Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método automatizado para analisar e quantificar alterações na morfologia de células com formato indefinido obtidas a partir de imagens de fluorescência confocal tridimensionais. Isso é realizado primeiramente executando o experimento de estimulação química, que inclui células tratadas com agonista, células tratadas com antagonista seguido de agonista e células sem tratamento. Em seguida, as células são preparadas para análise de imunofluorescência.

O segundo passo é adquirir imagens tridimensionais de fluorescência multiespectrais. Em seguida, é realizada uma análise morfométrica tridimensional utilizando os softwares computacionais ameris neuroscience, ameris XT e MATLAB. As alterações fenotípicas em nível de célula única visualizadas por meio da análise morfométrica tridimensional são então analisadas e quantificadas como etapa final.

No final, esta plataforma de software é utilizada para quantificar alterações na forma celular após a ativação do receptor, fornecendo uma ferramenta adicional para a descoberta de fármacos. Geralmente, os pesquisadores possuem expertise padrão em sistemas biológicos, mas podem não estar familiarizados com aplicações computacionais. Neste protocolo no módulo I 60, preenche-se a lacuna entre a visualização e a linguagem computacional antes do início deste procedimento.

Transfete células renais embrionárias humanas com o receptor dois para fator liberador de corticotropina marcado com hemaglutinina ou CRF R dois, conforme referenciado no protocolo escrito. CRF dois é um receptor acoplado à proteína G ou GPCR. No dia seguinte à transfeção, flame aqueça lamínulas e coloque-as em uma placa de seis poços.

Adicione 10 mililitros de PBS a um frasco com cinco miligramas de polilisina liofilizada e misture. Em seguida, dilua cinco mililitros de polilisina dissolvida em 500 mililitros de PBS e adicione dois mililitros da mistura sobre cada uma das lamínulas. Deixe a placa com as lamínulas à temperatura ambiente por 20 minutos. Após 20 minutos, lave as lamínulas adicionando dois mililitros de PBS e depois removendo; repita este processo duas vezes.

Após a adição de dois mililitros de meio DMEM com 10% de FBS, adicione de duas a cinco gotas de células sobre as lamínulas. As células devem estar na concentração necessária para atingir 60% de confluência. No dia seguinte.

Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Verifique se as células estão com 60% de confluência para o tratamento com agonista. Estimule as células designadas substituindo o meio por dois mililitros de meio suplementado com o ligante endógeno do CRF R dois, fator liberador da corticotropina, na concentração de um micromolar.

Incube as células em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos para que sejam pré-tratadas com o antagonista. Substitua o meio por dois mililitros de meio suplementado com o antagonista seletivo CFR dois, anti salvaging 30, na concentração de um micromolar. Incube as células em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após o tratamento com antagonista. Estimule as células com o agonista CRF e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para as células não tratadas. Substitua o meio por dois mililitros de meio fresco após o tratamento.

Substitua o meio em cada poço por dois mililitros de meio fresco e adicione anti-HHA diluído na proporção de um para mil, após uma incubação de 60 minutos a 37 graus Celsius. Aspire o meio e adicione dois mililitros de fixador a cada poço. Incube a placa à temperatura ambiente por 20 minutos após a aspiração do fixador.

Lave as células três vezes com solução salina tamponada com tris. Adicione 100 microlitros de solução de sangue sobre cada lamínula e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, aspire a solução de blotto existente dos poços e adicione 100 microlitros de uma nova mistura de anticorpo secundário a cada lamínula, seguido de uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave quatro vezes com TBSC, adicionando e removendo suavemente a solução da parede lateral do poço, mantendo ainda a solução final de lavagem.

Retire cada lamínula com uma agulha e pinça curva. Posicione a lamínula com as células voltadas para baixo sobre uma lâmina contendo uma gota de meio de montagem Vector Shield com DAPI, fixe com esmalte e deixe secar por 15 a 20 minutos. Utiliza-se o anticorpo marcado com Alexa 488 nm para visualizar CFR dois e DAPI para visualizar os núcleos. Na fase mitótica, monte as células fixadas em um microscópio de fluorescência. Para limitar a subjetividade experimental, mantenha as condições experimentais desconhecidas até após a aquisição e análise das imagens, para obter as imagens.

Um objetivo de óleo acromático de plano, com ampliação de 63x e abertura numérica de 1,4, foi utilizado em combinação com o microscópio confocal Zeiss LSM 510 META conectado a um sistema a laser de dois fótons integrado Coherent. Durante o processo de aquisição de dados, compartimentalize as células tanto por multicanal quanto por particionamento C, para incluir dados desde a membrana nuclear até as extremidades externas dos receptores extracelulares. Processe os dados de fluorescência utilizando o Amaris, o que permite a visualização e segmentação de um conjunto de dados de microscopia tridimensional. Após o algoritmo projetado pelo Amaris, utilize primeiro a renderização de superfície para representar a membrana nuclear NU.

Amaris determinará se há mais de um núcleo na região de interesse, ou ROI. Em seguida, utilize o algoritmo de criação de pontos para localizar os pontos de extensão do CFR dois. Compense o ruído de fundo e a intensidade irregular da rede complexa de células com formato amorfo para maximizar a inclusão de cada unidade de detecção de fluorescência do CFR dois, definindo o diâmetro dos pontos em 0,2 micrômetros, que é a menor unidade dentro da imagem.

Isso permite a extrapolação de informações distintas na forma de uma intensidade medida. Usando um filtro gaussiano, incorpore a filtragem de pontos no processo automatizado de criação dos pontos. Para evitar a corrupção dos dados, converta o conjunto de dados de ponto fixo de oito bits para ponto flutuante de 32 bits.

Selecione a superfície criada e determine a localização espacial exata de cada ponto fora da superfície nuclear realizando uma transformação de distância usando a membrana nuclear como ponto de referência. Troque os dados de intensidade dos vóxeis por dados de coordenadas dos pontos usando o módulo ameris XT interligado ao MATLAB. Selecione os pontos e selecione o código estatístico no tipo estatístico.

Escolha o centro de intensidade relatado no novo canal criado. Carregue a cor desejada para exibição e defina o intervalo do mapa de cores para análise. Os dados numéricos podem ser visualizados na aba estatística e exportados para o Excel utilizando o GraphPad Prism.

Quantifique os dados resultantes e apresente-os em formato gráfico para análise estatística. Realize comparações entre grupos utilizando teste Inova a dois fatores e teste post hoc de Bonferroni, apresentando os dados como média ± desvio padrão. Para demonstrar o poder desta abordagem, as alterações celulares que resultam da interação dos receptores acoplados à proteína G e do receptor de fator liberador de corticotropina dois com seu ligante endógeno CRF.

Em células HT K 2 93 transfectadas, as imagens sobrepostas foram quantificadas e visualizadas utilizando um anticorpo secundário conjugado à Alexa 4 88 anti-rato e DPI para visualizar os núcleos. Os resultados revelam que os receptores CRF R dois estão localizados na membrana plasmática e se projetam a partir de regiões específicas da membrana celular. Utilizando análise convencional em 2D, é possível detectar esse subconjunto de receptores extracelulares CRF R dois somente se os pontos de adesão dos receptores no cubo de vidro forem analisados.

Consequentemente, qualquer outra informação derivada dos dados MULTIESPECTRAIS empilhados de ZS é perdida. O resultado mostrou nenhuma diferença entre ausência de tratamento e agonista. Embora os pontos de adesão do receptor sejam drasticamente diferentes quando as células são tratadas com CRF, os receptores extracelulares são grandemente reduzidos, conforme demonstrado pela diminuição da distância das manchas em relação à membrana plasmática.

Eles também são redistribuídos de locais principalmente finitos para uma série de locais discretos. O efeito do FCR sobre a distribuição do receptor na membrana é impedido pelo pré-tratamento com os antagonistas específicos do CR dois. 30 30.

Sob essas condições, as extensões do CRFR dois não mudam com o tratamento com CRF. A distribuição distal de pontos plotados em intervalos codificados por cores no espectro de cinco micrômetros é utilizada para visualizar a distância dos voxels em relação à membrana nuclear. A ausência de tratamento e o pré-tratamento com antagonista antes do tratamento com agonista não mostraram diferença significativa na contração do RCPG.

O tratamento das células com o agonista CRF reduz progressivamente o número de vóxeis contendo CFR2 quando comparado ao não tratamento ou a células não tratadas. Pré-tratadas com o antagonista As após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das técnicas de imagem de quantificação explorarem e caracterizarem inúmeras alterações fenotípicas em nível de célula única, tornando este ensaio baseado em células uma ferramenta adicional de perfilamento de células individuais no processo de descoberta de fármacos.