Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей

Поколения и характеристику опухоли специфические Т-клетки использованием гуманизированных мышей описано здесь. Человека тимуса ткани и генетически измененных человеческих гемопоэтических стволовых клеток пересаживают в ослабленным иммунитетом мышей. В результате восстановление инженерных человеческой иммунной системы, позволяющей в естественных экспертизы противоопухолевого иммунного ответа.

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании мышей, несущих сконструированную иммунную систему человека. Это достигается путем предварительной подготовки мыши к операции, а затем загрузки троакара кусочком тимуса на втором этапе. Матригель смешивают с CD 34 отрицательными и CD 34 положительными трансдуцированными клетками, а затем смесь добавляют в троакар.

Далее матригельные конструкции пересаживают под капсулу почки. В конечном счете, отторжение целевых опухолей генетически модифицированными CD восемью Т-клетками можно контролировать с помощью визуализации живых домашних животных и физических измерений опухоли. Основное преимущество этой техники перед существующими методами работы с метамфетамином, такими как полностью нейронные модели, заключается в том, что этот метод позволяет изучать развитие генетически модифицированных стволовых клеток человека в тимусе человека и последующее тестирование эффективности in vivo производных линий, демонстрируя эту процедуру, будут три техника из наших лабораторий: Грегори Бристоль, Бернард Левин. и Шон Ким.

На этой схематической диаграмме представлена модифицированная модель BLT, использованная в этих исследованиях для создания химерных мышей, несущих одну конкретную Т-клетку. Имплантат реконструируется из трансдуцированных и нетрансдуцированных клеток CD 34, выделенных из аутологичной печени плода. Затем часть трансдуцированных клеток замораживается и вводится облученным мышам через четыре-шесть недель.

В этом видео демонстрируется имплантация живой конструкции, когда животные становятся вялыми от анестезии. Начните с бритья левой стороны каждой мыши от бедра до плеча между центром спины и животом. После записи веса каждого животного пробейте им уши для нумерации и подкожно введите по 0,3 миллилитра карпрофена в каждое плечо.

Затем уложите мышей на правый бок лицом влево. Теперь промойте троакар иглы для раковых имплантатов 16 калибра с круглым наконечником с помощью PBS. С помощью пары щипцов для игольчатого носа добавьте кусочек тимуса в чашку PBS, а затем удерживая троакар горизонтально с помощью стержня.

Как раз внутрь кончика проходят аспирация тканей. Проталкивание троакара под капсулу почки и введение ткани является одним из самых сложных аспектов этой процедуры. Далее заведите помощника.

С помощью пипетки положительного вытеснения смешайте пять микролитров холодной матрицы в одной пробирке с ячейками при осторожном помешивании. Удержание троакара в горизонтальном положении. Медленно потяните стержень назад, пока помощник пипетирует гель matri

Подмешиваем в троакар для каждой мыши. Сначала промокните голую кожу животного бетадином, а затем протрите ее салфеткой с изопропанолом. Два раза определяют самое темное пятно под кожей, указывающее на расположение селезенки.

Почка находится примерно в пяти миллиметрах дорсально от селезенки с помощью тупых щипцов, чтобы захватить кожу над почкой. Сделайте надрез длиной около 15 миллиметров на коже параллельно селезенке. Сделайте аналогичный разрез в мышечном слое брюшины ниже.

У самцов почка должна быть прямо видна. Просто сожмите живот, чтобы вытащить его. Удерживая давление на живот левой рукой, чтобы держать почку открытой, у женщин сначала используйте кровоостанавливающее средство, чтобы поднять яичник, а затем вытащите почку, чтобы помочь сохранить орган вне тела.

Выщипните небольшое отверстие в заднем конце капсулы почки, а затем вставьте троакар в это отверстие и вдоль почки до тех пор, пока отверстие троакара не будет полностью покрыто капсулой почки. Затем с помощью мизинца правой руки введите ткань. Теперь с помощью закрытого кровоостанавливателя аккуратно протолкните почку на место.

Завяжите один стежок в области брюшины двойным бантом, сжимая кожу вверх, как кошелек, а затем положите ее в два зажима для раны. Наконец, нанесите по капле PBS на каждый глаз и положите мышь на бок в клетку поверх подстилки. После имплантации всех мышей таким же образом, убедитесь, что животные вернулись к лежанию на животе, прежде чем покинуть их.

На этом первом рисунке показано репрезентативное изображение живого имплантата THI у гуманизированных мышей. На этом рисунке показано нормальное развитие ткани тимуса и физиологическое распределение в тканях человека CD 4 и CD 8 положительного тестостерона. После восстановления животные несут человеческую иммунную систему с нормальным распределением CD 4 и CD 8 положительных Т-клеток.

Здесь показано репрезентативное изображение мыши, несущей опухоль меланомы. Серыми областями обозначено изображение компьютерной томографии. Цветные участки указывают на метаболическую активность опухоли, обнаруженную с помощью ПЭТ-сканирования.

Только компьютерная томография в этом эксперименте показала большое опухолевое образование в области, обозначенной белым кругом. Однако, как показывает ПЭТ-визуализация in vivo, эта область в основном состоит из некротизированной и рубцовой ткани, что подчеркивает полезность ПЭТ-визуализации как более чувствительного и точного способа оценки регрессии и клиренса опухоли. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, такие как Т-клеточный, фенотипирование и активация ex vivo, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к функции Т-клеток.