Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых

Видео биоинформатики является автоматизированной обработки, анализа, понимания и анализа данных биологических пространственно-временных данных, извлеченных из микроскопических видео. Целью данной статьи является демонстрация метода измерения человеческих эмбриональных стволовых клеток, роста колоний методом видео биоинформатики.

Этот протокол демонстрирует метод видеобиоинформатики для измерения роста колонии эмбриональных стволовых клеток человека путем анализа покадровых видео, собранных в инкубаторе КТ icon bio station, оснащенном камерой для видеовизуализации. Человеческие эмбриональные стволовые клетки или колонии HESC культивируют до 70% плавности, реплацируют и инкубируют в течение 48 часов, после чего колонии HESC снимают еще на 48 часов в Biot ct. Темпы роста определяются с помощью рецептов улучшения сегментации и измерений, разработанных с помощью программного обеспечения CL quant.

Рецепты проверены путем сравнения с Adobe Photoshop, инструментом анализа изображений, который позволяет точно вручную подгонять маску к каждой колонии. Зарождающаяся область видеобиоинформатики может быть использована для автоматизации обработки, анализа и извлечения биологических данных из микроскопических видео. Здравствуйте, меня зовут Серена Лин из лаборатории доктора Пру Тэлбота на факультете клеточной биологии и неврологии Калифорнийского университета в Риверсайде.

Здравствуйте, меня зовут Шон Фино, я тоже из лаборатории Талбота. Здравствуйте, я Ти Сатиш из аспирантуры по клеточной молекулярной биологии и биологии развития. Сегодня мы покажем вам, как измерить рост колонии эмбриональных стволовых клеток человека с помощью инструментов видеобиоинформатики.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для измерения воздействия токсикантов окружающей среды на поведение эмбриональных стволовых клеток человека. Мы продемонстрируем эту процедуру в нашем новом центре стволовых клеток. Итак, приступим.

Чтобы подготовить HESC к видеоанализу, вырастите HESC On покрыть шесть луночных планшетов до 70% сливающейся аспиратной среды из одной лунки, содержащей HESC, и промыть два раза одним миллилитром PBS. Добавьте один миллилитр Аккутана и инкубируйте в течение одной минуты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Затем добавьте в лунку от 10 до 12 стеклянных шариков и осторожно встряхивайте пластину, пока колонии полностью не отделятся.

Нейтрализуйте аккутан с помощью одного миллилитра эмбриональных стволовых клеток человека, среды или кондиционированной среды эмбриональных фибробластов мыши. Соберите отделенные ячейки без шариков в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 200 G в течение трех минут. Сцедите натант SUP и разбейте гранулу с 500 микролитрами свежей среды для поддержания эмбриональных стволовых клеток человека или планшетом M-T-E-S-R 100 микролитров суспензии HESC по каплям в несколько лунок 12-луночного планшета, покрытого матригелем.

Осторожно покачивайте планшет вперед и назад и наблюдайте за культурами под световым микроскопом, чтобы убедиться, что клеточные скопления равномерно распределены по лункам. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 градусов и содержании 5% углекислого газа на 48 часов, чтобы убедиться, что ячейки прикреплены плоскими и достаточно большими, чтобы их можно было легко визуализировать. Через 48 часов отсадите среду и промойте лунки 500 микролитрами PBS для удаления неприкрепленных клеток, затем добавьте по 500 микролитров среды M-T-E-S-R в каждую.

Что ж, немедленно поместите планшет в Biot CT и начните сбор покадровых изображений. Старайтесь выбирать поля с незаметными одиночными колониями, которые вряд ли перерастут в другие колонии. В этом протоколе клетки записываются на видео в течение дополнительных 48 часов с интервалом в семь минут.

Чтобы сначала создать рецепт сегментации, вручную отсканируйте все видео, чтобы убедиться, что оно содержит одну колонию, которая остается в фокусе на протяжении всего периода записи. После этого откройте мастер сегментации в программе CL quants и нажмите кнопку «Далее». Выберите нужный канал изображения и нажмите кнопку «Далее».

Выберите мягкое сопоставление и нажмите Далее. Выберите одну или две нужные области, обведя внешний край к центральной области колонии. Эта территория должна быть как можно меньше, но должна быть репрезентативной для всей колонии.

Не выбирайте слишком много областей, так как это может привести к неточному нанесению маски. Нажмите кнопку «Далее». Выберите «Не нужны регионы», обведя кружком регионы, которые не являются частью колонии и не являются частью фона.

Эти области имеют узоры, которые следует подавлять, такие как мусор и мертвые клетки. Нажмите далее. Выберите фон, обведя области, которые не являются колониями, мусором или мертвыми клетками.

Фон должен быть однородным и, скорее всего, будет виден в каждом кадре. Как правило, мы выделяем серый фон вокруг колонии. Нажмите кнопку «Далее».

Цветная маска должна отображаться над областью интереса, если маска неточно покрывает область интереса. Диапазон пороговых значений сегментации в правом нижнем углу экрана может быть увеличен или уменьшен, если требуется смена маски. Выберите обновления областей мягкого сопоставления.

Это позволяет изменять области «не хочу» или «задний план». Если маска устраивает, выберите «Применить порог» и сохраните маску. Затем нажмите кнопку «Далее».

После этого маска будет отображаться другим цветом. Выберите «Готово». Рецепт должен отображаться в правом верхнем углу программы в виде рецепта сегментации.

При желании переименуйте рецепт, щелкнув правой кнопкой мыши и введя новое имя. Применить рецепт. Щелкните правой кнопкой мыши и наведите курсор мыши.

Применить рецепт. Появится меню, позволяющее выбрать количество используемых кадров. Установите интервал кадров каждые 20 кадров, чтобы обеспечить точность маски.

Случайным образом вручную проверяйте 10% кадров, к которым была применена маска, чтобы создать рецепт улучшения, который удаляет нежелательные области в мусоре. Щелкните правой кнопкой мыши папку с рецептами улучшения и выберите команду Создать. Новый рецепт улучшения должен отображаться из исходного поля зрения.

Наведите курсор мыши на значки на панели инструментов, чтобы определить кнопку переключателя модуля улучшения, расположенную справа от изображения, и нажмите на нее. Выберите выпадающее меню «Маркировка». Выберите маркировку для подключенных, выберите маркировку для подключенных двух.

Должна отобразиться новая панель задач. Возьмите исходную маску из рецепта сегментации и перетащите ее в поле ввода. Теперь на панели должен отображаться номер маски ввода.

Перетащите иконку с номером маски ввода на иконку нуля маски. Найдите минимальный размер на панели задач и настройте число, пока не отобразится только интересующая область. Обязательно нажимайте на кнопку «Выполнить» для каждой примерочной пробы.

Как только минимальная регулировка размера будет удовлетворительной, нажмите на предыдущий рецепт улучшения в нижней части экрана, выберите «Сохранить в рецепте». Теперь программа предложит перезаписать выбранный рецепт и выбрать место «да». Проверьте рецепт улучшения, используя ту же процедуру, что и при выборочной проверке сегментации.

Если вас устраивают рецепты сегментации и улучшения, перейдите к созданию шаблона измерения. Для начала выбора создайте шаблон измерения на правой панели инструментов. В окне измерения выберите наведение курсора на фигуру ячейки картинки.

Удерживая клавишу управления, выберите ячейку в разделе морфологии, снимите галочку с параметра по умолчанию и проверьте параметр области. Затем выйдите из окна шаблона. Выберите значок.

Создайте рецепт измерения. Переименуйте рецепт. Перейдите на вкладку шаблона и выберите его в правом верхнем углу, перетащите ранее созданный шаблон измерения в окно измерения.

Нажмите «Да», чтобы продолжить в окне рецепта измерения, выберите сопоставления каналов. Затем сопоставления масок выбора всей ячейки. Затем выберите опцию целой ячейки Для расширенной маски выберите рецепт измерения на вкладке рецепта.

В главном окне выберите значок сохранения в окне рецепта измерения. Затем закройте окно «Далее», закройте и снова откройте поле зрения. Щелкните правой кнопкой мыши папку со списком рецептов, а затем выберите «Новые рецепты» в нужном приложении в список рецептов, выберите «Заблокировать список рецептов» и последовательно запустите рецепты на видеоданных с помощью Adobe Photoshop.

Анализировался каждый 20-й кадр тех же колоний. Вручную откройте рамку изображения колонии в программе Adobe Photoshop. Нажмите на инструмент «Волшебная палочка» на панели инструментов.

Нажмите на область вокруг колонии, чтобы покрыть все поле, кроме области колонии. Убедитесь, что пунктирная линия вокруг колонии проходит по периферии колонии, а не внутри нее. Если пунктирная линия не находится по периферии, измените значение допуска на верхней панели инструментов соответствующим образом.

Нажмите «Редактировать» в режиме быстрой маски на панели инструментов и нажмите на колонию, чтобы колония была выбрана. Перейдите в окно, выкройте меню и нажмите гистограмму. Кэш должен быть установлен в единицу.

Если кэш состоит из двух, щелкните восклицательный знак выражения, чтобы изменить размер кэша на один. Запишите значение в пикселях в таблицу. Повторяйте описанный выше процесс для каждого 20-го кадра.

Данные, собранные с помощью Photoshop и программного обеспечения CL quant, затем могут быть построены на графике вместе. Наш протокол количественной оценки роста колонии HESC демонстрирует одно из применений видеобиоинформатики к биологической проблеме. Здесь мы показываем график, сравнивающий увеличение размера колонии за 48 часов, определенное с помощью программного обеспечения CL quant и Adobe Photoshop.

На графике показаны пять различных колоний, каждая из которых анализируется обоими программными пакетами. Каждая колония представлена разным цветом. Сплошные линии были получены с помощью программного обеспечения для измерения парусов, в то время как пунктирные линии были собраны с помощью Photoshop.

График исходных данных показывает, что оба метода измерения хорошо согласуются с тем фактом, что колонии имеют разный начальный размер. На этом рисунке показаны данные, перестроенные на график в виде процентного увеличения размера колонии. Темпы роста одинаковы независимо от начального размера колонии, и оба метода анализа дают схожие результаты.

На следующем графике показаны средние значения данных предыдущего процентного изменения по росту колонии HESC. На этом графике хорошо видно хорошее соответствие между анализом, проведенным с помощью видеобиоинформатики и Adobe Photoshop. Мы только что показали вам, как измерить рост колонии эмбриональных стволовых клеток человека с помощью инструментов видеобиоинформатики.

При выполнении этой процедуры с помощью фазово-контрастной микроскопии обязательно включите ореол вокруг колонии для точного выбора колонии программным обеспечением. Также важно помнить, что вместо протокола, который мы продемонстрировали, можно использовать другие методы культивирования, инкубации и видеосбора. После того, как рецепты будут разработаны и проверены, они будут выполнять анализ гораздо быстрее и с меньшими экспериментальными вариациями, чем ручной анализ.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.