Инженерно Cell-проницаемой белка

Манипулирование клеточными функциями может быть достигнуто с помощью классических подходов к трансфекции ДНК или вирусной трансдукции в течение последних 15 лет. Появился еще один метод. Биологически активный белок, трансдукционирующий белок, может быть непосредственно доставлен в клетки млекопитающих с помощью небольших пептидов, слитых с интересующим белком, что способствует их поглощению клетками.

Поскольку ДНК не используется, риск агенезии при физической нагрузке предотвращается. В отличие от вышеупомянутых классических методов. Трансдукция белка позволяет доставлять белки титруемым образом.

Кроме того, могут модулироваться малые клеточные популяции, а также неделящиеся клетки, такие как постмитотические нейроны. Для эффективной экспрессии рекомбинантного белка мы рекомендуем использовать векторную систему Paciz. Это модульная векторная система, состоящая из концевого терминала и варианта С-терминала.

Оба вектора позволяют легко вставлять интересующий вас ген для средств очистки. Интегрирована метка гистидина, а также домен трансдукции белка. В нашем случае прикосновение вируса HI способствует клеточному поглощению для клеточного распределения.

Сигнал ядерной локализации завершает вектор по причинам управления: термоядерные метки могут быть просто удалены. Кроме того, расположение этих меток может оказывать существенное влияние на свойства гибридных белков. Влияние на урожайность и чистоту, а также на продаваемость и биологическую функцию не предсказуемо.

Здравствуйте, меня зовут Бернард Мус, и я работаю в группе инженерии стволовых клеток в Институте реконструктивной нейробиологии в Бонде, Германия. Здравствуйте, меня зовут Кристоф., и я также являюсь сотрудником лаборатории Гувера. Наша рабочая группа интенсивно использует технику трансдукции белка для прямой доставки биологически активного белка в различные клетки млекопитающих, и сегодня мы хотим провести вас через процесс экспрессии и очистки в кишечной палочке и из нее.

После этого мы хотели бы показать вам, как применять клеточный постоянный гибридный белок в клеточной культуре, чтобы продемонстрировать всю процедуру выражения, очистки и применения. Мы используем сайт-специфичную рекомбинацию Cree для генетической модификации мышиных стволовых клеток. Хорошо. Хорошо. Давайте начнем.

Чтобы инокулировать ночную культуру, мы используем уже преобразованные бактерии, хранящиеся в глицериновом бульоне при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Эти бактерии уже содержат вектор, кодирующий декре-рекомбинацию. С помощью наконечника Pipper мы нацарапываем небольшое количество бактерий на наконечнике Piper и опускаем его в стакан, содержащий культуру для ночлега.

Ночная культура состоит из ЛБ-среды с добавлением глюкозы в конечной концентрации ох 0,5% и 50 мкг углекислого инсулина на мл. Затем стакан помещают в инкубатор, работающий при температуре 37 градусов по Цельсию, для экспрессии сайт-специфичного Recombinate Cree. Мы используем довоенные средства массовой информации о туберкулезе для нашей широкомасштабной культуры самовыражения.

Для ускорения сцеживания мы рекомендуем использовать подогретые до 37 градусов по Цельсию тусполизированные среды, которые представляют собой температуру во время экспрессии рекомбинантного белка. Затем мы добавляем глюкозу в среду для ТБ в конечной концентрации от 0,5%. Глюкоза предотвращает повышенную базальную экспрессию гибридного белка во время роста культуры экспрессии перед индукцией. Наконец, ампициллин добавляют к экспрессирующей культуре в конечной концентрации 100 мкг/мл для получения чистой культуры, содержащей только те бактерии, которые все еще содержат плазмиду, кодирующую белок декрета.

Теперь мы можем получить нашу культуру за одну ночь и привить культуру экспрессии в соотношении один к 50. Затем мензурки помещаются в инкубатор, работающий при температуре 37 градусов по Цельсию. Вы должны регулярно брать образцы для измерения оптической плотности на протяжении всего сцеживания.

Как только культура достигает оптической плотности 1,5, бактерии индуцируются с конечной концентрацией ох 0,5 миллимоляра IPTG. После одного часа индукции сцеживающую культуру переносят в трубки и затем собирают с помощью центрифугирования. Для этого мы используем ротор SLA 3000.

Центрифуга работает со скоростью 5 000 выстрелов в минуту в течение 10 минут при четырех градусах антеградации. Затем снат выбрасывается, и бактериальные гранулы могут храниться неограниченное время при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Замороженные гранулы ресуспендируются в буфере lizza, апелляции, соответствующей одному литру культуры экспрессии.

Используем 10 мл буфера lizza, ждем примерно 15 минут, пока раствор не станет однородным. Затем на каждый мл суспензии добавляют один миллиграмм лизоцима. Раствор перемешивается в течение 20 минут, чтобы позволить ферменту расщепить бактерии.

Затем добавляют бенсон нэйз в разведении один к 1000 в течение дополнительных 15 минут, что разрезает ДНК, в результате чего получается невязкий раствор. Наконец, для обеспечения лизиса клеток используется сонатор. Программа работает в течение полутора минут с мощностью 45% после завершения сертификации.

Не забудьте взять образец каждого этапа здесь, сырой лизат или анализ страницы SDS очистки. В настоящее время очень важно добавить один мл ледяного буфера TSB на мл суспензии, так как белок будет иметь тенденцию к осаждению в запасе глицерина. Если вы пропустите этот шаг, раствор вскоре перемешается, и сырой раствор будет готов к центрифугированию.

Для этого мы используем ротор SS 34. Центрифуга работает со скоростью 17 000 об/мин в течение 30 минут при температуре четыре градуса по Цельсию. По окончании центрифуга Inc осторожно перелила надосадочную жидкость S в свежие пробирки Falcon объемом 50 мл.

Теперь добавьте никелевую суспензию анти А к надосадочной жидкости никеля. Anti A является важнейшим реагентом для правильной очистки гибридных белков гистидина. Гистидин образует комплекс с ионами никеля, обеспечивающими аффинную очистку, теперь осторожно встряхивайте парковочные трубки в течение 60 минут при температуре 40 градусов по Цельсию.

Через час вы можете нанести суспензию на колонны объемом 20 мл и позволить раствору протекать под действием силы тяжести. При крупносерийном производстве целесообразно разделить подвес на несколько колонн. Затем мы дважды промываем колонку буфером, содержащим 15 миллимоляров внутренней золы.

Количество применяемого буфера зависит от объема смолы. Два MLS никелевого NTA соответствуют одному мл смолы для средств стирки. После промывки мы наносим на колонку пять объемов смолы промывочного буфера, теперь мы готовы к удалению нашего белка.

Поэтому мы используем элюирующий буфер с концентрацией 250 миллимоляров иммунофермента. Так что обратите внимание, как цвет смолы меняется в сторону зеленого. Из-за высокой концентрации белка CRE фракция OID иногда попадает в какашку.

Чтобы предотвратить это, смешайте раствор и добавьте дополнительный буфер lys, все фракции теперь объединяются и затем переносятся в трубку для лизиса. Лизис удалит оле, первый этап диализатора проводится против буфера, содержащего высокую концентрацию соли. Через час буфер с высоким содержанием солей заменяется и процедура диализа применяется на ночь.

На следующий день диализная трубка извлекается из буфера с высоким содержанием солей и переносится в глицериновый буфер. Через три-пять часов происходит замена глицеринового буфера и снова проводится диализ в течение ночи. Лизис против глицеринового буфера приведет к получению концентрированного исходного раствора, по крайней мере, в три раза.

Стоковый раствор теперь можно хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких лет без потери активности Для обеспечения качества вы можете загрузить собранные образцы страницы SDS на гель и впоследствии окрашивать его. Для Камаси гибридный белок Cree обнаруживается как заметная полоса в фракции OID. Для того, чтобы использовать подходящую концентрацию рекомбинации экипажа, вы должны определить концентрацию с помощью анализа Редфорда.

Как применять такие постоянные белки в клетки млекопитающих. Прежде всего, подготовьте клетки-мишени для достижения максимальной эффективности трансдукции белка. Смотрите на монослойные клетки с плотностью, приводящей к 80-90% слиянию клеточного слоя на следующий день, если вашими целевыми клетками являются клетки, которые выращиваются компактными колониями.

Разделите клетки и соматически и осмотрите их в одноклеточной суспензии за пять часов. Важно сделать суспензию для одной клетки перед трансдукцией белка, потому что в противном случае могут быть перелиты только воздушные клетки на поверхности колонии. Воздействуйте на среду и кратко наблюдайте за воздушными камерами с помощью PPS перед началом лечения.

Удалите остатки Да, грубые среды, содержащие сыворотку. После аспирации PPS обложите клетки капельницей и дайте им инкубироваться от трех до пяти минут. Теперь проверьте с помощью микроскопа, не растворены ли все колонии в отдельных клетках.

По только что упомянутым причинам это важнейший этап для трансдукции белка в клетки. Переложите отделенные клетки в трубку. Поместите пробирку в стол, центрифугируйте и вращайте клетки вниз, аспирируйте суперагент и снова суспендируйте клетку.

P в питательной среде разбавляют клетки до соответствующего количества клеток. Это, конечно, зависит от размера культуры ткани. В чашке инкубируйте воздушные камеры еще пять часов.

Это даст воздушным ячейкам достаточно времени, чтобы прикрепиться к дну и нарастить прилипшие. Трехклассный запас может храниться при температуре минус 20 градусов более двух лет. При работе с рекомбинантным клеточным белком постоянного слияния очень полезно иметь такое стоковое решение, которое можно использовать по требованию.

В ожидании, пока клетки прикрепятся к чашке, можно приготовить среду для трансдукции С, просто разбавив соответствующий объем постоянного белка клетки из запасов холестерина в себя. Медиа. Поскольку стоковый раствор Clare еще не стерилен, транс-среды должны быть стерильно отфильтрованы перед его применением. Мы рекомендуем использовать шприц, который можно прикрутить к фильтру, связывающему белок.

Конечная концентрация в ручье зависит от типа клеток или добавок среды. Например, сыворотка оказывает сильное негативное влияние на эффективность трансдукции. Это можно преодолеть путем использования бессывороточных сред или увеличения концентрации в ручье.

Мы находим оптимальные условия, обеспечивающие максимальную эффективность рекомбинации. Концентрацию гидратов следует начинать от от 0,5 до 10 мкмоль. Мы рекомендуем тестировать разное время инкубации от шести до 18 часов.

После пяти часов инкубации извлеките клетки-мишени и аспирируйте перекрестную среду. Впоследствии заменяем его на белковые трансдукционные среды, после ночной инкубации помещаем воздушные клетки обратно в инкубатор. Кратковременно промыл D-клетки PPS и заменил среду для трансдукции белка на нормальную ES-среду.

Через 48 часов после инкубации клеток экспрессия гена постоянного Cree vent может быть обнаружена с помощью xul. Окрашивающие клетки с положительным фенотипом бега были успешно генетически модифицированы путем сайт-специфической рекомбинации. Кри отчета.

Клетки содержат CRE с использованием конструкции Lae после предварительно опосредованной рекомбинации. Последовательность блокировки P-фланга вырезается, и активируется ген люксового репортера, управляемый промотором команды. Для оценки эффективности рекомбинации в предварительно обработанных репортерных воздушных камерах необходимо закрепить ячейки с воздухом.

Аспират с средой дважды промывает клетки PBS с наложением 4% PFA и инкубирует клетки в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого ячейки еще раз трижды промыть с помощью PBS. После аспирации PBS с последней ступени промывки в растворе Xal Stain в лунки инкубируют клетки в течение ночи при температуре 37 градусов в инкубаторе.

На следующий день активность Била может контролироваться клетками синих воротничков. Эффективность рекомбинации можно определить по количеству синих колоний. При оптимальных условиях вы должны быть в состоянии достичь эффективности рекомбинации выше 90% Хорошо, сегодня мы показали вам, как выразить и очистить рекомбинацию запросов, специфичных для сайта.

В этом исследовании, доказывающем принцип работы, мы смогли индуцировать рекомбинацию в большинстве солей. Ладно, вот и все. Удачи в ваших экспериментах.