAST e clique em Arquivo, depois abra para selecionar o arquivo de pontuações CVA editado.
Na janela de importação. Selecione Nomes, dados para linha e coluna e Tab como separador, depois clique em Importar. Na aba Mostrar, selecione Atributos de Coluna.
No menu suspenso ao lado de Type, atribua Grupo à primeira coluna contendo variáveis classificadoras. Destaque as colunas de dados componentes principais ou variadas canônicas. Selecione Multivariado, depois Testes, e escolha Normalidade Multivariada para rodar o teste de normalidade separadamente para os dados de componentes principais e variações canônicas.
Clique na célula cinza vazia no canto superior esquerdo acima de Tipo para selecionar todo o conjunto de dados. Selecione Multivariado, depois Testes, e escolha análise multivariada de variantes para realizar a análise. Exporte os resultados do MANOVA para o arquivo de planilha criado anteriormente.
Imagens do viscerocrânio foram adquiridas para cada larva de cada genótipo e grupo de tratamento. Cartilagens do viscerocrânico foram rotuladas em uma imagem representativa, e marcos foram colocados em cada imagem para gerar conjuntos de dados rotulados por marcos. O componente principal 1 representou aproximadamente 34% da variação total da forma e o componente principal 2 representou 20% da variação total da forma.
Cada componente principal apresentou variação específica na forma viscerocraniana em relação à forma média de todos os viscerocranianos. O gráfico de análise de componentes principais mostrou médias sobrepostas entre os grupos genótipo e de tratamento sem agrupamento distinto. Larvas selvagens tratadas com etanol apresentaram uma grande elipse de confiança de 95% da média devido ao baixo tamanho da amostra.
A variável canônica 1 representava um encurtamento ou alongamento sutil da articulação cerato-hial no wireframe magenta em relação ao wireframe preto médio. A variável canônica 2 mostrou um deslocamento medialmente apenas de um lado do viscerocrânio nas articulações entre o palatoquadrado de Meckel e o palatoquadrato-ceratohial. Larvas selvagens tratadas com etanol apresentaram uma grande elipse de confiança de 95% da média, que se sobrepôs a todos os outros grupos.
A análise multivariada das variantes revelou um efeito geral significativo do genótipo e do tratamento. Montar amostras de forma consistente é o maior desafio. Larvas inclinadas podem causar medições imprecisas e alterar resultados.
Esse protocolo se adapta a diferentes estruturas anatômicas, analisa dados 3D, gera medidas lineares e ajuda a determinar tamanhos de amostras experimentais. Estudos futuros investigarão outras sensibilidades genótipos-etanol, expandirão o tamanho das amostras e aplicarão essa caixa de ferramentas versátil a várias estruturas anatômicas.
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Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
