Культивирование эксплантатов нервной ткани

Культивирование эксплантатов используется как метод изучения развития определенных клеточных популяций и нейронных структур. В экспериментах по нейробиологии развития эксплантатами называют фрагменты нервной ткани, выделенные из эмбриона для дальнейшего развития in vitro. Такие культуры позволяют исследователям манипулировать развивающимися тканями и визуализировать их способами, которые невозможны in vivo. В этом видео будут представлены основные принципы работы с эксплантированными тканями, пошаговые процедуры двух подходов к культивированию эксплантатов, а также области применения данного метода.

Прежде чем перейти к методам, рассмотрим некоторые основные принципы. Эксплантаты могут быть получены из ряда модельных организмов и различных типов тканей. Как правило, культуры создаются путем осторожного извлечения нервной ткани из эмбриона, выделения интересующей области и ее помещения в искусственную среду.

Ткани также могут быть разрезаны на тонкие срезы и выращены в «культуре срезов». Поскольку среда культивирования предназначена для имитации условий in vivo всего органа, такая стратегия культивирования часто называется «органотипической».

Перед началом работы обязательно простерилизуйте инструменты 70% этанолом. Затем эвтаназируйте беременную мышь методом, принятым в вашей лаборатории. После этого хирургическим путем удалите матку и поместите ее в ледяной буфер. Перенесите чашку под диссекционный микроскоп и извлеките отдельные эмбрионы из желточного мешка. Затем изолируйте мозг, осторожно вырежьте интересующую вас область и перенесите ее в чашку с культуральной средой. Эксплантаты можно поддерживать в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение нескольких недель, заменяя 50% среды каждые 2 - 3 дня.

Культивирование срезов тканей головного мозга требует нескольких дополнительных этапов. Перед секционированием ткань заливают агарозой, которая служит опорой и позволяет сохранить целостность ткани при нарезке. Для этого раствор низкоплавящей агарозы с концентрацией 1,5% нагревают до полного растворения агарозы. Затем агарозу переливают в формы для заливки и дают ей немного остыть, чтобы избежать повреждения ткани.

После этого ткань осторожно погружают в раствор и оставляют агарозу до полного затвердевания. Полученные блоки подрезают, приклеивают к предметному столику и секционируют с помощью вибратома — прибора, который использует вибрирующий нож для нарезки тонких срезов живой ткани. По мере получения срезов их осторожно переносят на покрытую пластину со средой для культивирования и культивируют, как было описано ранее.

Использование культур эксплантатов имеет ряд преимуществ по сравнению с методами in vivo и другими методами in vitro. Во-первых, клетки в эксплантированной ткани более доступны для экспериментальных инструментов. Во-вторых, тот факт, что эксплантаты сохраняют сложную клеточную архитектуру развивающейся нервной ткани, позволяет изучать межклеточные взаимодействия. В-третьих, поскольку ученые могут контролировать химический состав питательной среды, они могут использовать эксплантаты для тестирования влияния конкретных соединений на развитие ткани.

Тем не менее, поскольку ткань извлекается из естественной среды, необходимо принять специальные меры для поддержания ее жизнеспособности и здоровья in vitro. Например, наличие внеклеточного матрикса (ВКМ) оказывает значительное влияние на поведение клеток, поэтому для покрытия культуральных чашек часто используют очищенные белки ВКМ. Другим важным аспектом является раствор, в котором выдерживают эксплантаты. Хотя часто используются традиционные среды для культивирования клеток, некоторые эксперименты требуют растворов, максимально приближенных по составу к жидкости, циркулирующей в центральной нервной системе, — спинномозговой жидкости, которая является критически важным реагентом в экспериментах, которые вы сейчас увидите.

Теперь, когда мы рассмотрели методы культивирования эксплантатов, давайте посмотрим, как эти методы применяются на практике.

Анализы миграции клеток используют эксплантированные ткани для изучения сигналов отталкивания и притяжения, участвующих в перемещении нервных клеток. В данном эксперименте микросферы, предварительно выдержанные в факторах роста, имплантируют в эксплантаты заднего мозга для изучения миграции нейронов. После 3–4 дней воздействия нейроны визуализировали с помощью конфокального микроскопа. Результаты показывают, что мотонейроны мигрируют к микросферам, пропитанным фактором роста эндотелия сосудов, но не к контрольным микросферам, выдержанным в буфере.

Методы совместного культивирования часто используются для исследования межклеточных взаимодействий в процессе развития. В этом примере сегменты спинного мозга культивировали поверх слоя мышечных клеток, чтобы изучить процесс формирования связей между спинальными мотонейронами и скелетными мышцами. Уже через 2 дня инкубации наблюдается выход отростков нейронов, известных как нейриты, из эксплантата. В течение 5 дней фиксируется функциональная иннервация, проявляющаяся в сокращении слоя мышечных клеток.

В ходе развития нервной системы нейроны должны удлинять свои аксоны, чтобы установить связь между целевой тканью и центральной нервной системой. Одним из способов изучения этого сложного процесса являются анализы на руководство ростом аксонов. Исследователи используют эксплантированные ткани для изучения факторов внутри нейронов и в окружающей среде, которые помогают аксону достичь правильного местоположения.

Вы только что посмотрели руководство JoVE по культивированию эксплантатов нейральной ткани. В этом видео был представлен обзор преимуществ культур эксплантатов, стратегии культивирования, пошаговые протоколы двух наиболее распространенных процедур получения эксплантатов, а также способы применения этих методов в современной лабораторной практике.

Спасибо за просмотр!