Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método automatizado para analisar e quantificar mudanças na morfologia de uma célula de forma indefinida retirada de imagens tridimensionais de fluorescência confocal. Isso é feito realizando primeiro o experimento de estimulação química para incluir células tratadas com células agonistas, tratadas com antagonistas, seguidas por agonistas e células sem tratamento. As células são então preparadas para análise de imunofluorescência.

O segundo passo é adquirir imagens de fluorescência tridimensionais multiespectrais. Em seguida, a análise morfométrica tridimensional é realizada usando os softwares de computador ameris neuroscience, ameris XT e MATLAB. As alterações fenotípicas de uma única célula visualizadas por meio de análise morfométrica tridimensional são então analisadas e quantificadas como uma etapa final.

Em última análise, essa plataforma de software é usada para quantificar as mudanças na forma da célula após a ativação do receptor, fornecendo uma ferramenta adicional para a descoberta de medicamentos. Geralmente, o pesquisador tem uma experiência padrão em sistema biológico, pode não ter familiaridade com a aplicação do computador. Neste protocolo no módulo I 60, preencha a lacuna entre a visualização e a linguagem de computador Antes do início deste procedimento.

Transfectar células renais embrionárias humanas com hemaglutinina marcada com receptor dois do fator liberador de corticotropina ou CRF R dois, conforme referenciado no protocolo escrito. CFR dois é um receptor acoplado à proteína G ou GPCR. No dia seguinte à transfecção, cubra as lamelas e coloque-as em uma placa de seis poços.

Adicione 10 mililitros de PBS a um frasco de cinco miligramas de polilisina liofilizada e misture. Em seguida, dilua cinco mililitros de polilisina dissolvida em 500 mililitros de PBS e adicione dois mililitros da mistura em cada uma das lamínulas. Deixe a placa com lamínulas em temperatura ambiente por 20 minutos Após 20 minutos, lave as lamínulas adicionando dois mililitros de PBS e, em seguida, retirando, repita esse processo duas vezes.

Após a edição de dois mililitros de DMEM com meio 10% FBS, adicione duas a cinco gotas de células nas lamínulas. As células devem estar na concentração necessária para atingir 60% de fluência. No dia seguinte.

Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Verifique se as células são 60% confluentes para o tratamento com agonistas. Estimule as células designadas substituindo o meio por dois mililitros de meio suplementado com o CRF R dois ligantes endógenos fator de liberação de corticotropina na concentração de um micromolar.

Incube as células em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos para que as células sejam pré-tratadas com antagonista. Substitua o meio por dois mililitros de meio suplementado com o CFR seletivo dois antagonistas anti-salvamento 30 na concentração de um micromolar. Incube as células em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após o tratamento antagonista. Estimule as células com o agonista CRF e incube-o a 37 graus Celsius por 30 minutos para células não tratadas. Substitua o meio por dois mililitros de meio fresco após o tratamento.

Substitua o meio em cada poço por dois mililitros de meio fresco e adicione anti-HHA diluído de um a mil, após uma incubação de 60 minutos a 37 graus Celsius. Aspire o meio e adicione dois mililitros de fixador a cada um. Bem incubar a placa à temperatura ambiente durante 20 minutos após aspirar o fixador.

Lave as células três vezes com solução salina tris puffered. Cain. Adicione 100 microlitros de solução sanguínea em cima de cada tampa, deslize e incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, aspire a solução de blotto existente dos poços e adicione 100 microlitros de coquetel de anticorpos secundários frescos em cada lamínula após uma incubação de 45 minutos em temperatura ambiente na lavagem escura quatro vezes com TBSC, adicionando e removendo suavemente a solução da parede lateral do poço enquanto ainda está na solução de lavagem final.

Pegue cada lamínula com uma agulha e uma pinça curva. Coloque as células de lamínula voltadas para baixo em uma lâmina com uma gota de meio de montagem de escudo vetorial com correção dappy com esmalte e deixe secar por 15 a 20 minutos. Alexa, 4 88 nanômetros conjugado musa anticorpo é usado para visualizar CFR dois e DAPI é usado para visualizar o estágio mitótico dos núcleos para começar a montar as células fixas em um microscópio fluorescente para limitar a subjetividade experimental, manter as condições experimentais desconhecidas até que as imagens sejam adquiridas e analisadas para adquirir imagens.

Um óleo de acro mat plano, objetiva DIC com ampliação de 63 x e abertura numérica de 1,4 foi usado em combinação com o microscópio metaconfocal zeis LSM five 10 conectado a um sistema de laser de dois fótons integrado coerente Durante o processo de aquisição de dados, compartimentalize as células por particionamento multicanal e c para incluir dados da membrana nuclear para as extremidades externas do receptor extracelular. Processe os dados de fluorescência usando amris, o que permite a visualização e segmentação de um conjunto de dados de microscopia 3D. Seguindo o algoritmo projetado por Amaris primeiro, utilize a renderização da superfície para representar a membrana nuclear NU.

Amaris vai determinar se há mais de um núcleo na região de interesse, ou ROI. Em seguida, utilize o algoritmo de criação de pontos para localizar os dois pontos de extensão do CFR. Compensa o ruído de fundo e a intensidade irregular da complexa rede de células amorfas para maximizar a inclusão de cada unidade de detecção de fluorescência do CFR dois, defina o diâmetro dos pontos para 0,2 micrômetros, que é a menor unidade dentro da imagem.

Isso permite a extrapolação de informações distintas na forma de uma intensidade medida. Usando um filtro gaussiano, incorpore a filtragem de pontos no processo de criação automatizada do local. Para evitar o cátion de dados, converta o conjunto de dados de ponto fixo de oito bits em float de 32 bits.

Selecione a superfície criada e determine a localização espacial exata de cada ponto fora da superfície nuclear realizando uma transformação de distância usando a membrana nuclear como ponto de referência. Troque os dados de intensidades de voxel para dados de coordenadas pontuais usando o módulo ameris XT com interface com o MATLAB. Selecione pontos e selecione estatísticas codificadas em tipo estatístico.

Escolha o centro de intensidade relatado no novo canal criado. Carregue a cor desejada para exibição e defina o intervalo do mapa de cores para análise. Os dados numéricos podem ser visualizados na guia estatística e exportados para o Excel usando o prisma GraphPad.

Quantificar os dados resultantes e apresentá-los em formato gráfico para análise estatística. Realizar comparações entre grupos usando Inova de duas vias e pós-teste de Bonferroni apresentam dados como média mais ou menos desvio padrão. Para demonstrar o poder dessa abordagem, as alterações celulares resultantes da interação dos receptores acoplados à proteína G e do receptor dois do fator liberador de corticotropina com seu ligante endógeno CRF.

Em HT K 2 transfectado 93 células foram quantificadas imagens mescladas são visualizadas usando Alexa 4 88 conjugado, anti camundongo, anticorpo secundário e DPI para visualizar os núcleos. Os resultados revelam que os receptores CRF R dois estão localizados na membrana plasmática e se projetam a partir de regiões finitas da membrana das células. Usando a análise 2D convencional, é possível detectar esse subconjunto de receptores extracelulares CRF R dois somente se os pontos de adesão do receptor nas tampas de vidro forem analisados.

Consequentemente, qualquer outra informação derivada de dados MULTIESPECTRAIS empilhados ZS é perdida. O resultado não escolheu diferença entre nenhum tratamento e agonista. Embora os pontos de adesão do receptor sejam dramaticamente diferentes quando as células são tratadas com CRF, os receptores extracelulares são bastante reduzidos, conforme mostrado pela diminuição da distância das manchas da membrana plasmática.

Eles também são redistribuídos de locais principalmente finitos para vários locais discretos. O efeito do CRF na distribuição da membrana do receptor é prevenido pelo pré-tratamento com os dois antagonistas específicos do CR. 30 30.

Nessas condições, as duas extensões do CRFR não mudam com o tratamento do CRF. A distribuição distal de manchas plotadas em intervalos codificados por cores de espectro de cinco micrômetros é utilizada para visualizar a distância dos voxels da membrana nuclear. Nenhum tratamento e pré-tratamento antagonista antes do tratamento com agonista não mostraram diferença significativa na contração do GPCR.

O tratamento das células com o agonista CRF reduz progressivamente o número de voxels contendo CFR dois quando comparado a nenhum tratamento ou em comparação com células. Pré-tratado com antagonista As após seu desenvolvimento. Essa técnica desempenhou o caminho para o pesquisador no campo da técnica de imagem de quantificação explorar e caracterizar inúmeras alterações fenotípicas de célula única, tornando este ensaio baseado em células uma ferramenta adicional de perfil de célula única para o processo de descoberta de medicamentos.