Экспериментальные метастазы и CTL Приемные Передача Иммунотерапия мышиной модели

Общая цель данной процедуры заключается в изучении эффективности иммунотерапии путем адаптивного переноса опухоль-специфических Т-клеток in vivo. Сначала для создания метастазов в легких мышам пересаживают опухолевые клетки путем инъекции в латеральную хвостовую вену. Вторым этапом процедуры является лечение мышей с опухолью с помощью опухоль-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов CTLs.

Заключительным этапом является использование туши из Индии для визуализации и количественного определения опухолевых узлов. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие эффективность сдерживания инициации опухоли (CIE) при различных методах лечения путем измерения размера опухоли и подсчета количества опухолевых узлов. Здравствуйте, меня зовут Мэри Циммерман, я сотрудник лаборатории доктора Кевина Лу в Медицинском колледже Джорджии.

Здравствуйте, меня зовут Шелин Ху. Я студентка второго курса, а также работаю в лаборатории доктора Лу. Главным преимуществом данного метода по сравнению с традиционными подходами, такими как кривые выживаемости, является то, что эта процедура носит как качественный, так и количественный характер. Значимость данных методов может быть распространена на терапию рака, поскольку они имитируют адаптивную иммунотерапию Т-клетками у пациентов с онкологическими заболеваниями.

Итак, приступим. За день до введения опухолевых клеток посейте в одну колбу T75 до 1 × 10⁷ клеток CMS4met в 10 мл среды RPMI, содержащей 10% сыворотки. Для получения быстрорастущих опухолевых клеток инкубируйте их в течение ночи при 37 °C непосредственно перед днем инъекции.

Удалите среду и один раз промойте клетки раствором PBS, затем соберите клетки опухоли с помощью 0,05% раствора трипсина ЭДТА при температуре 37 °C в течение пяти минут. Остановите реакцию, добавив 10 мл среды RPMI, содержащей 10% сыворотки. Перенесите клетки в коническую пробирку.

Центрифугируйте клетки при 1300 RPM в настольной центрифуге при комнатной температуре в течение трех минут. При комнатной температуре удалите супернатант, ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах свежего 1X HBSS для промывки. Затем повторно центрифугируйте и ресуспендируйте клетки аналогичным образом.

Подсчитайте количество опухолевых клеток с помощью гемоцитометра. Разведите клетки в HBSS таким образом, чтобы ресуспендировать количество клеток, необходимое для каждой инъекции. Мышей линии B SEA в возрасте от шести до восьми недель прогрейте в стакане, погруженном в теплую воду, до достижения общего объема 100 microliters.

Для расширения хвостовой вены поместите мышь в фиксатор для хвоста на лабораторном столе. С помощью микрошприца введите 100 µL опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену. Используйте асептическую технику, чтобы избежать инфицирования после инъекции.

Оказывайте легкое давление на место инъекции до полной остановки кровотечения. Поместите мышь обратно в клетку и дождитесь роста опухоли до требуемой стадии. В день переноса несколько раз прокачайте суспензию пипеткой для ресуспендирования подготовленных очищенных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL).

Как описано в тексте, перенесите все клетки из одной чашки в коническую пробирку объемом 15 мл, следя за тем, чтобы объем не превышал двух третей пробирки. Вставьте стерильную пипетку Пастера в коническую пробирку и осторожно наслоите среду для разделения лимфоцитов или LSM поверх клеток, пока общий объем не приблизится к 14 мл.

Будьте осторожны, чтобы не нарушить целостность слоев. Центрифугируйте при 2000 RPM в течение 20 минут при комнатной температуре. Не используйте тормоз для замедления ротора после центрифугирования; перенесите CTL в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Добавьте HBSS до общего объема примерно 10 миллилитров для промывки. После подсчета клеток центрифугируйте осадок при 1300 RPM в течение пяти минут при комнатной температуре, затем ресуспендируйте клетки в HBSS до необходимой плотности для инъекций.

Поддерживайте общий объем одной инъекции на уровне 100 microliters. Используйте ту же технику инъекции в хвост, которая была продемонстрирована ранее в этом видео. Для введения CTL в мышей с опухолью поместите мышь обратно в клетку и дайте CTL взаимодействовать с опухолью.

Мышей обычно подвергают эвтаназии для анализа через 14–21 день после введения CTL. Для визуализации метастазов в легких положите мышь на спину на пенопластовую доску. Закрепите конечности булавками, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к трахее.

Опрыскайте вентральную сторону 70% ethanol, начиная от середины брюшка. С помощью ножниц сделайте разрез по срединной линии через грудную клетку вверх по направлению к слюнным железам. Обнажите трахею.

С помощью пинцета удалите ткани, окружающие трахею. Просуньте наконечник пипетки на 200 µL под трахею, удерживая наконечник одной рукой. Осторожно приподнимите трахею, отводя ее от тела.

Поверните платформу на 180 градусов. С помощью шприца объемом 50 мл введите тушь из Индии в легкие через трахею. Полностью раздуйте легкие тушью до появления сильного сопротивления.

С помощью ножниц перережьте трахею. Просуньте пинцет под легкие и извлеките их из организма мыши. Кратковременно промойте легкие в одном литровом стакане с водой в вытяжном шкафу.

Перенесите легкие в стеклянный флакон, содержащий пять миллилитров раствора FTI. Опухолечная ткань будет выглядеть как белые узелки на фоне черных легких. Через несколько минут опухоли можно будет подсчитать; хранить их в растворе FTI можно неограниченно долго.

Легкие мышей с трансфицированной маммарной карциномой. Клеточная линия 4T1 демонстрирует белые пятна, указывающие на опухоли. Мыши, трансфицированные доминантно-отрицательным мутантом IRF8 K79E, демонстрируют повышенный метастатический потенциал опухолевых клеток.

На этих изображениях представлен гистологический анализ эффективности иммунотерапии путем адаптивного переноса CTL. У мышей с опухолями, которым вводили физиологический раствор, спустя шесть дней наблюдалось появление множественных опухолей, отмеченных стрелками. С другой стороны, у мышей, которым вводили опухоль-специфические Т-клетки, в том же эксперименте наблюдалось сокращение числа опухолей.

Обработка индийской тушью представляет собой более простой способ измерения эффективности адаптивного переноса CTL. В данном случае белые опухолевые узлы на пораженных легких позволяют четко отличить их от легких, в которых адаптивный перенос CTL прошел успешно, а подсчет узлов обеспечивает степень количественной оценки, недоступную при гистологическом анализе. При выполнении данной процедуры важно не забывать прогревать мышей для облегчения и повышения точности инъекций в хвостовую вену.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценить эффективность лечения с помощью этой простой процедуры количественного определения размера и количества опухолей. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.