Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей
18 декабря 2012 г.
Поколения и характеристику опухоли специфические Т-клетки использованием гуманизированных мышей описано здесь. Человека тимуса ткани и генетически измененных человеческих гемопоэтических стволовых клеток пересаживают в ослабленным иммунитетом мышей. В результате восстановление инженерных человеческой иммунной системы, позволяющей в естественных экспертизы противоопухолевого иммунного ответа.
Общая цель следующего эксперимента заключается в создании мышей, несущих сконструированную иммунную систему человека. Это достигается путем предварительной подготовки мыши к операции, а затем загрузки троакара кусочком тимуса на втором этапе. Матригель смешивают с CD 34 отрицательными и CD 34 положительными трансдуцированными клетками, а затем смесь добавляют в троакар.
Далее матригельные конструкции пересаживают под капсулу почки. В конечном счете, отторжение целевых опухолей генетически модифицированными CD восемью Т-клетками можно контролировать с помощью визуализации живых домашних животных и физических измерений опухоли. Основное преимущество этой техники перед существующими методами работы с метамфетамином, такими как полностью нейронные модели, заключается в том, что этот метод позволяет изучать развитие генетически модифицированных стволовых клеток человека в тимусе человека и последующее тестирование эффективности in vivo производных линий, демонстрируя эту процедуру, будут три техника из наших лабораторий: Грегори Бристоль, Бернард Левин. и Шон Ким.
На этой схематической диаграмме представлена модифицированная модель BLT, использованная в этих исследованиях для создания химерных мышей, несущих одну конкретную Т-клетку. Имплантат реконструируется из трансдуцированных и нетрансдуцированных клеток CD 34, выделенных из аутологичной печени плода. Затем часть трансдуцированных клеток замораживается и вводится облученным мышам через четыре-шесть недель.
В этом видео демонстрируется имплантация живой конструкции, когда животные становятся вялыми от анестезии. Начните с бритья левой стороны каждой мыши от бедра до плеча между центром спины и животом. После записи веса каждого животного пробейте им уши для нумерации и подкожно введите по 0,3 миллилитра карпрофена в каждое плечо.
Затем уложите мышей на правый бок лицом влево. Теперь промойте троакар иглы для раковых имплантатов 16 калибра с круглым наконечником с помощью PBS. С помощью пары щипцов для игольчатого носа добавьте кусочек тимуса в чашку PBS, а затем удерживая троакар горизонтально с помощью стержня.
Как раз внутрь кончика проходят аспирация тканей. Проталкивание троакара под капсулу почки и введение ткани является одним из самых сложных аспектов этой процедуры. Далее заведите помощника.
С помощью пипетки положительного вытеснения смешайте пять микролитров холодной матрицы в одной пробирке с ячейками при осторожном помешивании. Удержание троакара в горизонтальном положении. Медленно потяните стержень назад, пока помощник пипетирует гель matri
.Подмешиваем в троакар для каждой мыши. Сначала промокните голую кожу животного бетадином, а затем протрите ее салфеткой с изопропанолом. Два раза определяют самое темное пятно под кожей, указывающее на расположение селезенки.
Почка находится примерно в пяти миллиметрах дорсально от селезенки с помощью тупых щипцов, чтобы захватить кожу над почкой. Сделайте надрез длиной около 15 миллиметров на коже параллельно селезенке. Сделайте аналогичный разрез в мышечном слое брюшины ниже.
У самцов почка должна быть прямо видна. Просто сожмите живот, чтобы вытащить его. Удерживая давление на живот левой рукой, чтобы держать почку открытой, у женщин сначала используйте кровоостанавливающее средство, чтобы поднять яичник, а затем вытащите почку, чтобы помочь сохранить орган вне тела.
Выщипните небольшое отверстие в заднем конце капсулы почки, а затем вставьте троакар в это отверстие и вдоль почки до тех пор, пока отверстие троакара не будет полностью покрыто капсулой почки. Затем с помощью мизинца правой руки введите ткань. Теперь с помощью закрытого кровоостанавливателя аккуратно протолкните почку на место.
Завяжите один стежок в области брюшины двойным бантом, сжимая кожу вверх, как кошелек, а затем положите ее в два зажима для раны. Наконец, нанесите по капле PBS на каждый глаз и положите мышь на бок в клетку поверх подстилки. После имплантации всех мышей таким же образом, убедитесь, что животные вернулись к лежанию на животе, прежде чем покинуть их.
На этом первом рисунке показано репрезентативное изображение живого имплантата THI у гуманизированных мышей. На этом рисунке показано нормальное развитие ткани тимуса и физиологическое распределение в тканях человека CD 4 и CD 8 положительного тестостерона. После восстановления животные несут человеческую иммунную систему с нормальным распределением CD 4 и CD 8 положительных Т-клеток.
Здесь показано репрезентативное изображение мыши, несущей опухоль меланомы. Серыми областями обозначено изображение компьютерной томографии. Цветные участки указывают на метаболическую активность опухоли, обнаруженную с помощью ПЭТ-сканирования.
Только компьютерная томография в этом эксперименте показала большое опухолевое образование в области, обозначенной белым кругом. Однако, как показывает ПЭТ-визуализация in vivo, эта область в основном состоит из некротизированной и рубцовой ткани, что подчеркивает полезность ПЭТ-визуализации как более чувствительного и точного способа оценки регрессии и клиренса опухоли. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, такие как Т-клеточный, фенотипирование и активация ex vivo, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к функции Т-клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описываются методы получения и характеристики опухоль-специфических T-клеток с использованием гуманизированных мышей. Процесс включает трансплантацию тканей тимуса человека и генетически модифицированных гемопоэтических стволовых клеток человека иммунодефицитным мышам, что приводит к восстановлению иммунной системы человека для исследования противоопухолевых иммунных ответов in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Онкология
- Трансляционная медицина
Теоретические сведения
- Гуманизированные мышиные модели незаменимы для изучения иммунных ответов человека.
- Генетически модифицированные Т-клетки могут эффективно воздействовать на опухоли.
- Существующие методы могут недостаточно точно имитировать взаимодействия иммунной системы человека.
- Данное исследование направлено на углубление понимания противоопухолевых ответов.
Цель исследования
- Для создания мышей с модифицированной иммунной системой человека.
- Для мониторинга эффективности генетически модифицированных Т-клеток CD8 в борьбе с опухолями.
- Для изучения особенностей развития стволовых клеток человека в тимусе.
Используемые методы
- Подготовка мыши к хирургическим процедурам.
- Трансплантация ткани тимуса, смешанной с трансдуцированными CD34-отрицательными и CD34-положительными клетками.
- Использование Matrigel для создания трансплантата.
- Мониторинг отторжения опухоли с помощью ПЭТ-визуализации в реальном времени и физических измерений.
Основные результаты
- Успешное получение мышей с функциональной иммунной системой человека.
- Эффективный мониторинг отторжения опухоли модифицированными T-клетками.
- Демонстрация преимуществ данного метода по сравнению с существующими моделями.
- Изучение особенностей развития стволовых клеток человека in vivo.
Выводы
- Данный метод позволяет проводить углубленное изучение иммунных ответов человека.
- Он предоставляет платформу для тестирования противоопухолевой терапии.
- Будущее применение может способствовать более глубокому пониманию динамики иммунной системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Гуманизированная мышиная модель BLT позволяет проводить прогностическую оценку генной терапии на основе стволовых клеток и функций модифицированных Т-клеток в физиологически релевантном контексте иммунной системы человека. Данная платформа восполняет критический пробел в доклинических исследованиях в области онкологии и иммунотерапии, обеспечивая возможность оценки развития иммунных клеток человека, таргетирования опухолей и терапевтической эффективности in vivo. Ее интеграция повышает уверенность в трансляционном потенциале и снижает риски при принятии решений на ранних этапах разработки портфеля программ клеточной и генной терапии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием модифицированных иммунных клеток человека in vivo.
- Способствует снижению биологических рисков за счет моделирования развития и функций иммунных клеток человека.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для опухолеспецифических Т-клеточных рецепторов.
- Повышает прогностическую достоверность при разработке клеточной иммунотерапии.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для количественной оценки противоопухолевой активности.
- Позволяет проводить воспроизводимое измерение регрессии опухоли с помощью ПЭТ-визуализации живых объектов.
- Поддерживает стандартизацию фенотипирования иммунных клеток и функциональных анализов после трансплантации.
- Создает надежную платформу для оценки генно-модифицированной клеточной терапии перед клиническим внедрением.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным для заболевания взаимодействиям между иммунной системой и опухолью человека для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывный переход от этапа открытия к доклинической валидации методов терапии с использованием модифицированных иммунных клеток.
- Поддерживает продвижение с учетом рисков, предоставляя данные о механизмах действия и эффективности in vivo.
- Позволяет оценить элиминацию опухоли и персистенцию иммунных клеток в гуманизированном контексте.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель служит связующим звеном между этапами раннего поиска, идентификации ведущих соединений и доклинической валидации кандидатов для клеточной и генной терапии рака и иммунных расстройств.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о функции модифицированных Т-клеток и их способности нацеливаться на опухоль in vivo.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные данные ПЭТ-визуализации и измерения размеров опухоли для оценки кандидатов.
- Аналитика: Обеспечивает надежные показатели фенотипирования иммунных клеток и оценки их функционального состояния после приживления.
- Трансляционные исследования: Связывает данные об эффективности in vivo с биомаркерами и механистическими конечными точками, имеющими значение для клинического внедрения.
- Корпоративное повторное использование: Создает многоразовую платформу для итерационного тестирования терапии генно-модифицированными иммунными клетками.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность при разработке иммунотерапии клеточными препаратами.
- Операционная ценность: Стандартизирует тестирование эффективности in vivo и поддерживает масштабируемые, воспроизводимые рабочие процессы.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективно управлять капиталом в рамках портфеля.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов в области клеточной и генной терапии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с манипуляциями на стволовых клетках человека и проведением операций на иммунодефицитных мышах.
- Необходим доступ к ПЭТ-визуализации и современной инфраструктуре для содержания животных.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- При необходимости следует адаптировать протоколы для различных моделей опухолей и стратегий генетической модификации.
- Соблюдение требований по биологической безопасности и благополучию животных в связи с использованием тканей человека и иммунокомпрометированных организмов.
