Стандартизированные Подготовка одноклеточных суспензий от мыши легочной ткани использованием gentleMACS диссоциатор

Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для агитации ткани для получения большого количества жизнеспособных, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на легочной ткани объясняется.

В этом видеопротоколе вы увидите, как диссоциировать легочную ткань взрослой мыши с помощью щадящего максимума после диссоциации легочной ткани. В присутствии коллагеназы d и ДНК одноклеточные суспензии фильтруют с помощью центрифуги для клеточного фильтра 70 микрон и суспензируют для дальнейшего применения. Привет, меня зовут Мелани Млу из компании Mil Biotech в Германии.

Сегодня я покажу вам воспроизводимую и автоматизированную процедуру получения суспензии одной клетки из легочной ткани мыши с использованием диссоциации GenX. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для приготовления суспензий одиночных клеток для получения лейкоцитов или эндотелиальных клеток. Итак, приступим.

Прежде чем мы начнем работу над протоколом, необходимо подготовить и иметь под рукой несколько стандартных решений. Во-первых, нам понадобится буфер Hebes. Во-вторых, раствор коллагеназы D, содержащий 100 мг на миллилитр фермента и буфер гебеса.

В-третьих, раствор дазы один, содержащий 20 000 единиц на миллилитр дазы. Наконец, два распространенных решения для буферизации. Типичный буфер PBS с pH 7,2 и буфер PEB, полученный из промывочного раствора AutoMax и стокового раствора BSA.

Мы начинаем наш протокол с вскрытия легкого, полученного от шести-семинедельной самки мыши, прошедшей биопсию. Убедитесь, что в легком нет прилегающих органов, таких как сердце и тимус, эфферентные и афферентные кровеносные сосуды, трахея и соединительные ткани. Промойте ткань в чашке Петри, содержащей PBS, чтобы удалить эритроциты.

Как правило, легкое мыши в этом возрасте весит от 110 до 150 миллиграммов. Если вы планируете ассоциировать легкие от старых животных или других линий мышей, взвесьте ткань и буфер. На одну пробирку можно диссоциировать не более 450 миллиграммов ткани.

Перенесите легочную ткань в щадящую трубку max C, загруженную 4,9 миллилитрами буфера heis. Добавьте 100 микролитров раствора коллагеназы D до конечной концентрации два миллиграмм на миллилитр в легочную ткань и буферизуйте. Теперь 10 микролитров даже.

Один раствор для более чем 150 миллиграмм ткани. Добавьте 20 микролитров дазы на один раствор. Убедитесь, что С-образная трубка плотно закрыта, и поместите ее вверх дном на мягкий максимальный диск.

Убедитесь, что ткань расположена между ротором и статором. Выберите программу легких и запустите ее, нажав кнопку запуска по окончании программы. Извлеките С-образную трубку из инструмента и инкубируйте образец в течение 30 минут.

В инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия во время инкубации трубку следует вращать с помощью вращателя пробирки max mix или вручную каждые пять минут. После инкубации верните С-образную трубку в щадящий максимальный ассоциатор и запустите вторую программу легких. Во время выполнения программы подготовьте 50-миллилитровую трубку для сбора отфильтрованных клеток, заменив колпачок на сетчатый сетчатый фильтр 70 микрометров. После завершения диссоциированной программы, в зависимости от распределения материала образца в пробирке, вы можете захотеть кратковременно центрифугировать пробирку для концентрации материала образца.

Диссоциированные клетки могут быть удалены из трубки путем пипетирования через герметичный колпачок перегородки С-трубки. С помощью подходящего наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров клеточная суспензия наносится на клеточный фильтр для удаления более крупных частиц или агрегатов. После того, как раствор стечет, промойте сетчатое фильтр, добавив еще пять миллилитров комнатной температуры и буфер для гранулирования отфильтрованных клеток.

Центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 300 GS в течение 10 минут. Теперь аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в желаемом объеме комнатной температуры. Буфер PEB.

Не сцеживайте надосадочную жидкость. Теперь вы можете перейти к своему нижестоящему приложению. Диссоциация легочной ткани мыши с помощью этой процедуры дает высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток.

Полученные суспензии одиночных клеток окрашивали CD 45 PE как CD 1 46 FITC или CD 31 FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии. На этом графике показано обогащение дендритных клеток с использованием микрогранул CD 11 C, минимаксного сепаратора и двух колонок MS. Хорошо. Я только что показал вам, как получить суспензию одиночных клеток из легочной ткани мыши стандартизированным способом, используя щадящую диссоциацию смеси и С-трубки.

Этот метод позволяет эффективно и генетически диссоциировать ткани. При проведении этой процедуры важно правильно рассекать легкое и обрабатывать ткани сразу после вскрытия. Полученные суспензии одиночных клеток затем могут быть использованы для дальнейших экспериментов.

Например, магнитное мечение клеток, а затем разделение лейкоцитов или эндотелиальных клеток. Ладно, вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.