Экспериментальные метастазы и CTL Приемные Передача Иммунотерапия мышиной модели

Экспериментальные метастазы легких и CTL модель мыши иммунотерапии для анализа опухолевых клеток-Т-клеток взаимодействия

Общей целью этой процедуры является изучение эффективности опухолево-специфической Т-клеточной адоптивной трансферной иммунотерапии in vivo. Сначала это достигается путем трансплантации опухолевых клеток через инъекцию боковой хвостовой вены мышам с целью образования метастазов в легких. Вторым этапом процедуры является лечение мышей с опухолями опухолеспецифичными цитотоксическими Т-лимфоцитами CTL.

Последним шагом является использование индийских чернил в качестве средства визуализации и количественной оценки опухолевых узелков. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают CIE различных методов лечения путем измерения размера опухоли и количественной оценки количества опухолевых узелков. Здравствуйте, меня зовут Мэри Циммерман, и я работаю в лаборатории доктора Кевина Лу в Медицинском колледже Джорджии.

Здравствуйте, меня зовут Шелин Ху. Я студентка второго курса и также работаю в лаборатории доктора Лу. Основное преимущество этой методики перед традиционными методами, такими как кривые выживаемости, заключается в том, что эта процедура является как качественной, так и количественной. Применение этих методов может распространяться и на терапию рака, поскольку они имитируют адоптивную иммунотерапию Т-клетками у пациентов с раком.

Итак, давайте начнем: за день до инъекции опухолевых клеток посейте одну колбу T 75 с точностью до 10 до седьмой. CMS четыре метные клетки в 10 миллилитрах среды RPMI, содержащей 10% сыворотки. Для получения быстрорастущих опухолевых клеток инкубируют в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в день инъекции.

Удалите среду и промойте клетки один раз PBS, затем соберите опухолевые клетки с 0,05% трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Остановите реакцию с помощью 10 миллилитров среды RPMI, содержащей 10% сыворотки. Переложите клетки в коническую трубку.

Вращайте ячейки со скоростью 1300 об/мин в центрифуге val legend RT в течение трех минут. При комнатной температуре снять снэт, повторно суспендировать клетки в 10 миллилитрах свежего одного XHB Ss промыть. Затем снова вращайтесь вниз и снова подвешивайте таким же образом.

Подсчитайте количество опухолевых клеток на гемо. Цитометр. Разведите клетки в HBSS так, чтобы клетки, необходимые для каждой инъекции, были ресуспендированы. В общем объеме 100 микролитров согрейте шести-восьминедельных мышей B SEA в стакане, погруженном в теплую воду.

Чтобы расширить хвостовую вену, поместите мышь в ограничитель хвостовой вены на скамейку. С помощью микрошприца введите 100 микролитров опухолевых клеток в боковую хвостовую вену. Используйте септическую технику, чтобы избежать инфицирования после инъекции.

Слегка надавливайте на место инъекции до тех пор, пока кровотечение не остановится. Верните мышь в клетку и дайте опухоли вырасти до нужной стадии. В день переноса проводите пипетку вверх и вниз для ресуспендирования очищенных цитотоксических Т-лимфоцитов или подготовленных CTL.

Как описано в тексте, переложите все ячейки с одной пластины в коническую трубку объемом 15 миллилитров, не допуская, чтобы объем превышал более двух третей трубки. Вставьте стерильную пастеровскую пипетку в коническую пробирку и разделите слоями лимфоциты. Среду или LSM под ячейки до тех пор, пока общий объем не приблизится к 14 миллилитрам.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить слои. Центрифугируйте со скоростью 2000 об/мин в течение 20 минут при комнатной температуре. Не используйте тормоз для замедления ротора после вращения, переведите CTL в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Добавьте HBSS в объеме примерно 10 миллилитров. Для стирки. Подсчитайте клетки, вращайтесь при 1300 об/мин в течение пяти минут При комнатной температуре ресуспендируйте HBSS до необходимой плотности клеток для инъекций.

Сохранение общего объема на одну инъекцию на уровне 100 микролитров. Используйте ту же технику впрыска хвостового впрыска, что и ранее в этом видео. Чтобы ввести CTL мышам с опухолями, верните мышь в клетку и позвольте CTL взаимодействовать с опухолью.

Мышей обычно убивают для анализа через 14-21 день после лечения CTL. Чтобы визуализировать метастазы в легких, положите принесенную в жертву мышь на спину на пенопластовой доске. Закрепите ножки, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к трахее.

Распылите на брюшную сторону 70% этанола, начиная с середины живота. С помощью ножниц разрежьте вдоль средней линии через грудную клетку и вверх к слюноотдельным железам. Обнажите трахею.

Используйте щипцы для удаления тканей, окружающих трахею. Проденьте наконечник пипетки объемом 200 микролитров под трахею, удерживая наконечник одной рукой. Аккуратно поднимите трахею вверх и в сторону от тела.

Поверните платформу на 180 градусов. С помощью шприца объемом 50 миллилитров введите индийские чернила в легкие через трахею. Полностью накачайте легкие чернилами до тех пор, пока не почувствуете сильное сопротивление.

С помощью ножниц разрежьте трахею. Проденьте пару щипцов под легкие и выньте их из мыши. Кратко промойте легкие в литровой стакане с водой в вытяжном шкафу для химикатов.

Переведите в легкие стеклянную установочную желчь, содержащую пять миллилитров раствора FTI. Опухолевая ткань проявится в виде белых узелков на черных легких. Через несколько минут опухоли можно подсчитать и начать принимать раствор FTI на неопределенный срок. Здесь.

Легкие мышам с трансфицированной карциномой молочной железы. На четвертой линии Tone появляются белые пятна, указывающие на опухоли. Мыши, которым трансфицировали IRF с восьми, доминантным отрицательным иммунитетом к K 79 E, демонстрируют повышенный метастатический потенциал опухолевых клеток.

На этих изображениях представлен гистологический анализ эффективности адоптивной трансферной иммунотерапии CTL. У мышей с опухолями, которым вводили физиологический раствор, через шесть дней были обнаружены множественные опухоли, обозначенные стрелками. С другой стороны, мыши, которым вводили опухолеспецифичные Т-клетки, показали уменьшение опухолей в том же эксперименте.

Обработка индийскими чернилами дает более простой способ измерения эффективности адаптивного переноса CTL. Здесь белые опухолевые узелки на легких, несущих опухоль, четко отличают их от легких, которые успешно подверглись адоптивному переносу CTL, а подсчет узелков позволяет провести количественную оценку в такой степени, которая невозможна при гистологии. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать разогревать мышей для более простых и точных инъекций в хвостовую вену.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как оценить эффективность лечения с помощью этой простой процедуры для количественной оценки размера и количества опухолей. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.