Родился Нормализация для флуоресцентной оптической томографии для проекции изображений Всего Сердца
2 июня 2009 г.
Мы предлагаем Родился нормированный подход для оптической томографии Projection (BnOPT), который учитывает поглощения свойства отображаемого образцы для получения точных количественных и флуоресценции реконструкции томографических. Мы используем предложенный алгоритм для восстановления флуоресценции молекулярного зонда распределения в небольших органов животного.
Для проведения нормализованной born-оптической проекционной томографии образец сначала фиксируют и заключают в цилиндр из агарозы. Затем образец вращают вокруг вертикальной оси и равномерно освещают светом с длиной волны возбуждения, после чего измеряют пропускание с помощью подходящей оптики C, CD. Флуоресцентный сигнал на заданной длине волны измеряют в режиме трансмиссионного освещения.
Полученные изображения флуоресценции и поглощения используются для определения нормализованного соотношения Борна и реконструкции распределения флуорофоров внутри образца. Здравствуйте, меня зовут Клаудия Наоне, я работаю в Центрах системной биологии при больнице общего профиля Массачусетса, Гарвардской медицинской школе. Я Даниэль Раки из Института биологической и медицинской визуализации при Мюнхенском техническом университете и AI Center Munich.
Меня зовут Жизель Фидо. Я директор отдела экспериментальной хирургии здесь, в C-M-I-C-S-B, Массачусетском общем госпитале Гарвардской медицинской школы. Сегодня мы продемонстрируем процедуру прижизненной визуализации целого органа ex vivo в режиме реального времени с использованием метода нормализации Борна для оптической проекционной томографии.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения распределения флуоресцентных молекулярных зондов в полых органах. Итак, приступим. В данном видео и в сопровождающем его ролике будет описана процедура использования оптической проекционной томографии для получения изображений подготовленных тканей или органов.
Мы объясним, как использовать данную систему для проведения таймлапс-визуализации развивающихся особей drosophila. Метод трехмерной визуализации, такой как оптическая проекционная томография, требует уникального сочетания оптики и вращающегося столика. В данном сегменте видео будет подробно описана процедура визуализации.
Для начала отметим, что основной источник света используется как для освещения, так и для проведения измерений абсорбции; для обеспечения флуоресцентного возбуждения при измерениях флуоресценции свет от основного источника сначала проходит через узкополосный интерференционный фильтр. Затем свет проходит через набор фиксированных и переменных фильтров нейтральной плотности. В сочетании с автоматическим затвором они позволяют контролировать количество света, попадающего на образец, и поддерживать его на достаточно низком уровне для предотвращения фотообесцвечивания.
Равномерное освещение образца достигается за счет использования расширителя пучка и комбинированной линзы телескопа Глана с диффузорной линзой. Наконец, для оптической очистки света источника возбуждения используются узкополосные интерференционные фильтры. Образец погружают в раствор для просветления и фиксируют в стеклянной трубке для проведения визуализации.
Образец вращается вокруг своей вертикальной оси с помощью высокоскоростного поворотного столика с абсолютной точностью 0,05 градуса. Три отдельных ручных контроллера позволяют наклонять вертикальную ось образца и регулировать ее в ортогональной плоскости. Сигнал поглощения регистрируется при трансмиссионном освещении и детектируется непосредственно ПЗС-камерой.
Флуоресцентный сигнал проходит через узкополосный интерференционный фильтр в сочетании с длинноволновым фильтром, после чего собирается телецентрическим объективом. Телецентрические объективы обладают уникальными характеристиками, которые делают их идеальными для оптической проекционной томографии.
Ключевым является наличие диафрагмы, расположенной внутри линзового блока в фокусе линзы. Это гарантирует, что изображение будет распространяться параллельно оптической оси. Таким образом устраняется перспективное искажение и обеспечивается одинаковое увеличение во многих фокальных плоскостях в пределах глубины телецентричности.
В следующем видеофрагменте описывается методика подготовки образцов. После этого будет представлена методология, используемая для визуализации. Подготовка тканей или органов образца для томографической визуализации основана на обезвоживании образца с использованием этанола, что позволяет избежать асимметричной усадки.
Завершение этого процесса занимает несколько дней. В данном видео демонстрируется подготовка сердца мыши, однако данный протокол можно применять к любой ткани или органу. Мы продемонстрируем наш метод флуоресцентной визуализации, используя сердце животного с контролируемым инфарктом.
Другими словами, нарушение кровоснабжения, приводящее к выраженному некрозу тканей на предварительном этапе. Мыши ввели про-сенсор 680 inact — флуоресцентный сенсор для мониторинга активности катепсина в заживающем миокарде. Анестезируйте мышь для проведения перфузии и извлечения сердца путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина. Затем введите 50 единиц гепарина внутрибрюшинно для предотвращения коагуляции.
Через пять минут проведите продольную лапаротомию полностью анестезированного животного для удаления крови. Сначала вскройте левую почечную вену. Затем медленно введите 20 milliliters физиологического раствора в нижнюю полую вену.
После вымывания всей крови под диссекционным микроскопом ее замещают физиологическим раствором. Далее, используя стандартные методы, вскройте грудную клетку и извлеките сердце. После этого зафиксируйте сердце в 4% PFA при температуре четырех градусов Цельсия в течение восьми часов.
С этого момента все этапы подготовки ткани необходимо проводить в темноте, чтобы избежать выцветания любых флуоресцентных контрастных веществ или белков, нанесенных на ткань. После завершения фиксации удалите PFA, промывая образец в PBS в течение 15 минут; затем очищенное сердце заключают в блок 0,8% агарозы. После высыхания агарозы ее обрезают вокруг ткани, чтобы придать блоку форму куба.
Затем проведите обезвоживание зафиксированного сердца путем пятиступенчатой серии обработок: сначала путем замачивания в 20%Ethanol, затем в растворах этанола с постепенно увеличивающейся концентрацией и, наконец, в чистом этаноле. Эта процедура обезвоживания помогает избежать асимметричной усадки образца. Первые четыре стадии в разбавленном этаноле должны длиться по одному часу, а финальная стадия в 100%Ethanol — не менее 10 часов.
После завершения обработки этанолом поместите образец в прозрачный раствор Мюррея до тех пор, пока образец не станет прозрачным; это время может варьироваться от нескольких часов до нескольких дней. Данный просветляющий раствор имитирует клеточную воду и соответствует по показателю преломления клеточным мембранам, тем самым делая ткань прозрачной. По окончании процесса просветления могут остаться минимальные следы этанола, что приводит к возникновению ряда артефактов при реконструкции из-за теплового движения спирта внутри самого просветляющего раствора.
Чтобы избежать этой проблемы, рекомендуется провести второй цикл просветления. Это должно занять не более четырех часов. После завершения этого этапа образец готов к оптической проекции.
Томография с помощью компьютера. Реконструкция оптического поглощения в отсутствие рассеяния света может быть получена с использованием стандартного алгоритма фильтрованной обратной проекции Радона. Этот процесс аналогичен двумерной рентгеновской компьютерной томографии.
Поместите блок аэрозолей в прозральную камеру для визуализации, заполненную раствором для просветления. Затем установите камеру на предметный столик и осветите образец коллимированным пучком для проведения измерений возбуждения и пропускания. Выбор источника возбуждения зависит от выбранного флуоресцентного белка или молекулярного контрастного агента для визуализации.
Удобно ориентировать вертикальную ось образца параллельно столбцу пикселей ПЗС-матрицы. Поверните образец на 360 проекций с шагом в один градус, регистрируя изображения при каждом угле в режиме трансмиссионного освещения как на длине волны поглощения, так и на длине волны флуоресценции. Программное обеспечение, управляющее процессом сбора данных, автоматически контролирует затвор основного источника света, чтобы избежать непрерывного освещения и снизить фотообесцвечивание образца.
Затвор особенно важен, когда для создания 3D-реконструкции на основе данных абсорбции требуются длительные времена интегрирования. Для 3D-реконструкции по флуоресцентным изображениям достаточно использовать алгоритм обратной проекции Радона с фильтрацией. Необходимо также учитывать другие вклады абсорбции, которые описываются в следующем сегменте видео.
После выполнения этапов, необходимых для абсорбционной реконструкции, для завершения флуоресцентной реконструкции требуется выполнить еще несколько шагов. Реконструкция оптической карты в отсутствие рассеяния света может быть получена с помощью стандартного алгоритма фильтрованной обратной проекции Радона. Этот процесс аналогичен двумерной рентгеновской компьютерной томографии.
При реконструкции распределения флуоресценции переменное пространственно-зависимое поглощение делает использование обратного преобразования Радона для обратного проецирования изображений флуоресценции некорректным, что серьезно влияет на полученные распределения флуоресцентного белка или флуоресцентного молекулярного зонда и возможность их количественной оценки. Каждый луч на длине волны возбуждения Lambda X, излучаемый из произвольного положения источника Xs, затухает экспоненциально при прохождении через исследуемый объект.
После возбуждения флуорохрома, находящегося в позиции X, излучение на длине волны эмиссии фильтруется и регистрируется пикселем ПЗС-матрицы в позиции XD с помощью системы линз для телецентрического формирования изображения. Хотя испускаемая флуоресценция не следует по тому же пути, что и луч возбуждения, интенсивность, зафиксированная каждым пикселем, примерно соответствует проекции всех флуорохромов, возбужденных вдоль всей фокальной зоны, соответствующей данному конкретному лучу возбуждения. Благодаря высокой телецентричности системы, исследуемый объект затем поворачивается на 360 градусов, и с помощью ПЗС-камеры регистрируются многочисленные измерения «источник-детектор»: UX на длине волны возбуждения и UFL на длине волны эмиссии.
Затем они объединяются в нормализованное поле born UB, определенное как отношение этих двух величин. Реконструкция распределения флуорохромов может быть облегчена путем записи прямой модели для распространения как возбуждающего, так и эмиссионного света, где функция Грина описывает возбуждение. Распространение лучей следует простому закону Бугера — Ламберта — Бера, где moo A представляет собой ранее определенное распределение оптического поглощения.
Интенсивность света UX, излучаемая источником в положении excess и регистрируемая детектором в положении XD на C.C, D, может быть представлена как произведение функции Грина на константу B, зависящую от системы. После этого может быть рассчитано точное распределение интенсивности возбуждающего света GX вдоль каждого луча. Интенсивность флуоресценции UFL, регистрируемая детектором XD и стимулируемая светом, излучаемым источником Xs, учитывает вклад всех флуорофоров, возбужденных вдоль пути луча от X до xd.
Прямая модель нашей задачи визуализации может быть записана как ub ub, где alpha включает в себя неизвестные константы, зависящие от системы. Затем прямая модель дискретизируется на предполагаемой сетке, и выполняется инверсия для извлечения распределения флуорохрома, получения как трансмиссионного, так и флуоресцентного сигналов, а также использования традиционного алгоритма обратной проекции для реконструкции образца. Здесь представлены результаты реконструкции методом трансмиссионной и традиционной флуоресцентной оптической проекционной томографии.
Реконструкция одной плоскости сердца представлена в режимах абсорбции и флуоресценции. Представлена нормализованная реконструкция Борна, демонстрирующая различие в распределении красителя внутри сердца. После нормализации мы продемонстрировали вам принципы настройки системы для оптической проекционной томографии и способы устранения артефактов, вызванных оптическим поглощением, в реконструкциях для флуоресцентной томографии.
На самом деле очень важно помнить о необходимости проведения просветления образца для устранения влияния рассеянного света, но в то же время важно сбалансировать процесс просветления, чтобы максимально сохранить вклад флуоресценции. Еще один важный момент при использовании данного подхода — расчет костного нормированного соотношения, которое получается путем деления изображений флуоресценции на изображения абсорбции. На этом всё.
Благодарим вас за просмотр нашего визуализированного эксперимента и желаем успехов в ваших собственных исследованиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен подход к оптической проекционной томографии с нормализацией по Борну (BnOPT), который повышает точность реконструкции флуоресцентных томограмм за счет учета абсорбционных свойств образцов. Данный метод применяется для реконструкции распределения флуоресцентных молекулярных зондов в органах мелких лабораторных животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Оптическая визуализация
- Флуоресцентная томография
- Биомедицинская визуализация
Теоретические основы
- Оптическая проекционная томография — это метод, используемый для получения изображений биологических образцов.
- Традиционные методы могут не учитывать свойства поглощения, что приводит к погрешностям.
- Флуоресцентные молекулярные зонды необходимы для визуализации биологических процессов.
- Совершенствование методов реконструкции может улучшить понимание функций органов.
Цель исследования
- Разработка метода, обеспечивающего точную реконструкцию распределения флуоресценции.
- Учет характеристик поглощения биологических образцов.
- Повышение достоверности визуализации органов мелких животных.
Используемые методы
- Образцы фиксируют и заключают в цилиндр из агарозы.
- Образцы вращают и освещают светом с длиной волны возбуждения.
- Флуоресцентные сигналы измеряют в режиме трансмиссионного освещения.
- Для облегчения реконструкции рассчитывают нормализованное соотношение Борна.
Основные результаты
- Предложенный метод BnOPT обеспечивает точную реконструкцию флуоресценции.
- Он эффективно учитывает абсорбирующие свойства образцов.
- Метод позволяет успешно визуализировать распределение зондов в органах мелких животных.
- Результаты демонстрируют улучшенное качество визуализации по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Метод BnOPT повышает точность флуоресцентной томографии.
- Он представляет собой надежный способ изучения биологических образцов in vivo.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области биомедицинской визуализации и анализа функций органов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точный количественный анализ флуоресценции при визуализации целых органов имеет решающее значение для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних этапах разработки лекарственных препаратов. Метод Born-нормированной оптической проекционной томографии (BnOPT) позволяет устранить артефакты, вызванные поглощением, которые искажают интерпретацию флуоресцентного сигнала, тем самым повышая достоверность прогнозов при анализе распределения зондов. Эта возможность обеспечивает надежную оценку взаимодействия с терапевтической мишенью и модуляции сигнальных путей в системах, релевантных для изучаемых заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, обеспечивая получение распределения флуоресценции молекулярных зондов в неповрежденных органах без артефактов.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством количественной визуализации активности зондов в патофизиологических условиях, таких как модели инфаркта.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность показателей модуляции мишеней за счет коррекции пространственно-изменяющегося поглощения, которое в противном случае искажает количественную оценку.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка прозрачных стабильных биологических образцов, подходящих для лонгитюдных исследований визуализации, требующих воспроизводимых показателей флуоресценции.
- Практическая ценность: Стандартизация подготовки образцов путем дегидратации этанолом и просветления по методу Мюррея, что минимизирует асимметричную усадку и вариабельность сигнала.
- Готовность анализа: Получение количественных наборов данных по абсорбции и флуоресценции, позволяющих проводить расчеты нормализованных отношений, необходимых для надежной интерпретации сигнала.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: облегчает переход от этапа открытия к доклинической валидации за счет сохранения целостности флуоресцентного сигнала в ходе длительных сессий просветления и визуализации.
- Снижение механических рисков: уменьшает вероятность ошибочных выводов о распределении зонда за счет учета эффектов поглощения, которые могут имитировать или маскировать истинные биологические сигналы.
- Достоверность модели заболевания: метод применен к сердцам мышей с инфарктом для визуализации зондов активности протеаз, что позволяет оценить специфичность механизма действия мишени в условиях соответствующей патофизиологии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод BnOPT интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств после скрининга связывания с мишенью, предоставляя количественные 3D-карты флуоресценции, которые служат основой для оптимизации соединений-лидеров и отбора доклинических кандидатов.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез, обеспечивая возможность долгосрочного отслеживания распределения флуоресцентных зондов в целостных органах без деградации сигнала из-за артефактов поглощения.
- Скрининг: позволяет получать очищенные образцы тканей, готовые к анализу, с использованием стандартизированных протоколов подготовки, что обеспечивает воспроизводимость между экспериментальными сериями.
- Аналитика: выводит нормализованные коэффициенты Борна (флуоресценция/поглощение), которые отделяют истинные сигналы флуоресценции от факторов поглощения, что позволяет проводить точные межгрупповые сравнения.
- Трансляционные исследования: связывает метод с доклиническими исследованиями за счет сохранения сигнала флуоресценции в очищенных образцах с течением времени, что позволяет соотнести активность зонда с функциональными результатами.
- Корпоративное повторное использование: создает повторно используемую платформу визуализации для количественного анализа флуоресценции целого органа, применимую в различных терапевтических областях и для разных классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишеней за счет устранения ошибок количественного анализа, обусловленных абсорбцией, в флуоресцентной томографии.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов просветления (раствор Маррея) и дегидратации, которые сводят к минимуму вариативность образцов.
- Стратегическая ценность: Повышает надежность принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем получения точных пространственных данных об активности молекулярных зондов в органах, имеющих значение для заболевания.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней с учетом рисков, сокращая количество ложноположительных или ложноотрицательных выводов, полученных на основе нескорректированных данных визуализации.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области оптической визуализации, просветления образцов и количественной оценки флуоресценции во избежание появления артефактов, вызванных остаточным этанолом или неполным просветлением.
- Результативность зависит от использования телецентрических оптических систем, поворотного стола с точностью 0,05° и синхронизированной фильтрации возбуждения/эмиссии для обеспечения достоверности сигнала.
- Необходима межлабораторная стандартизация продолжительности просветления и градиентов этанола для обеспечения согласованного выравнивания показателей преломления и сохранения флуоресценции.
- Адаптация к органам различных размеров и плотности может потребовать корректировки времени просветления и интенсивности освещения для предотвращения потери сигнала или выгорания флуорофоров.
- Практическое ограничение: чрезмерно длительное просветление сверх оптимального времени создает риск деградации флуоресценции, что требует соблюдения временных циклов просветления, описанных в протоколе.
