Методическая статья

Подготовка Качество Инозитол пирофосфаты

15.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3027

⸱

3 сентября 2011 г.

 ,  ,  ,  , 
1Medical Research Council (MRC), Cell Biology Unit and Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London

В этой статье

Краткое содержание

Инозитол пирофосфаты играют важную роль в человеческой патологии, такие рака, диабета и ожирения, однако точный механизм действия является предметом спора. Отсутствие коммерчески доступных инозитол пирофосфаты предоставляет детальные исследования проблематично. Здесь мы опишем простой протокол для производства и изолировать мг инозитол пирофосфаты.

Аннотация

Мио-инозитол встречается в природе либо в неизмененном виде, либо в форме более сложных фосфорилированных производных. Среди последних наиболее распространенными в эукариотических клетках являются инозитолпентакисфосфат (IP5) и инозитолгексакисфосфат (фитиновая кислота или IP6). IP5 и IP6 служат предшественниками молекул инозитолпирофосфатов, которые содержат одну или несколько пирофосфатных связей1. Фосфорилирование IP6 приводит к образованию дифосфоинозитолпентакисфосфата (IP7 или PP-IP5) и бисдифосфоинозитолтетракисфосфата (IP8 или (PP)2-IP4). Инозитолпирофосфаты были выделены из всех изученных на данный момент эукариотических организмов. Кроме того, два различных класса ферментов, отвечающих за синтез инозитолпирофосфатов, высококонсервативны в ходе эволюции2-4.

IP6-киназы (IP6Ks) обладают огромной каталитической гибкостью, превращая IP5 и IP6 в PP-IP4 и IP7 соответственно, и в дальнейшем, используя эти продукты в качестве субстратов, способствуют образованию более сложных молекул5,6. Недавно был идентифицирован второй класс ферментов, генерирующих пирофосфаты, в виде белка дрожжей VIP1 (также называемого PP-IP5K), который способен превращать IP6 в IP7 и IP87,8.

Инозитолпирофосфаты регулируют множество различных клеточных процессов, таких как секреция инсулина9, длина теломер10,11, хемотаксис12, везикулярный транспорт13, фосфатный гомеостаз14 и высвобождение белка gag ВИЧ-115. Для этого класса молекул было предложено два механизма действия. Они могут влиять на функции клетки путем аллостерического взаимодействия со специфическими белками, такими как AKT16. В качестве альтернативы пирофосфатная группа может передавать фосфат предварительно фосфорилированным белкам17. Огромный потенциал этой области исследований сдерживается отсутствием коммерческого источника инозитолпирофосфатов, что препятствует многим ученым в изучении этих молекул и этой новой посттрансляционной модификации. Методы, доступные в настоящее время для выделения инозитолпирофосфатов, требуют использования сложного хроматографического оборудования18,19. В этих процедурах используются кислые условия, которые могут привести к деградации инозитолпирофосфатов20 и, следовательно, к низкому выходу продукта. Кроме того, трудоемкие процедуры обессоливания после колонки ограничивают их применение специализированными лабораториями.

В данном исследовании мы описываем простой метод получения, выделения и очистки продуктов реакций IP6-киназы и PP-IP5-киназ. Этот метод стал возможен благодаря способности полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) разделять высокофосфорилированные инозитолполифосфаты20. После проведения ферментативных реакций IP6K1 и PP-IP5K с использованием IP6 в качестве субстрата метод PAGE применялся для разделения образовавшихся инозитолпирофосфатов, которые затем элюировали водой.

Протокол

1. Ферментативной реакции - день 1 (1 час в день)

  1. Первый шаг заключается в подготовке 10-20 независимых ферментативных реакций, в которых ИП 6 K1 или VIP1 преобразования IP 6 до pyrophosphorylated изоформ.
  2. Мы используем его IP-6 К1 и GST-VIP1 ферментов, очищенный от E. палочки в соответствии с протоколом описано выше 17,18.
  3. Подготовка 50 мкл реакции, содержащие 1X реакционного буфера (30 мМ Hepes рН 6,8, 50 мМ NaCl, 6 мМ MgSO 4, 1 мМ DTT), 6 мм фосфокреатина (ПЦР), 25 ед / мл CreatinePhosphoKinase (КФК), 5 мМ АТФ (Mg соли), 0,3 мМ IP6, 0,05-0,1 мкг Его-IP 6 K1 или GST-VIP1. Регулировка громкости с MiliQ DDH 2 O.
  4. Кратко спина реакции и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи с вращением.

2. Полиакриламидном геле литья и погрузка - 2-й день (4 часа в день)

  1. Полиакриламидном геле подготовлен с использованием 24 см в длину, 18 см шириной пластин стекла и 1,5 мм шириной прокладки. Обычно 16 полосы или препаративной одной гребенкой переулок используется.
  2. Подготовка смеси (50 мл / гель), содержащий следующие: 35,5% (м / о) акриламид: бис-акриламид 19:1, 1X Трис / Борат / EDTA (КЭ), 0,05% (м / о) персульфата аммония (APS ), 0,05% (м / о) Temed. Вылейте смесь предварительно литых стеклянных пластин, вставьте расческу и пусть полимеризоваться в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
  3. Как только гель полимеризуется, передачу аппарата для холодной комнате и предварительно запустить в 1X TBE около 30-60 минут при 200-300 вольт.
  4. Добавить 1X из OrangeG красителя (10 мМ Трис-HCl pH7.0, 1 мМ ЭДТА, 30% глицерина, 0,1% OrangeG) для каждой реакции. Подготовка образцов, содержащих 2 нмоль ИП 6 для загрузки в качестве стандартного контроля.
  5. Промыть каждую лунку тщательно проточной буфера с помощью шприца и иглы 21G, чтобы удалить осадок, а затем загрузить геля. Избегайте нагрузки на стороне скважин.
  6. Выполнить геля в течение ночи при 450-550 Вольт (7 MAMP / гель), пока OrangeG группы красителя в течение последних 10 см от нижней части геля.

3. Выделение IP-7 - день 3 (4 часа) и 4-й день (6-7 часа SpeedVac процесса сушки)

  1. Разберите гель аппарата и аккуратно удалить одну стеклянную пластину оставив гель на другую. Cut небольшая часть геля от чуть выше OrangeG группы красителя на дно содержащие ИП 6 стандартных и один образец полосы, как показано на рисунке 1.
  2. Пятно вырезать часть геля толуидиновым синим (0,1% (м / о) толуидиновым синим, 20% (м / о) метанола, 2% (вес / объем) глицерин) в течение нескольких минут (1-3 мин) или до инозитол группы пирофосфат появляется. Поместите стеклянную пластинку ранее удалили обратно поверх геля для предотвращения неокрашенных гель от высыхания.

ИП 7 полоса должна быть видна, поскольку она работает немного медленнее, чем ИП 6 стандарта. АТФ, который работает быстрее, чем IP-6, также должны быть видны (рис. 1). Передача окрашенные части геля в де-красящим раствором (20% (м / о) метанол) в течение нескольких минут, смыть любое превышение толуидиновым синим и переместить гель с неокрашенными геля.

Если визуализация выше pyrophosphorylated инозитол изоформ (IP-8 и IP-9) не требуется, пятно гель с Толуидин решение окрашивания синий в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем смыть толуидин синий с де-красящим раствором в течение приблизительно 15 минут.

  1. С лезвием бритвы вырезать IP 7-ми полосный на неокрашенных часть геля, используя в качестве ссылки ИП 7 миграции положение определяется с окрашенных гель (рис. 1).
  2. Положите ИП 7 группа, которая была вырезана из геля на 15 мл трубки и добавить 10 мл MilliQ DDH 2 O. Положите труб в ротации в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите жидкость для удаления избытка КЭ и микроскопических частиц акриламида.
  3. Впоследствии, выполняют две дегидратации-гидратации циклов. Добавьте 5 мл 50% (м / о) метанола в трубку с гелем, содержащим IP-7 и вращаются при комнатной температуре в течение 2 часов. Передача геля для новых 15 мл пробирку, содержащую 5 мл MilliQ DDH 2 O и вращаться при комнатной температуре в течение 2 часов. Не выбрасывайте метанола и MilliQ H 2 O из труб. Повторите дегидратации-гидратации цикл еще раз, повторно передачи полиакриламидном геле в 15 мл трубы использовались ранее. Один из моющие средства могут быть выполнены в течение ночи.
  4. Чтобы сосредоточиться элюировали ИП 7, сухой 10 мл вместе (5 мл MilliQddH 2 O и 5 мл 50% (м / о) метанола) с использованием SpeedVac нагревают при 60 ° C.
  5. Как только образцы почти сухая, передача оставшейся жидкости (300-600 мкл) к A1.5 мл центрифужную пробирку и спина в течение 2 минут при 5000 оборотах в минуту.
  6. Сбор супернатант и передачи в свежем 1,5 мл центрифужную пробирку, оставьтенижняя 20-30 мкл, поскольку она может содержать акриламида частиц.
  7. При необходимости продолжить процесс сушки использованием неотапливаемых SpeedVac. Восстановление ИП 7 значительно сокращается, если образцы полностью высохнуть, поэтому прекращать процесс сушки, когда образцы достигают объема 100-300 мкл.

4. Определение IP 7 концентрации и чистоты.

  1. Используйте 2-5 мкл восстановленного ИП 7 образца для работы на PAGE гель, как и в разделах 2.2-2.5. Загрузите несколько разведений ИП 6 (0,5 т., 1, 2, 4 нмоль) в стандартной концентрации и 4 нмоль Поли-Р маркером. После запуска гель, визуализировать инозитол изоформ пирофосфат окрашиванием и де-окрашивание весь гель с толуидиновым синим решение, согласно процедуре, описанной в разделе 3.2 (рис. 2А).
  2. После Толуидин окрашивания, концентрация может быть определена путем сканирования геля и сравнение различий в интенсивности между IP-6 и IP-7 с помощью обработки изображений, такие как изображения-J, как показано на рисунке 2Б.

5. Представитель Результаты:

Препаративного ферментативного превращения IP 6 до 7 с помощью IP-IP ферменты 6 К1 и VIP1 можно легко разрешить с помощью PAGE анализа (рис. 1). Загрузка IP-6, как размер контроля совместно с Толуидин окрашивания геля Синий позволяет идентифицировать pyrophosphorylated производные, так как они работают медленнее, в зависимости от количества фосфатных групп, присутствующих на инозитол кольцо. Процедура, описанная выше, позволяет легко очистки IP 7. Анализ очищенной инозитол пирофосфат за страницей показал чистоту нашего IP-7 (рис. 2а). Интересно, что 1/3PP-IP 5 изомер ИП 7 продуктом VIP1 мигрирует немного медленнее, чем 5PP-IP 5 изомер ИП 7, порожденный IP 6 К1. Использование IP 6 стандартов разрешения легко количественная концентрация очищенного IP-7 (рис. 2Б). Перед использованием IP-7 для дальнейших экспериментов, его биологическая активность может быть оценен
(Рис. 3). 5PP-IP 5 инкубируют с VIP1 и с ИП 7 фосфатазы DDP1 (diphosphoinositol полифосфат phosphohydrolase). Регулярно, очищенный ИП 7 преобразуется в IP-8, VIP1 и ИП 6 по DDP1 (рис. 3).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Толуидин окрашивание СТРАНИЦА и выделение IP-7-ми полосный часть геля, содержащего стандартные (IP-6) был вырезан и окрашивали толуидин синий раствор. Три полосы представляют (сверху вниз) IP-7, ИП 6 и АТФ. Окрашенных часть геля затем выравнивается с остальными геля. Это позволяет локализация часть геля, содержащего IP-7, которые затем можно вырезать и очищенные (пунктирная коробка).

Рисунок 2
Рисунок 2: СТРАНИЦА анализ IP реакции 6 К1 и VIP1 продукции. ) Анализ IP-6 (4, 2, 1, 0,5 нмоль) по толуидиновым синим окрашивания был использован для того, чтобы определить IP 7 Концентрация очищенного от обоих ИП 6 К1 (5PP-IP 5) и VIP1 (1/3PP-IP 5) реакций. B) анализ Scatter заговор с целью определения концентрации очищенных IP 7. Концентрации определялись по интенсивности полосы, рассчитанной с использованием программного обеспечения ImageJ, по сравнению с заранее определенным количеством IP-6. X-ось представляет интенсивность, Y-ось представляет концентрации выражены в нмоль.

Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ ИП 7 биологическую активность Для определения качества очищенной ИП 7 мы инкубировали 5PP-IP 5 (ИП 6 К1 порожденных IP-7) с VIP1 или с ИП 7 фосфатазы DDP1, а затем решил реакция на странице. DAPI и Толуидин окрашивание показало, ожидается производство IP-8, VIP1 и преобразование IP-7 по IP-6, DDP1.

Обсуждение

Использование инозитол пирофосфата в биохимии сильно ограничена коммерческой отсутствия таких соединений и низкой чувствительности существующих методов обнаружения. Сочетание PAGE, который позволяет разделение молекул, имеющих разное количество фосфатных групп, и толуидиновым синим (рис. 1), метахроматическая краситель, который связывается с фосфатными группами, позволяет легко обнаружения инозитол изоформ pyrophoshate открывая новые направления исследований 20.

Описано использование технологии СТРАНИЦА, чтобы очистить инозитол продуктов пирофосфат ферментативной реакции осуществляется outby либо ИП 6 K1 или VIP1 это простой, экономичный и надежный метод, который позволяет для производства большого количества высоких IP качества 7. Описанный выше метод не ограничивается простой очистки IP-7, но незначительные изменения описанного протокола может позволить очистки различный диапазон инозитол пирофосфаты. Высшее фосфорилированных инозитол изоформ пирофосфат, содержащие более восьми фосфатные группы могут быть обнаружены с помощью IP-7 или различное количество IP-6 в качестве подложки 20,6. Эти инозитол пирофосфаты могут быть обнаружены путем увеличения длины Процедура окраски, а затем очищенный (раздел 3.2). Более того, использование IP-5 в качестве субстрата для ферментативной реакции позволит очистки PP-IP-5 и других инозитол пирофосфаты содержащие гидроксильные группы по инозитол кольцо.

В заключение этого нетребовательного метод позволяет надежной очистки миллиграмм количествах инозитол пирофосфаты с широко доступных инструментов, тем самым открывая новые перспективы для этой захватывающей области исследований.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим А. Риччио за полезные комментарии и прочитать рукопись. Эта работа была поддержана Советом по медицинским исследованиям (MRC) финансирования в отдел клеточной биологии и по правам пограничной науки Программа Грант (RGP0048/2009-C).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге
Фитиновой кислоты (IP-6) Sigma-Aldrich P8810
Поли-Р (гексаметафосфат натрия) Sigma-Aldrich P8510
АТФ-Mg 2 + соль Sigma-Aldrich A9187
OrangeG Sigma-Aldrich O3756
Фосфокреатина (ПЦР) Sigma-Aldrich P7936
CreatinePhospho киназы (КФК) Sigma-Aldrich C3755
GST-VIP1 17 17
Его-IP6K1 18 18
Его-Ddp1 Доступный в лаборатории Доступный в лаборатории
Акриламид: бис-акриламид 19:1 (40%) Flowgen H16972
Персульфата аммония (APS) Sigma-Aldrich A9164
Трис / Борат / EDTA (КЭ) Sigma-Aldrich T 9060
Temed BDH 43083G
Толуидиновым синим Sigma-Aldrich 198161
SpeedVac Христос 100218
Гель аппарата Hoefer SE600
Вакуумный коллектор Христос Альфа 2-4
Вакуум-насос ПРО Greiffenberger 4EKF63CX

Ссылки

  1. Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
  2. Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
  3. Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
  4. Shears, S. B. Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers. Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).
  5. Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
  6. Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
  7. Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
  8. Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
  9. Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
  10. Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
  11. York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
  12. Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
  13. Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
  14. Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
  15. Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
  16. Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
  17. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
  18. Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
  19. Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).

Перепечатки и разрешения

Теги

ИП6-киназаполиакриламидный гель-электрофорезферментативные реакциивыделение ИП7циклы дегидратации-гидратацииокрашивание толуидиновым синиманализ ПАГЭполучение ИП8биологическая активность
Подготовка Качество Инозитол пирофосфаты
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.