Устные Администрации Ротенон использованием принудительного кормления и анализ изображений Альфа-синуклеина включений в кишечной нервной системы

Симптомы болезни Паркинсона, включая двигательную и речевую дисфункцию, являются результатом снижения активности клеток, секретирующих дофамин в мозге. Энтеральная нервная система и обонятельная луковица являются наиболее подверженными воздействию нервными структурами и первыми поражаются. Болезнь Паркинсона была связана с воздействием пестицидов.

Для того чтобы проанализировать воздействие пестицидов на энтеральную нервную систему, мышам вводят пестицид рун через зонд. Затем мышам внутрисердечно перфузируют 4% параформом, альдегидным мозгом и энтеральной нервной системой. Ткань извлекают, подготавливают и иммуноокрашивают для белков, ассоциированных с PD.

Изображения бета-3 тубулина и альфа-синуклеина, полученные с помощью конфокальной микроскопии, демонстрируют накопление альфа-синуклеина в нейронах энтеральной нервной системы у животных, подвергшихся воздействию пестицидов. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как системное введение ротенона, заключается в том, что при использовании этой методики гарантируется, что действие ротенона ограничивается энтеральной нервной системой. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы болезни Паркинсона, такие как ее этиология и механизмы, лежащие в основе ее прогрессирования.

Последствия этого метода расширяют башенную терапию и диагностику болезни Паркинсона, поскольку они позволят разработать новые терапевтические мишени и методы диагностики. Хотя этот метод может дать представление о патофизиологии болезни Паркинсона, он также может быть применен к другим системам, таким как изучение влияния других токсинов окружающей среды на кишечную, симпатическую и парасимпатическую нервную системы, а также на стенку кишечника. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что требуется время, чтобы освоить зонд.

Впервые у меня появилась идея об этих методах, когда я прочитал о связи между пестицидами и болезнью Паркинсона. Также было полезно увидеть конференцию по высоким CORAs на Всемирном конгрессе Паркинсона в Берлине в 2005 году. Мирная демонстрация этого метода необходима.

Метод администрирования с помощью зонда сложен, так как у мышей анатомия отличается от человеческой с другой стороны, анализ изображений был выполнен с индивидуальными шагами для этих изображений. Начните протокол с взвешивания животного. Рассчитайте подходящий объем ротенона.

На грамм веса животного необходимо 0,01 миллитра, что соответствует дозе в пять миллиграммов на килограмм руна. Зарядите одномиллилитровый шприц раствором Roone, затем зарядите второй шприц раствором автомобиля. Возьмите в руки мышку и держите хвост мыши одной рукой.

Растяните кожу шеи, потянув за нее первыми двумя пальцами другой руки. Как только головка будет зафиксирована между двумя пальцами, прислоните ее к ладони и переверните вверх ногами. Зафиксируйте хвост.

Используя четвертый и пятый пальцы, держа голову в направлении назад, надавите на нёбо, чтобы открыть рот мыши. Аккуратно введите зонд в рот. Медленно двигайте полость в направлении желудка до тех пор, пока она не будет введена на всю длину.

Во избежание попадания материала в легкие вводите раствор руна или транспортное средство, осторожно нажимая на эмбол. Когда закончите, медленно извлеките зонд, поместите животное обратно в другую клетку, пока все животные из одной клетки не закончат. После лечения мышам внутрисердечно профункционируют 4%-ным параформным альдегидом.

При PBS кишки затем извлекаются путем вскрытия и помещаются в 15% сахарозу на ночь. На следующий день ткань переносят до 30% сахарозы и снова инкубируют в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем ткань помещают в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия и хранят до использования с помощью криостата кишечника 20 микрон.

Поперечные срезы переносятся на ростростные стекла, процедуры блокирования и иммуноокрашивания. Затем проводится работа с использованием антител к бета-3 тубулину и антифа-синуклеину. Рекомендуется, чтобы стороннее лицо выполнило слепой анализ данных.

Чтобы начать анализ, откройте программное обеспечение Fiji. Откройте файл конфокального изображения. Затем разделите каналы так, чтобы максимально можно было работать над каждым каналом самостоятельно.

Закройте те каналы, которые не будут использоваться, и выделите, проанализируйте, зададите, масштабируйте и установите размер пикселя равным единице. Установите известное расстояние на 0.13 и нажмите на глобальное. Размер изображения теперь будет отображаться в микронах.

Выберите альфа-синуклеиновый канал и выберите ганглий. Следим за тем, чтобы выделение заключало в себе ганглий во всех срезах. Дублируйте изображение с выбранным ганглием, будет дублироваться только изображение, размер с ганглий будет дублироваться.

Нажмите кнопку «Редактировать очистить» за пределами выделенной области часть изображения станет черной. Повторите повторное дублирование изображения, чтобы определить, насколько хорошо прошла процедура. Изображения с низким соотношением сигнал/фоновый шум не следует использовать для анализа изображений.

Выберите порог настройки изображения. Затем выберите максимальную энтропию. Затем двигайтесь по срезам на обрезанном изображении и исходном, чтобы убедиться, что процедура прошла хорошо.

Порог тропики выбирает уровень сигнала интенсивности на основе гистограммы изображения, и только те пиксели с интенсивностью выше этого порога будут отображаться в процессе выбора изображения белым поверх черного. Затем нажмите на smooth. Этот шаг преобразует пиксельные края изображений в процесс выделения плавных краев.

Затем нажмите на двоичный файл и выберите Сделать двоичным. Изображение будет отображаться в виде дубликата изображения черным по белому для выполнения следующего шага на дублированном изображении, нажмите на анализ, анализ частиц. Затем выберите «Показать контуры» и нажмите «Суммировать».

Остальная часть настройки должна быть оставлена по умолчанию. Эта функция распознает общее количество пикселей с сигналом и те, которые сгруппированы вместе, общую поверхность пикселей с сигналом. Кроме того, указывается количество групп пикселей и средний размер.

Сравните и выберите срез с наибольшей общей площадью, который хорошо корректируется. Срез будет помечен. Скопируйте таблицу данных с указанием общей поверхности альфа-синуклеина, количества включений и среднего размера частиц.

Вставьте данные в таблицу Excel или добавьте примечания в другое место. Возвращение на Фиджи. Найдите предыдущий выбранный срез в канале бета-тубулина и выберите его.

Выделите область ганглия и нажмите на кнопку «Анализировать». Затем выберите «Измерить». Появится еще одна таблица, показывающая общую поверхность ганглия.

Извлеките данные из таблицы в таблицу Excel рядом с измерением альфа-синуклеина или скопируйте их в другое место с помощью Excel. Разделите различные параметры, полученные при измерении альфа-синуклеина, по поверхности ганглия, чтобы получить общую поверхность альфа-синуклеина и число включений, нормализованное по размеру ганглии Чтобы проанализировать эффекты местного действия роона на энтеральную нервную систему, пять миллиграммов на килограмм известного пестицида гнили были введены через пероральный зонд 1-летним мышам C 57 black six. Показанная здесь хроматограмма показывает наличие известного пика ротана через час после введения контрольной группы у мышей, получавших 20 мг на килограмм ротенона 10 и 5 мг на килограмм ротенона.

Уровни ротенона определяли для экстракции крови и мозга и ствола мозга с помощью ВЭЖХ, как показано здесь. Введение пяти мг на килограмм гнилого перорального зонда не приводит к измеримым уровням в крови через один, два или три часа после лечения, как это определено H. plc. На этом графике показаны уровни гниения в головном мозге и стволе мозга обработанных мышей.

Через час после экстракции введение 10 мг на килограмм или менее ротенона показало отсутствие уровней ротона в образцах мозга или ствола мозга. Через час после введения митохондриального комплекса была оценена одна активность в образцах мышц и мозга мышей, получавших лечение в течение 1,5 месяцев. Достоверной разницы между группами не наблюдалось ингибирования митохондриального комплекса, что подтверждает отсутствие рона в этих областях.

Анализ болезни Паркинсона, альфа-синуклеина компонента тельца Леви после введения рона позволяет достоверно определить общее поверхностное количество альфа-синуклеина, наличие включений альфа-синуклеина и рисунок альфа-синуклеина в клетке. На этом рисунке показано окрашивание антибета-3 тубулина, альфа-синуклеина и DAPI в срезах двенадцатиперстной кишки и подвздошной кишки, как можно увидеть здесь. 1,5-месячное лечение тараканом индуцировало повышенный паттерн альфа-синуклеина в ганглиях кишечной нервной системы, даже один по сравнению с трехмесячным контролем.

Этот рисунок можно наблюдать как в подвздошной, так и в двенадцатиперстной кишке. Через три месяца лечения можно наблюдать образование более крупных включений альфа-синуклеина. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антиальфа-синуклеина, теофа, флавина и DPI демонстрирует агрегацию более крупных скоплений альфа-синуклеина только через три месяца. Этот эксперимент был проанализирован с использованием методов автоматической сегментации и пороговых значений на основе энтропии.

На графике слева каждый столбец представляет общую площадь поверхности альфа-синуклеина до поверхности ганглия. На графике справа каждый столбец представляет общее количество включений альфа-синуклеина на взятую поверхность ганглия. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что местное введение ротенона индуцирует фосфорилирование, накопление и агрегацию альфа-синуклеина с глиозом в ганглиях энтеральной нервной системы.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно вводить зонд аккуратно, а если будут обнаружены какие-либо препятствия, лучше вытащить его и ввести снова, следуя этим процедурам. Могут быть выполнены и другие методы, такие как ВЭЖХ, иммуноокрашивание и анализ изображений. Это даст возможность проанализировать другие участки, воздействие вещества или даже наличие вещества в крови после его развития.

Этот метод проложил путь нейробиологам к исследованию воздействия нейротоксинов окружающей среды на энтеральную нервную систему. После просмотра этого видео вы должны быть в состоянии правильно применять датчик и анализировать изображения, полученные в результате иммунохимии. Не забывайте, что работа с гнилью может быть крайне опасной.

Поэтому мы рекомендуем использовать перчатки и маски во время выполнения этой процедуры. Тем.