Обработка лапок насекомых для флуоресцентной микроскопии: метод сохранения нервно-мышечных структур для визуализации

- Для начала погрузите обезболенных насекомых в 70% раствор этанола, чтобы уменьшить гидрофобность кутикулы. Затем промойте и пропитайте ткань фосфатно-солевым раствором, содержащим моющее средство, в течение не менее 30 минут, чтобы обеспечить проникновение в ткань во время фиксации.

Далее удалите голову и брюшную полость из грудной клетки. С помощью щипцов слегка надавите на контакт тазобедренно-грудной клетки и отсоедините ногу. Осторожно поместите ноги в ледяной 4% раствор параформальдегида на ночь, чтобы он проник в ткани. Параформальдегид фиксирует ткани путем сшивания белков.

Затем удалите фиксирующий раствор и несколько раз промойте ткань фосфатно-солевым моющим средством. Перед установкой поместите ножки в чистый или слегка разбавленный монтажный буфер как минимум на один день, чтобы обеспечить достаточно времени для проникновения буфера в ткани.

Наконец, установите ножки в каплю монтажной среды. Используйте распорку между предметным стеклом микроскопа и покровным стеклом, чтобы предотвратить повреждение образца, и закрепите крепление лаком для ногтей.

В следующем примере мы увидим рассечение, фиксацию и крепление ног Drosophila melanogaster.

- Начните с заполнения соответствующего количества лунок в стеклянной многолуночной пластине 70% этанолом. С помощью щетки добавьте от 15 до 20 мух под наркозом любого возраста и пола в каждую лунку и осторожно окуните мух в этанол, пока они полностью не погрузятся в воду.

Не более чем через одну минуту промойте мух три раза 0,3% раствором неионогенного поверхностно-активного средства в фосфатно-солевом буфере в течение не менее 10 минут за одну промывку. После последнего мытья используйте щипцы, чтобы удалить голову и брюшную полость каждой мухи, не повреждая грудной сегмент или ноги, и используйте кончик пары тонких щипцов, чтобы мягко, но сильно надавить на контакт тазобедренно-грудной клетки, чтобы отделить одну ногу от грудного сегмента.

Поместите ножки в одну лунку новой многолуночной пластины, содержащей свежеприготовленный 4% параформальдегид на льду, для ночной инкубации при температуре 4 градуса Цельсия.

- Важно осторожно вдавливать ноги в фиксирующий буфер, не позволяя им плавать, чтобы получить хорошо зафиксированные ноги.

- На следующий день вымойте ноги пять раз в свежем 0,3% растворе неионогенного моющего средства для поверхностно-активного вещества в течение 20 минут за одну стирку. После последней стирки замените моющее средство на монтажное средство и держите ножки в монтажном материале не менее 24 часов.

На следующий день добавьте примерно 20 микролитров 70% глицерина рядом с покрытым покрытием торцом стекла микроскопа и накройте глицерин покровным стеклом размером 22 на 22 миллиметра. Затем добавьте около 10 микролитров монтажной среды справа от покровного стекла и нанесите вторую 30-микролитровую линию монтажной среды справа от 10-микролитровой линии.

С помощью тонких щипцов перенесите одну ножку с многолуночной пластины в капле среды на 10-микролитровую полоску монтажной среды в ориентации внешней стороной вверх или вниз. Повторяйте до тех пор, пока не будут установлены и выровнены шесть-восемь ножек, и наденьте второй покровный лист на ножки так, чтобы второй покровный стекло слегка опирался на первое. Затем используйте лак для ногтей в каждом углу покровных стеблей, чтобы закрепить их на месте.