Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей
18 декабря 2012 г.
Поколения и характеристику опухоли специфические Т-клетки использованием гуманизированных мышей описано здесь. Человека тимуса ткани и генетически измененных человеческих гемопоэтических стволовых клеток пересаживают в ослабленным иммунитетом мышей. В результате восстановление инженерных человеческой иммунной системы, позволяющей в естественных экспертизы противоопухолевого иммунного ответа.
Общая цель следующего эксперимента заключается в создании мышей, несущих сконструированную иммунную систему человека. Это достигается путем предварительной подготовки мыши к операции, а затем загрузки троакара кусочком тимуса на втором этапе. Матригель смешивают с CD 34 отрицательными и CD 34 положительными трансдуцированными клетками, а затем смесь добавляют в троакар.
Далее матригельные конструкции пересаживают под капсулу почки. В конечном счете, отторжение целевых опухолей генетически модифицированными CD восемью Т-клетками можно контролировать с помощью визуализации живых домашних животных и физических измерений опухоли. Основное преимущество этой техники перед существующими методами работы с метамфетамином, такими как полностью нейронные модели, заключается в том, что этот метод позволяет изучать развитие генетически модифицированных стволовых клеток человека в тимусе человека и последующее тестирование эффективности in vivo производных линий, демонстрируя эту процедуру, будут три техника из наших лабораторий: Грегори Бристоль, Бернард Левин. и Шон Ким.
На этой схематической диаграмме представлена модифицированная модель BLT, использованная в этих исследованиях для создания химерных мышей, несущих одну конкретную Т-клетку. Имплантат реконструируется из трансдуцированных и нетрансдуцированных клеток CD 34, выделенных из аутологичной печени плода. Затем часть трансдуцированных клеток замораживается и вводится облученным мышам через четыре-шесть недель.
В этом видео демонстрируется имплантация живой конструкции, когда животные становятся вялыми от анестезии. Начните с бритья левой стороны каждой мыши от бедра до плеча между центром спины и животом. После записи веса каждого животного пробейте им уши для нумерации и подкожно введите по 0,3 миллилитра карпрофена в каждое плечо.
Затем уложите мышей на правый бок лицом влево. Теперь промойте троакар иглы для раковых имплантатов 16 калибра с круглым наконечником с помощью PBS. С помощью пары щипцов для игольчатого носа добавьте кусочек тимуса в чашку PBS, а затем удерживая троакар горизонтально с помощью стержня.
Как раз внутрь кончика проходят аспирация тканей. Проталкивание троакара под капсулу почки и введение ткани является одним из самых сложных аспектов этой процедуры. Далее заведите помощника.
С помощью пипетки положительного вытеснения смешайте пять микролитров холодной матрицы в одной пробирке с ячейками при осторожном помешивании. Удержание троакара в горизонтальном положении. Медленно потяните стержень назад, пока помощник пипетирует гель matri
.Подмешиваем в троакар для каждой мыши. Сначала промокните голую кожу животного бетадином, а затем протрите ее салфеткой с изопропанолом. Два раза определяют самое темное пятно под кожей, указывающее на расположение селезенки.
Почка находится примерно в пяти миллиметрах дорсально от селезенки с помощью тупых щипцов, чтобы захватить кожу над почкой. Сделайте надрез длиной около 15 миллиметров на коже параллельно селезенке. Сделайте аналогичный разрез в мышечном слое брюшины ниже.
У самцов почка должна быть прямо видна. Просто сожмите живот, чтобы вытащить его. Удерживая давление на живот левой рукой, чтобы держать почку открытой, у женщин сначала используйте кровоостанавливающее средство, чтобы поднять яичник, а затем вытащите почку, чтобы помочь сохранить орган вне тела.
Выщипните небольшое отверстие в заднем конце капсулы почки, а затем вставьте троакар в это отверстие и вдоль почки до тех пор, пока отверстие троакара не будет полностью покрыто капсулой почки. Затем с помощью мизинца правой руки введите ткань. Теперь с помощью закрытого кровоостанавливателя аккуратно протолкните почку на место.
Завяжите один стежок в области брюшины двойным бантом, сжимая кожу вверх, как кошелек, а затем положите ее в два зажима для раны. Наконец, нанесите по капле PBS на каждый глаз и положите мышь на бок в клетку поверх подстилки. После имплантации всех мышей таким же образом, убедитесь, что животные вернулись к лежанию на животе, прежде чем покинуть их.
На этом первом рисунке показано репрезентативное изображение живого имплантата THI у гуманизированных мышей. На этом рисунке показано нормальное развитие ткани тимуса и физиологическое распределение в тканях человека CD 4 и CD 8 положительного тестостерона. После восстановления животные несут человеческую иммунную систему с нормальным распределением CD 4 и CD 8 положительных Т-клеток.
Здесь показано репрезентативное изображение мыши, несущей опухоль меланомы. Серыми областями обозначено изображение компьютерной томографии. Цветные участки указывают на метаболическую активность опухоли, обнаруженную с помощью ПЭТ-сканирования.
Только компьютерная томография в этом эксперименте показала большое опухолевое образование в области, обозначенной белым кругом. Однако, как показывает ПЭТ-визуализация in vivo, эта область в основном состоит из некротизированной и рубцовой ткани, что подчеркивает полезность ПЭТ-визуализации как более чувствительного и точного способа оценки регрессии и клиренса опухоли. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, такие как Т-клеточный, фенотипирование и активация ex vivo, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к функции Т-клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описываются методы генерации и характеристики опухолеспецифических T-клеток с использованием гуманизированных мышей. Процесс включает трансплантацию ткани человеческого тимуса и генетически модифицированных гемопоэтических стволовых клеток человека иммунодефицитным мышам, что приводит к восстановлению иммунной системы человека для исследования противоопухолевых иммунных ответов in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Онкология
- Трансляционная медицина
Теоретические сведения
- Гуманизированные мышиные модели имеют важное значение для изучения иммунных ответов человека.
- Генетически модифицированные Т-клетки могут эффективно воздействовать на опухоли.
- Существующие методы могут недостаточно точно имитировать взаимодействия иммунной системы человека.
- Данное исследование направлено на углубление понимания противоопухолевых ответов.
Цель исследования
- Создание мышей с модифицированной иммунной системой человека.
- Мониторинг эффективности генетически модифицированных CD8 T-клеток в борьбе с опухолями.
- Изучение особенностей развития стволовых клеток человека в тимусе.
Используемые методы
- Подготовка мыши к хирургическим процедурам.
- Трансплантация ткани тимуса, смешанной с трансдуцированными CD34-отрицательными и CD34-положительными клетками.
- Использование Matrigel для создания трансплантата.
- Мониторинг отторжения опухоли с помощью ПЭТ-визуализации в реальном времени и физических измерений.
Основные результаты
- Успешное создание мышей с функциональной иммунной системой человека.
- Эффективный мониторинг отторжения опухоли модифицированными Т-клетками.
- Демонстрация преимуществ данного метода по сравнению с существующими моделями.
- Данные о развитии стволовых клеток человека in vivo.
Выводы
- Данный метод позволяет проводить углубленное изучение иммунных ответов человека.
- Он служит платформой для тестирования противоопухолевой терапии.
- Последующее применение метода может расширить понимание динамики иммунной системы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Гуманизированная модель мыши BLT позволяет проводить прогностическую оценку генной терапии на основе стволовых клеток и функции модифицированных Т-клеток в физиологически релевантном контексте иммунной системы человека. Данная платформа восполняет критический пробел в доклинических исследованиях в области онкологии и иммунотерапии, обеспечивая возможность оценки развития иммунных клеток человека, таргетирования опухоли и терапевтической эффективности in vivo. Ее интеграция повышает уверенность в трансляционном потенциале и снижает риски при принятии решений на ранних этапах разработки программ клеточной и генной терапии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием модифицированных иммунных клеток человека in vivo.
- Способствует снижению биологических рисков путем моделирования развития и функционирования иммунных клеток человека.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для опухолеспецифических T-клеточных рецепторов.
- Повышает прогностическую достоверность при разработке клеточной иммунотерапии.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для количественной оценки противоопухолевой активности.
- Позволяет воспроизводимо измерять регрессию опухоли с помощью ПЭТ-визуализации живых объектов.
- Обеспечивает стандартизацию фенотипирования иммунных клеток и функциональных анализов после приживления трансплантата.
- Создает надежную платформу для оценки генно-модифицированной клеточной терапии перед клиническим внедрением.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует значимым для заболевания взаимодействиям между иммунной системой и опухолью человека для трансляционного поиска биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации методов терапии с использованием модифицированных иммунных клеток.
- Поддерживает продвижение проекта с учетом рисков, предоставляя данные о механизмах действия и эффективности in vivo.
- Позволяет оценить элиминацию опухоли и персистенцию иммунных клеток в гуманизированном контексте.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель обеспечивает переход от этапа первичного поиска к идентификации ведущих соединений и доклинической валидации кандидатов для клеточной и генной терапии рака и иммунных расстройств.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о функционировании модифицированных T-клеток и их способности воздействовать на опухоль in vivo.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные данные ПЭТ-визуализации и измерения размеров опухоли для оценки кандидатов.
- Аналитика: Предоставляет надежные показатели для фенотипирования иммунных клеток и оценки их функционального состояния после приживления.
- Трансляционные исследования: Связывает данные об эффективности in vivo с биомаркерами и механистическими конечными точками, имеющими значение для клинического внедрения.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для итерационного тестирования методов терапии с применением генно-модифицированных иммунных клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при разработке иммунотерапии на основе клеточных продуктов.
- Операционная ценность: Стандартизирует тестирование эффективности in vivo и поддерживает масштабируемые, воспроизводимые рабочие процессы.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и осуществлять экономически эффективное управление портфелем.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов в области клеточной и генной терапии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с человеческими стволовыми клетками и проведение хирургических операций на иммунодефицитных мышах.
- Необходим доступ к ПЭТ-визуализации и современной инфраструктуре для содержания животных.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- При необходимости следует адаптировать протоколы для различных моделей опухолей и стратегий генетической модификации.
- В связи с использованием человеческих тканей и иммунокомпрометированных организмов предъявляются требования по биобезопасности и благополучию животных.
