Родился Нормализация для флуоресцентной оптической томографии для проекции изображений Всего Сердца
2 июня 2009 г.
Мы предлагаем Родился нормированный подход для оптической томографии Projection (BnOPT), который учитывает поглощения свойства отображаемого образцы для получения точных количественных и флуоресценции реконструкции томографических. Мы используем предложенный алгоритм для восстановления флуоресценции молекулярного зонда распределения в небольших органов животного.
Для выполнения нормализованной оптической проекционной томографии образец сначала фиксируют и встраивают в цилиндр со шнеком. Затем образец поворачивают вдоль вертикальной оси, а затем равномерно освещают с помощью возбуждающей длины волны, а пропускание измеряют с помощью подходящей оптики C, CD. Флуоресцентный сигнал на длине волны измеряется в режиме трансиллюминации.
Полученные флуоресцентные и абсорбционные изображения используются для определения нормализованного соотношения рожденных и реконструкции распределения флюорочетверов в образце. Здравствуйте, меня зовут Клаудия Наоне, и я работаю в Центрах системной биологии в Массачусетской больнице общего профиля Гарвардской медицинской школы. Меня зовут Даниэль Раки из Института биологической и медицинской визуализации Технического университета Мюнхена и Центра Аль Мюнхена.
Я Жизель Фидо. Я являюсь директором Experimental su Co здесь, в C-M-I-C-S-B, Массачусетской больнице общего профиля, Гарвардской медицинской школе. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации всего органа ex vivo в режиме реального времени с использованием нормализованного подхода Борна для оптической проекционной томографии.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения распределения флуоресцентных молекулярных зондов в полых органах. Итак, приступим. В этом видео будет объяснена процедура использования оптической проекционной томографии для визуализации подготовленных тканей или органов и сопроводительное видео.
Мы объясняем, как использовать эту систему для выполнения покадровой съемки развивающихся дрозофил. Метод трехмерной визуализации в оптической проекционной томографии требует уникального сочетания оптики и вращающегося столика. В этом сегменте видео будет подробно описана процедура визуализации.
Во-первых, первичный источник света служит источником как для измерений освещенности, так и для измерения поглощения, а для обеспечения флуоресцентного возбуждения при измерениях флуоресценции первичный источник света сначала фильтруется с помощью узкополосного интерференционного фильтра. Далее свет проходит через набор фильтров фиксированной и переменной нейтральной плотности. Они сочетаются с наличием автоматического затвора для контроля количества света на образце и поддержания его на достаточно низком уровне, чтобы предотвратить обесцвечивание фотографий.
Равномерное освещение образца достигается за счет использования расширителя луча и комбинированной линзы телескопа с рассеивателем. Наконец, оптические узкополосные интерференционные фильтры используются для оптической очистки источника возбуждения света. Образец погружают в раствор для очистки и удерживают на месте для визуализации в стеклянной трубке.
Образец вращается вдоль своей вертикальной оси с помощью высокоскоростного вращательного каскада с абсолютной точностью 0,05 градуса. Три отдельных ручных контроллера позволяют наклонять вертикальную ось образца и регулировать ее в ортогональной плоскости. Поглощающий сигнал регистрируется при транс-освещении и непосредственно обнаруживается ПЗС-камерой.
Флуоресцентный сигнал фильтруется через узкополосный интерференционный фильтр в сочетании с фильтром длинных частот, а затем собирается с помощью телецентрической линзы. Преимущество телеобъективов заключается в том, что они обладают уникальными функциями, которые делают их идеальными. Для оптической проекционной томографии.
Ключевым фактором является наличие ограничителя диафрагмы, расположенного внутри объектива в узле объектива в точке фокусировки объектива. Он гарантирует, что изображение будет распространяться параллельно оптической оси. Это устраняет искажения перспективы и обеспечивает одинаковое увеличение во многих фокальных плоскостях в пределах телецентрической глубины.
В следующем видеосюжете описана техника подготовки образцов. За этим последует методология, используемая для визуализации. Подготовка образца ткани или органа к томографической визуализации основана на обезвоживании образца на основе этанола, что позволяет избежать асимметричной усадки.
Этот процесс занимает много дней. В этом видео готовится мышиное сердце, но протокол может быть применен к любой ткани или органу. Мы продемонстрируем наш метод флуоресцентной визуализации с использованием сердца животного, перенесшего контролируемый инфаркт.
Другими словами, потеря кровоснабжения, приводящая к явному некрозу тканей заранее. Мышь была введена с помощью PRO с шестью 80 флуоресцентными датчиками, сообщающими об активности катепсина при заживлении. Миокард обезболить мышь для перфузии и экструзии сердца с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина, затем ввести 50 единиц гепарина внутрибрюшинно, чтобы предотвратить коагуляцию.
Через пять минут проведите продольную лапаротомию на животном, полностью находящемся под наркозом, чтобы удалить кровь. Сначала откройте левую почечную вену. Теперь медленно введите 20 миллилитров физиологического раствора в нижнюю полую вену.
Физиологический раствор вытесняет кровь после промывания всей крови под препарирующим микроскопом. Продолжайте использовать стандартные методы операции, чтобы открыть грудную клетку и удалить сердце. Теперь зафиксируйте сердце на восемь часов в 4% PFA при четырех градусах Цельсия.
С этого момента этапы подготовки тканей должны выполняться в темноте, чтобы избежать обесцвечивания любых флуоресцентных контрастных веществ или белков, нанесенных на ткань. Когда фиксация завершена, смойте PFA 15-минутным промыванием в PBS, затем очищенное сердце погружают в бассейн 0,8% арос. Как только арос высыхает, агарозу обрезают вокруг ткани, чтобы придать форму блока.
Затем обезвоживайте зашифрованное сердце с помощью пятиступенчатой серии: сначала замачивайте в 20% этаноле, затем постепенно увеличивая концентрацию этанола и, наконец, чистый этанол. Эта процедура обезвоживания помогает избежать асимметричной усадки образца. Первые четыре ванны в разбавленном этаноле должны проводиться в течение часа, а заключительное купание в 100% этаноле должно проводиться в течение не менее 10 часов.
После завершения обработки этанолом поместите образец в прозрачный раствор Мюррея до тех пор, пока образец не станет прозрачным, что варьируется от нескольких часов до нескольких дней. Этот очищающий раствор имитирует клеточную воду и индекс соответствует клеточным мембранам, тем самым делая ткань прозрачной. Этанол в минимальных следах может присутствовать в конце процесса очистки, что приводит к появлению нескольких артефактов в реконструкциях из-за термического движения спирта в самом растворе для очистки.
Чтобы избежать этой проблемы, рекомендуется провести второй цикл очистки. На это не должно уйти более четырех часов. После завершения образец готов к оптической проекции.
Томография с помощью компьютера. Реконструкция оптического поглощения при отсутствии рассеяния света может быть получена с помощью общего алгоритма обратной проекции радона с фильтрацией. Этот процесс аналогичен двухмерной рентгеновской компьютерной томографии.
Поместите блок аэроса в прозрачную камеру визуализации, заполненную раствором для очистки. Теперь установите камеру на сцене, подсветите образец собранным лучом для измерений возбуждения и пропускания. Выбор источника возбуждения основан на выбранном флуоресцентном белке или контрастном веществе для молекулярной визуализации.
Вертикальную ось образца удобно выровнять параллельно столбцу пикселей ПЗС. Поворачивайте образец на 360 проекций с угловым шагом в один градус, получайте изображения под каждым углом при транс-освещении как на поглощающей, так и на флуоресцентной длинах волн. Программное обеспечение, выполняющее съемку, автоматически управляет затвором на основном источнике света, чтобы избежать непрерывного освещения и уменьшить обесцвечивание образца фотографии.
Затвор особенно важен, когда требуется длительное время интеграции для создания 3D-реконструкции на основе данных поглощения. Просто используйте алгоритм обратной проекции радона с фильтром для 3D-реконструкции по флуоресцентным изображениям. Необходимо учитывать и другие вклады абсорбции, которые описаны в следующем видеофрагменте.
После выполнения шагов, необходимых для абсорбционной реконструкции, есть еще несколько шагов для завершения флуоресцентной реконструкции. Реконструкция оптической карты при отсутствии рассеяния света может быть получена с помощью общего алгоритма обратной проекции радона с фильтрацией. Процесс аналогичен двухмерной рентгеновской компьютерной томографии.
При реконструкции распределения флуоресценции. Изменяющееся пространственно зависимое поглощение делает неправильным использование обратного радона для обратного излучения, проецируя флуоресцентные изображения сильно влияет на распределение полученных флуоресцентных белков или флуоресцентных молекулярных зондов и его количественную способность. Каждый луч с длиной волны возбуждения Lambda X, который излучается из произвольной точки источника Xs, экспоненциально ослабевает при прохождении через визуализируемый объект.
После возбуждения флуорохрома, расположенного в положении X, излучение на длине волны излучения фильтруется и собирается пикселем ПЗС, расположенным в положении XD, с помощью системы линзирования Teleric Imaging Lensing. Хотя излучаемая флуоресценция не следует по той же траектории, что и луч возбуждения, интенсивность, зарегистрированная на каждом пикселе, приближается к проекции всех возбуждаемых флуорохромов вдоль всей фокальной зоны, соответствующей этому конкретному лучу возбуждения. Благодаря высокой телецентричности системы визуализируемый объект затем поворачивается на 360 градусов, и с помощью ПЗС-камеры регистрируются измерения с помощью детектора нескольких источников, UX на длине волны возбуждения и UFL на длине волны излучения.
Затем они объединяются в нормализованное поле рождения, определяемое как отношение этих двух. Реконструкцию распределения флюорохрома можно облегчить, написав прямую модель как для возбуждения, так и для распространения излучения света с помощью функции зеленого цвета, описывающей возбуждение. Распространение лучей следует простому закону Ламберта, где moo A — ранее определенное распределение оптического поглощения.
Интенсивность света UX, излучаемая источником в избыточном положении и измеренная детектором в положении XD на C.C, D, может быть записана как произведение зеленой функции с константой B, которая зависит от системы. Затем можно рассчитать точное распределение интенсивности возбуждающего света GX вдоль каждой траектории луча. Интенсивность флуоресценции UFL, регистрируемая на детекторе XD, которая стимулируется светом, испускаемым источником Xs, учитывает вклад всех терос, которые были возбуждены на пути луча от X к xd.
Прямая модель нашей задачи визуализации может быть записана как ub ub, где альфа включает в себя неизвестные константы, зависящие от системы. Затем прямая модель дискретизируется на предполагаемой сетке и выполняется инверсия для извлечения распределения флуорохрома, получения как пропускающего, так и флуоресцентного сигнала и использования обычного алгоритма обратной проекции для реконструкции выборки. Здесь показаны реконструкции с помощью просвечивающей и традиционной флуоресцентной оптической проекционной томографии.
Реконструкция одной плоскости сердца проявляется как в абсорбционной, так и во флуоресцентной проекции. Представлена нормализованная реконструкция, которая показывает разницу в распределении красителя в сердце. После нормализации мы только что показали вам, как быть установкой для оптической проекционной томографии и как удалить артефакты из-за оптического поглощения в реконструкциях для флуоресцентной томографии.
На самом деле очень важно помнить о том, что образец должен быть очищен, чтобы удалить вклад рассеянного света, но в то же время также важно сбалансировать процесс очистки, чтобы сохранить как можно больше флуоресцентного вклада. Еще одна вещь, которую очень важно помнить при использовании этого подхода, — это расчет нормализованного отношения костей, которое получается путем деления флуоресцентных изображений на абсорбционные. Вот и все.
Спасибо, что присоединились к нашему визуализированному эксперименту и удачи в ваших собственных экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен нормализованный подход Борна для оптической проекционной томографии (BnOPT), который повышает точность флуоресцентных томографических реконструкций за счет учета свойств поглощения образцов. Метод применяется для реконструкции распределения флуоресцентных молекулярных зондов в органах мелких животных.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Оптическое изображение
- Флуоресцентная томография
- Биомедицинское исследование
Фон
- Оптическая проекционная томография - техника, используемая для визуализации биологических образцов.
- Традиционные методы могут не учитывать свойства поглощения, что приводит к неточностям.
- Флуоресцентные молекулярные зондирования необходимы для визуализации биологических процессов.
- Улучшение методов реконструкции может повысить понимание функций органов.
Цель исследования
- Разработать метод, который точно реконструирует распределение флуоресценции.
- Учитывать характеристики поглощения биологических образцов.
- Повысить надежность исследования органов мелких животных.
Использованные методы
- Образцы фиксируются и встраиваются в цилиндр auger.
- Образцы вращаются и освещаются с волной длиной возбуждения.
- Флуоресцентные сигналы измеряются в режиме трансиллюминации.
- Нормализованное соотношение Борна рассчитывается для помощи в реконструкции.
Основные результаты
- Предложенный метод BnOPT обеспечивает точные флуоресцентные реконструкции.
- Он эффективно учитывает свойства поглощения образцов.
- Метод успешно визуализирует распределение зондов в органах мелких животных.
- Результаты демонстрируют улучшенное качество изображений по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Подход BnOPT повышает точность флуоресцентной томографии.
- Он предлагает надежный метод для исследования биологических образцов in vivo.
- Эта техника может продвинуть исследования в области биомедицинского исследования и анализа функций органов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
