Стандартизированные Подготовка одноклеточных суспензий от мыши легочной ткани использованием gentleMACS диссоциатор
2 июля 2009 г.
Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для агитации ткани для получения большого количества жизнеспособных, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на легочной ткани объясняется.
В этом видеопротоколе вы увидите, как диссоциировать легочную ткань взрослой мыши с помощью щадящего максимума после диссоциации легочной ткани. В присутствии коллагеназы d и ДНК одноклеточные суспензии фильтруют с помощью центрифуги для клеточного фильтра 70 микрон и суспензируют для дальнейшего применения. Привет, меня зовут Мелани Млу из компании Mil Biotech в Германии.
Сегодня я покажу вам воспроизводимую и автоматизированную процедуру получения суспензии одной клетки из легочной ткани мыши с использованием диссоциации GenX. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для приготовления суспензий одиночных клеток для получения лейкоцитов или эндотелиальных клеток. Итак, приступим.
Прежде чем мы начнем работу над протоколом, необходимо подготовить и иметь под рукой несколько стандартных решений. Во-первых, нам понадобится буфер Hebes. Во-вторых, раствор коллагеназы D, содержащий 100 мг на миллилитр фермента и буфер гебеса.
В-третьих, раствор дазы один, содержащий 20 000 единиц на миллилитр дазы. Наконец, два распространенных решения для буферизации. Типичный буфер PBS с pH 7,2 и буфер PEB, полученный из промывочного раствора AutoMax и стокового раствора BSA.
Мы начинаем наш протокол с вскрытия легкого, полученного от шести-семинедельной самки мыши, прошедшей биопсию. Убедитесь, что в легком нет прилегающих органов, таких как сердце и тимус, эфферентные и афферентные кровеносные сосуды, трахея и соединительные ткани. Промойте ткань в чашке Петри, содержащей PBS, чтобы удалить эритроциты.
Как правило, легкое мыши в этом возрасте весит от 110 до 150 миллиграммов. Если вы планируете ассоциировать легкие от старых животных или других линий мышей, взвесьте ткань и буфер. На одну пробирку можно диссоциировать не более 450 миллиграммов ткани.
Перенесите легочную ткань в щадящую трубку max C, загруженную 4,9 миллилитрами буфера heis. Добавьте 100 микролитров раствора коллагеназы D до конечной концентрации два миллиграмм на миллилитр в легочную ткань и буферизуйте. Теперь 10 микролитров даже.
Один раствор для более чем 150 миллиграмм ткани. Добавьте 20 микролитров дазы на один раствор. Убедитесь, что С-образная трубка плотно закрыта, и поместите ее вверх дном на мягкий максимальный диск.
Убедитесь, что ткань расположена между ротором и статором. Выберите программу легких и запустите ее, нажав кнопку запуска по окончании программы. Извлеките С-образную трубку из инструмента и инкубируйте образец в течение 30 минут.
В инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия во время инкубации трубку следует вращать с помощью вращателя пробирки max mix или вручную каждые пять минут. После инкубации верните С-образную трубку в щадящий максимальный ассоциатор и запустите вторую программу легких. Во время выполнения программы подготовьте 50-миллилитровую трубку для сбора отфильтрованных клеток, заменив колпачок на сетчатый сетчатый фильтр 70 микрометров. После завершения диссоциированной программы, в зависимости от распределения материала образца в пробирке, вы можете захотеть кратковременно центрифугировать пробирку для концентрации материала образца.
Диссоциированные клетки могут быть удалены из трубки путем пипетирования через герметичный колпачок перегородки С-трубки. С помощью подходящего наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров клеточная суспензия наносится на клеточный фильтр для удаления более крупных частиц или агрегатов. После того, как раствор стечет, промойте сетчатое фильтр, добавив еще пять миллилитров комнатной температуры и буфер для гранулирования отфильтрованных клеток.
Центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 300 GS в течение 10 минут. Теперь аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в желаемом объеме комнатной температуры. Буфер PEB.
Не сцеживайте надосадочную жидкость. Теперь вы можете перейти к своему нижестоящему приложению. Диссоциация легочной ткани мыши с помощью этой процедуры дает высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток.
Полученные суспензии одиночных клеток окрашивали CD 45 PE как CD 1 46 FITC или CD 31 FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии. На этом графике показано обогащение дендритных клеток с использованием микрогранул CD 11 C, минимаксного сепаратора и двух колонок MS. Хорошо. Я только что показал вам, как получить суспензию одиночных клеток из легочной ткани мыши стандартизированным способом, используя щадящую диссоциацию смеси и С-трубки.
Этот метод позволяет эффективно и генетически диссоциировать ткани. При проведении этой процедуры важно правильно рассекать легкое и обрабатывать ткани сразу после вскрытия. Полученные суспензии одиночных клеток затем могут быть использованы для дальнейших экспериментов.
Например, магнитное мечение клеток, а затем разделение лейкоцитов или эндотелиальных клеток. Ладно, вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видеопротоколе демонстрируется метод диссоциации тканей легких взрослых мышей с использованием диссоциатора gentleMACS. Эта процедура разработана для получения большого количества жизнеспособных клеток, пригодных для культивирования и дальнейшего использования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы диссоциации клеток
- Приготовление суспензии одиночных клеток
- Анализ тканей легкого мыши
Теоретическая часть
- Диссоциация клеток из тканей требует соблюдения определенных параметров.
- Диссоциатор gentleMACS обеспечивает оптимизированный протокол.
- В процессе диссоциации используются коллагеназа D и DNase.
- Фильтрованные клеточные суспензии подготавливаются для дальнейшего применения.
Цель исследования
- Продемонстрировать воспроизводимый метод приготовления суспензий из отдельных клеток.
- Способствовать изучению лейкоцитов и эндотелиальных клеток.
- Представить практический протокол для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Использование диссоциатора gentleMACS для перемешивания ткани.
- Применение коллагеназы D и ДНказы в процессе диссоциации.
- Фильтрация клеточных суспензий через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм.
- Центрифугирование и суспендирование клеток для дальнейшего использования.
Основные результаты
- Успешная диссоциация тканей легкого мыши до состояния суспензии одиночных клеток.
- Получение большого объема жизнеспособных cultured-клеток.
- Протокол продемонстрировал воспроизводимость и эффективность.
- Подготовленный материал подходит для последующих приложений.
Выводы
- Диссоциатор gentleMACS эффективен для диссоциации тканей легкого.
- Этот метод может быть применен к различным типам тканей.
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследователей, изучающих ткани легкого.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стандартизированная диссоциация тканей является критически важным предварительным этапом в исследованиях в области иммунологии и биологии сосудов, обеспечивающим воспроизводимую подготовку суспензий первичных клеток для последующего анализа. Диссоциатор gentleMACS обеспечивает автоматизированный, щадящий и масштабируемый метод получения суспензий одиночных клеток с высокой жизнеспособностью из тканей легкого мыши, обеспечивая стабильный исходный материал для проточной цитометрии, сортинга клеток и молекулярного профилирования. Эта возможность повышает достоверность прогнозов в исследованиях по валидации мишеней за счет снижения вариабельности выхода и жизнеспособности клеток в различных экспериментах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать популяции лейкоцитов и эндотелиальных клеток в легочной ткани для проверки целевых гипотез.
- Практическая ценность: снижает вариативность ручной обработки тканей, повышая воспроизводимость результатов в разных лабораториях и в разные временные промежутки.
- Прогностическая ценность: обеспечивает стабильный ввод клеточного материала для проточной цитометрии и сортировки, что повышает достоверность результатов фенотипического скрининга.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать отфильтрованные суспензии без клеточного детрита, подходящие для окрашивания антителами и проведения проточных анализов.
- Практическая ценность: стандартизированное ферментативное переваривание и механическая диссоциация обеспечивают воспроизводимость выхода клеток от серии к серии.
- Готовность к анализу: позволяет создавать суспензии, совместимые с последующими этапами, такими как магнитное мечение и сепарация клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает релевантную для заболевания систему изучения динамики иммунных и сосудистых клеток в легочной ткани.
- Поддержка доклинических моделей: Позволяет изолировать первичные клетки из легких мышей для механистического снижения рисков при определении терапевтических мишеней.
- Прогресс с учетом рисков: Надежная подготовка клеток обеспечивает стабильный анализ биомаркеров и функциональную валидацию в рамках доклинических рабочих процессов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Диссоциатор gentleMACS встраивается в рабочий процесс исследования в качестве стандартизированного этапа подготовки образцов между забором ткани и клеточным анализом, обеспечивая надежный переход от ткани ex vivo к отдельным клеткам, готовым к анализу.
- Открытия в биологии: Обеспечивает выделение иммунных и стромальных клеток легких на основе гипотез для анализа сигнальных путей.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые клеточные суспензии для высокопроизводительного или проточного фенотипического скрининга иммуномодуляторов.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку методом проточной цитометрии (например, CD45+, CD31+) для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает модели легких мышей с исследованиями иммунных и эндотелиальных клеток человека посредством стандартизированной подготовки.
- Корпоративное повторное использование: Предустановленный протокол для легких в приборе позволяет использовать его в различных проектах по изучению воспаления, фиброза или инфекций легких.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Высокая жизнеспособность и чистота лейкоцитов и эндотелиальных клеток повышают качество данных в последующих приложениях.
- Операционная ценность: Автоматизация сокращает время непосредственной работы и вариативность диссоциации тканей, зависящую от пользователя.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе стабильных показателей выхода и жизнеспособности клеток.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней с учетом рисков, обеспечивая надежный ввод первичных клеток для валидации.
Особенности реализации
- Требуется подготовка в области асептического препарирования тканей и работы с ферментами.
- Зависит от наличия диссоциатора gentleMACS с программой для легких и соответствующих С-пробирок.
- Необходимо стандартизировать концентрации ферментов (коллагеназы D, ДНКазы) и условия буфера для всех пользователей.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных линий мышей, возраста или моделей заболеваний, влияющих на плотность ткани.
- Метод ограничен тканями, совместимыми с ферментативной диссоциацией; для фиброзных или кальцинированных образцов могут потребоваться альтернативные механические методы.
