Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых
20 мая 2010 г.
Видео биоинформатики является автоматизированной обработки, анализа, понимания и анализа данных биологических пространственно-временных данных, извлеченных из микроскопических видео. Целью данной статьи является демонстрация метода измерения человеческих эмбриональных стволовых клеток, роста колоний методом видео биоинформатики.
Этот протокол демонстрирует метод видеобиоинформатики для измерения роста колонии эмбриональных стволовых клеток человека путем анализа покадровых видео, собранных в инкубаторе КТ icon bio station, оснащенном камерой для видеовизуализации. Человеческие эмбриональные стволовые клетки или колонии HESC культивируют до 70% плавности, реплацируют и инкубируют в течение 48 часов, после чего колонии HESC снимают еще на 48 часов в Biot ct. Темпы роста определяются с помощью рецептов улучшения сегментации и измерений, разработанных с помощью программного обеспечения CL quant.
Рецепты проверены путем сравнения с Adobe Photoshop, инструментом анализа изображений, который позволяет точно вручную подгонять маску к каждой колонии. Зарождающаяся область видеобиоинформатики может быть использована для автоматизации обработки, анализа и извлечения биологических данных из микроскопических видео. Здравствуйте, меня зовут Серена Лин из лаборатории доктора Пру Тэлбота на факультете клеточной биологии и неврологии Калифорнийского университета в Риверсайде.
Здравствуйте, меня зовут Шон Фино, я тоже из лаборатории Талбота. Здравствуйте, я Ти Сатиш из аспирантуры по клеточной молекулярной биологии и биологии развития. Сегодня мы покажем вам, как измерить рост колонии эмбриональных стволовых клеток человека с помощью инструментов видеобиоинформатики.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для измерения воздействия токсикантов окружающей среды на поведение эмбриональных стволовых клеток человека. Мы продемонстрируем эту процедуру в нашем новом центре стволовых клеток. Итак, приступим.
Чтобы подготовить HESC к видеоанализу, вырастите HESC On покрыть шесть луночных планшетов до 70% сливающейся аспиратной среды из одной лунки, содержащей HESC, и промыть два раза одним миллилитром PBS. Добавьте один миллилитр Аккутана и инкубируйте в течение одной минуты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Затем добавьте в лунку от 10 до 12 стеклянных шариков и осторожно встряхивайте пластину, пока колонии полностью не отделятся.
Нейтрализуйте аккутан с помощью одного миллилитра эмбриональных стволовых клеток человека, среды или кондиционированной среды эмбриональных фибробластов мыши. Соберите отделенные ячейки без шариков в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 200 G в течение трех минут. Сцедите натант SUP и разбейте гранулу с 500 микролитрами свежей среды для поддержания эмбриональных стволовых клеток человека или планшетом M-T-E-S-R 100 микролитров суспензии HESC по каплям в несколько лунок 12-луночного планшета, покрытого матригелем.
Осторожно покачивайте планшет вперед и назад и наблюдайте за культурами под световым микроскопом, чтобы убедиться, что клеточные скопления равномерно распределены по лункам. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 градусов и содержании 5% углекислого газа на 48 часов, чтобы убедиться, что ячейки прикреплены плоскими и достаточно большими, чтобы их можно было легко визуализировать. Через 48 часов отсадите среду и промойте лунки 500 микролитрами PBS для удаления неприкрепленных клеток, затем добавьте по 500 микролитров среды M-T-E-S-R в каждую.
Что ж, немедленно поместите планшет в Biot CT и начните сбор покадровых изображений. Старайтесь выбирать поля с незаметными одиночными колониями, которые вряд ли перерастут в другие колонии. В этом протоколе клетки записываются на видео в течение дополнительных 48 часов с интервалом в семь минут.
Чтобы сначала создать рецепт сегментации, вручную отсканируйте все видео, чтобы убедиться, что оно содержит одну колонию, которая остается в фокусе на протяжении всего периода записи. После этого откройте мастер сегментации в программе CL quants и нажмите кнопку «Далее». Выберите нужный канал изображения и нажмите кнопку «Далее».
Выберите мягкое сопоставление и нажмите Далее. Выберите одну или две нужные области, обведя внешний край к центральной области колонии. Эта территория должна быть как можно меньше, но должна быть репрезентативной для всей колонии.
Не выбирайте слишком много областей, так как это может привести к неточному нанесению маски. Нажмите кнопку «Далее». Выберите «Не нужны регионы», обведя кружком регионы, которые не являются частью колонии и не являются частью фона.
Эти области имеют узоры, которые следует подавлять, такие как мусор и мертвые клетки. Нажмите далее. Выберите фон, обведя области, которые не являются колониями, мусором или мертвыми клетками.
Фон должен быть однородным и, скорее всего, будет виден в каждом кадре. Как правило, мы выделяем серый фон вокруг колонии. Нажмите кнопку «Далее».
Цветная маска должна отображаться над областью интереса, если маска неточно покрывает область интереса. Диапазон пороговых значений сегментации в правом нижнем углу экрана может быть увеличен или уменьшен, если требуется смена маски. Выберите обновления областей мягкого сопоставления.
Это позволяет изменять области «не хочу» или «задний план». Если маска устраивает, выберите «Применить порог» и сохраните маску. Затем нажмите кнопку «Далее».
После этого маска будет отображаться другим цветом. Выберите «Готово». Рецепт должен отображаться в правом верхнем углу программы в виде рецепта сегментации.
При желании переименуйте рецепт, щелкнув правой кнопкой мыши и введя новое имя. Применить рецепт. Щелкните правой кнопкой мыши и наведите курсор мыши.
Применить рецепт. Появится меню, позволяющее выбрать количество используемых кадров. Установите интервал кадров каждые 20 кадров, чтобы обеспечить точность маски.
Случайным образом вручную проверяйте 10% кадров, к которым была применена маска, чтобы создать рецепт улучшения, который удаляет нежелательные области в мусоре. Щелкните правой кнопкой мыши папку с рецептами улучшения и выберите команду Создать. Новый рецепт улучшения должен отображаться из исходного поля зрения.
Наведите курсор мыши на значки на панели инструментов, чтобы определить кнопку переключателя модуля улучшения, расположенную справа от изображения, и нажмите на нее. Выберите выпадающее меню «Маркировка». Выберите маркировку для подключенных, выберите маркировку для подключенных двух.
Должна отобразиться новая панель задач. Возьмите исходную маску из рецепта сегментации и перетащите ее в поле ввода. Теперь на панели должен отображаться номер маски ввода.
Перетащите иконку с номером маски ввода на иконку нуля маски. Найдите минимальный размер на панели задач и настройте число, пока не отобразится только интересующая область. Обязательно нажимайте на кнопку «Выполнить» для каждой примерочной пробы.
Как только минимальная регулировка размера будет удовлетворительной, нажмите на предыдущий рецепт улучшения в нижней части экрана, выберите «Сохранить в рецепте». Теперь программа предложит перезаписать выбранный рецепт и выбрать место «да». Проверьте рецепт улучшения, используя ту же процедуру, что и при выборочной проверке сегментации.
Если вас устраивают рецепты сегментации и улучшения, перейдите к созданию шаблона измерения. Для начала выбора создайте шаблон измерения на правой панели инструментов. В окне измерения выберите наведение курсора на фигуру ячейки картинки.
Удерживая клавишу управления, выберите ячейку в разделе морфологии, снимите галочку с параметра по умолчанию и проверьте параметр области. Затем выйдите из окна шаблона. Выберите значок.
Создайте рецепт измерения. Переименуйте рецепт. Перейдите на вкладку шаблона и выберите его в правом верхнем углу, перетащите ранее созданный шаблон измерения в окно измерения.
Нажмите «Да», чтобы продолжить в окне рецепта измерения, выберите сопоставления каналов. Затем сопоставления масок выбора всей ячейки. Затем выберите опцию целой ячейки Для расширенной маски выберите рецепт измерения на вкладке рецепта.
В главном окне выберите значок сохранения в окне рецепта измерения. Затем закройте окно «Далее», закройте и снова откройте поле зрения. Щелкните правой кнопкой мыши папку со списком рецептов, а затем выберите «Новые рецепты» в нужном приложении в список рецептов, выберите «Заблокировать список рецептов» и последовательно запустите рецепты на видеоданных с помощью Adobe Photoshop.
Анализировался каждый 20-й кадр тех же колоний. Вручную откройте рамку изображения колонии в программе Adobe Photoshop. Нажмите на инструмент «Волшебная палочка» на панели инструментов.
Нажмите на область вокруг колонии, чтобы покрыть все поле, кроме области колонии. Убедитесь, что пунктирная линия вокруг колонии проходит по периферии колонии, а не внутри нее. Если пунктирная линия не находится по периферии, измените значение допуска на верхней панели инструментов соответствующим образом.
Нажмите «Редактировать» в режиме быстрой маски на панели инструментов и нажмите на колонию, чтобы колония была выбрана. Перейдите в окно, выкройте меню и нажмите гистограмму. Кэш должен быть установлен в единицу.
Если кэш состоит из двух, щелкните восклицательный знак выражения, чтобы изменить размер кэша на один. Запишите значение в пикселях в таблицу. Повторяйте описанный выше процесс для каждого 20-го кадра.
Данные, собранные с помощью Photoshop и программного обеспечения CL quant, затем могут быть построены на графике вместе. Наш протокол количественной оценки роста колонии HESC демонстрирует одно из применений видеобиоинформатики к биологической проблеме. Здесь мы показываем график, сравнивающий увеличение размера колонии за 48 часов, определенное с помощью программного обеспечения CL quant и Adobe Photoshop.
На графике показаны пять различных колоний, каждая из которых анализируется обоими программными пакетами. Каждая колония представлена разным цветом. Сплошные линии были получены с помощью программного обеспечения для измерения парусов, в то время как пунктирные линии были собраны с помощью Photoshop.
График исходных данных показывает, что оба метода измерения хорошо согласуются с тем фактом, что колонии имеют разный начальный размер. На этом рисунке показаны данные, перестроенные на график в виде процентного увеличения размера колонии. Темпы роста одинаковы независимо от начального размера колонии, и оба метода анализа дают схожие результаты.
На следующем графике показаны средние значения данных предыдущего процентного изменения по росту колонии HESC. На этом графике хорошо видно хорошее соответствие между анализом, проведенным с помощью видеобиоинформатики и Adobe Photoshop. Мы только что показали вам, как измерить рост колонии эмбриональных стволовых клеток человека с помощью инструментов видеобиоинформатики.
При выполнении этой процедуры с помощью фазово-контрастной микроскопии обязательно включите ореол вокруг колонии для точного выбора колонии программным обеспечением. Также важно помнить, что вместо протокола, который мы продемонстрировали, можно использовать другие методы культивирования, инкубации и видеосбора. После того, как рецепты будут разработаны и проверены, они будут выполнять анализ гораздо быстрее и с меньшими экспериментальными вариациями, чем ручной анализ.
Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен биоинформатический видеометод измерения роста колоний эмбриональных стволовых клеток человека с использованием анализа видео в режиме таймлапс. Этот метод автоматизирует обработку и анализ биологических данных, извлеченных из микроскопических видеозаписей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Видеобиоинформатика
- Биология стволовых клеток
- Микроскопическая визуализация
Теоретические основы
- Эмбриональные стволовые клетки человека (HESC) имеют решающее значение для исследований в области биологии развития.
- Анализ видеозаписей с функцией таймлапса позволяет получить представление о динамике роста клеток.
- Автоматизированные методы могут повысить эффективность обработки данных.
- Методы сегментации и измерения необходимы для точного анализа.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод измерения роста колоний HESC.
- Провести валидацию методов видеобиоинформатики в сравнении с традиционными инструментами анализа изображений.
- Внести вклад в область автоматизированного анализа биологических данных.
Используемые методы
- Видео с таймлапсом, полученные из инкубатора, оснащенного камерой.
- Рецепты улучшения сегментации и измерения, разработанные с помощью программного обеспечения CL quant.
- Сравнение автоматизированных измерений с ручным анализом с использованием Adobe Photoshop.
- Съемка колоний HESC в течение 48 часов после инкубации.
Основные результаты
- Метод видеобиоинформатики позволил успешно измерить скорость роста колоний.
- Автоматизированный анализ продемонстрировал согласованность с результатами ручных измерений.
- Методы сегментации повысили точность оценки роста.
- Данное исследование подчеркивает потенциал видеобиоинформатики в биологических исследованиях.
Выводы
- Видеобиоинформатика является ценным инструментом для анализа роста стволовых клеток.
- Данный метод позволяет оптимизировать сбор и анализ данных в биологических исследованиях.
- Дальнейшая разработка автоматизированных методов может повысить эффективность исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка динамики роста колоний стволовых клеток имеет решающее значение для анализа клеточных реакций на факторы окружающей среды и терапевтические препараты-кандидаты на ранних этапах поиска. Автоматизированная биоинформатика видеоданных снижает вариативность и увеличивает пропускную способность по сравнению с ручным анализом изображений, что обеспечивает надежный фенотипический скрининг. Этот подход позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет получения количественных и воспроизводимых данных о кинетике расширения колоний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, используя рост колоний в качестве функционального показателя поведения стволовых клеток в экспериментальных условиях.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет объективной количественной оценки скорости экспансии колоний в различных группах терапии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем внедрения стандартизированного автоматизированного измерения кинетики роста колоний.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования программного обеспечения для сегментации и протоколов измерения, которые сводят к минимуму влияние человеческого фактора.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает непрерывность исследования систем в контексте заболеваний, позволяя осуществлять лонгитюдный мониторинг роста колоний стволовых клеток в качестве биомаркера жизнеспособности и отклика клеток.
- Практическая ценность: облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков за счет получения согласованных, количественно измеримых данных о росте, которые коррелируют со здоровьем и стабильностью клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в цикл научных исследований — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений-лидеров — за счет получения количественных фенотипических данных о динамике колоний стволовых клеток.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем установления связи между измерениями роста колоний и конкретными генетическими или средовыми воздействиями.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа благодаря автоматизированному программному анализу, который стандартизирует количественную оценку скорости роста в различных экспериментах.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных (площадь колонии в пикселях с течением времени), что позволяет объективно сравнивать скорость роста при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклиническими исследованиями, предлагая интерпретируемый показатель поведения стволовых клеток, применимый для моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальный инструмент для различных проектов, так как валидированные протоколы могут быть применены к любым данным видеосъемки с таймлапсом для последовательного анализа роста.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет снижения механистической неопределенности при оценке поведения стволовых клеток посредством объективного автоматизированного количественного анализа.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость за счет замены ручного покадрового анализа биоинформационными рабочими процессами пакетной обработки видео.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних этапах, обеспечивая раннюю приоритизацию линий стволовых клеток или условий на основе данных о показателях роста.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продвижении с учетом рисков, предоставляя воспроизводимые количественные показатели роста, которые служат основой для выбора линий и оптимизации условий.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с программным обеспечением для анализа изображений и обработки видеоданных для разработки и валидации алгоритмов сегментации, улучшения качества и измерения.
- Зависит от стабильной инфраструктуры для таймлапс-визуализации, такой как интегрированная в инкубатор система камер, способная обеспечить согласованный захват кадров в течение длительного периода времени.
- Необходима межкомандная стандартизация параметров алгоритмов (например, интервал между кадрами, пороги маскирования) для обеспечения воспроизводимости результатов разными пользователями и в разных лабораториях.
- При применении алгоритмов к различным типам клеток, морфологиям колоний или форматам видео могут потребоваться корректировки и повторная оптимизация параметров.
- Практические ограничения включают зависимость от качества видео и стабильности фокусировки; заслоненные или смещающиеся колонии могут потребовать ручного вмешательства или корректировки алгоритма.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Introduction
1:40
Plating and Colony Formation of hESC for Video Data
6:40
Video Bioinformatics with CL-Quant Software -- Enhancement Recipe
3:48
Video Bioinformatics with CL -Quant Software -- Segmentation Recipe
8:19
Video Bioinformatics with CL -Quant Software -- Measurement Template
11:22
Comparison of CL-Quant and Adobe® Photoshop® for Video Analysis of hESC Colony Growth
10:08
Adobe® Photoshop® Measurement of hESC Video Data
12:27
Conclusion
