Выражение, детергентов солюбилизации и очистки Мембранные Transporter, сопротивление MexB множественной лекарственной белка

Чтобы очистить мембранный белок Mex B, Mex B сначала экспрессируется в кишечной палочке с использованием методов рекомбинантной ДНК. Затем мембраны изолируют, и мембранные белки растворяют с помощью мягкого моющего средства. Белок солюбилизированной мембраны очищается с помощью iMac, а белок дополнительно очищается с помощью гелевой фильтрационной хроматографии.

Уровень очистки белка определяют с помощью электрофореза SDS poly ACRYLAMIDE Gel. Хотя эта процедура может дать представление о трансмембранных транспортерах с множественной лекарственной устойчивостью, она также может быть применена к другим мембранным белкам, демонстрируя, что сегодняшние процедуры будут сформированы аспирантом из моей лаборатории. Для этой процедуры Mex B из pseudomonas Aosa будет субклонирован в вектор экспрессии PET 30 B plus, так что Mex B экспрессируется с помощью С-концевой HEXA гистаминовой метки. Начните с вечера с инокуляции четырех трехмиллилитровых банок мициновых культур свежими трансформантами или используйте замороженный запас, выращивайте культуры на валике при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи утром.

Используйте ночные культуры для инокуляции 150 миллилитров LB, содержащих 30 микрограммов на миллилитр. Можно ли выращивать Мицин при температуре 37 градусов по Цельсию на шейкере во второй половине дня? Используйте маленькую культуру для инокуляции шесть раз по одному литру, две среды XYT, содержащие 30 микрограммов на миллилитр.

Может ли мицин в колбах с папоротниковой спинкой? Используйте 25 миллилитров на культуру для разведения от одного до 40. Выращивайте культуры при температуре 37 градусов Цельсия, пока они не достигнут оптической плотности.

600 от 0,4 до 0,6, около 1,5 часов. Когда культуры достигнут нужной плотности, индуцируйте экспрессию белка, добавив 0,5 миллилитра одного моляра. ИПТГ. Поместите все колбы обратно в шейкер и продолжайте выращивать их при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи до сбора бактерий на следующее утро.

Достаньте культуры из шейкера и охладите их. Затем, чтобы собрать клетки, перенесите культуры в центрифужные пробирки и центрифугируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут со скоростью 5000 оборотов в минуту в большой центрифуге, пока клетки центрифугируются. Дополните 100 миллилитров буфера клеточной суспензии ДНК, ингибиторами протеазы и лизоцимом.

Также дополните две аликвоты мембранного буфера суспензией Resus ингибиторами протеазы, как показано в этой таблице. Держите все три раствора на льду после завершения центрифугирования. Ресус проводят клеточные гранулы в 100 миллилитрах клеточного ресуспензионного буфера.

Далее извлеките клетки. Суспензия ячейки загружается во французскую напорную камеру и ячейка помещается на френч-пресс. Давление прикладывается до тех пор, пока оно не достигнет 12 000 фунтов на квадратный дюйм.

Клапан открывается на очень маленькую величину, чтобы сломанные ячейки просачивались наружу. Важно не открывать клапан слишком сильно и не давать ячейкам вырваться наружу, потому что они будут высвобождены при слишком малом давлении и не будут эффективно разрушены. Соберите клеточный лизат в бутылку, хранящую холодом на льду.

Пропустите раствор ячейки через французскую ячейку давления со скоростью 12 000 фунтов на квадратный дюйм. Переносите лизат клеток в центрифужные пробирки SS 34 и центрифугу для удаления клеточного мусора со скоростью 10 000 оборотов в минуту в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия в роторе SS 34. Далее идет осветленный лизат.

Используется для приготовления мембранной фракции. Осторожно переложите супинат в ti. 6 4, 7 0,5 ультра центрифуга, центрифуга в роторе TI 6 4 7 0,5 при 40 000 оборотах в минуту в течение 50 минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте супинат. С помощью пипетки мягко ресуспендируйте гранулу, которая содержит клеточные мембраны примерно в 25 миллилитрах мембранного буфера Resus, перенесите мембранную суспензию в чистую центрифужную пробирку и центрифугу наберите в ротор TI I 6 4 7 0,5 по 40 000 оборотов в минуту в течение 50 минут при температуре четыре градуса Цельсия и ресуспендируйте промытую мембранную палитру в 25 миллилитрах мембранного буфера для суспензии Resus. Далее солюбилизируйте мембранные белки до ресуспендированных мембран в дозе около 25 миллилитров.

Добавьте шесть миллилитров 10% ДДМ так, чтобы конечная концентрация моющего средства составила 2% ДДМ, раскачайте смесь при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов после двухчасовой инкубации в присутствии центрифуги ДДМ, смесь со скоростью 40 000 оборотов в минуту в течение 40 минут при четырех градусах Цельсия в роторе TI I 6 4 7 0,5. Для того, чтобы отделить растворимые белки в моющих комплексах от нерастворимых белков. Сохраните лежачий натант, содержащий моющие комплексы белка Mex B, для использования в очистной смеси лежачий натант, содержащий моющие комплексы белка Mex B с двумя миллилитрами аффинных гранул lon metal, уравновешенных в буфере суспензии Resus, инкубировать в течение одного часа на ролике при четырех градусах Цельсия после связывания белков со смолой.

Залейте суспензию в корпус колонны самотечного потока и отбросьте поток. После завершения промывки колонки промойте колонку 20 миллилитрами или 10 томами переплета iMac и буфером для промывки. Разбавьте связанные белки 10 миллилитрами элюирующего буфера iMac.

Возьмите по 10 микролитров проб каждой фракции элюирования. Смешайте с 10 микролитрами образца двукратного паспорта безопасности, буферизуйте и проанализируйте на 10% полиакриламиде. Гель SDS.

Оцените количество и чистоту mex B в каждой фракции. Вытащите фракции, содержащие моющие комплексы белка Mex B, и сконцентрируйте их в спиновом концентраторе при температуре четыре градуса Цельсия. Будьте осторожны, чтобы белок не выпал в осадок на этом этапе.

Используйте несколько коротких вращений и следите за осадками. После каждого отжима приступают к очищению объединенных фракций с помощью колонки для фильтрации геля. Предварительно уравновесьте супер розу 12 HL 30 над 10 столбиком с 24 миллилитрами работающего буфера и дождитесь плоской базовой линии.

Далее промойте загрузочный контур системы актора с работающим буфером. Перед нанесением белка на колонку процедите белковый раствор с помощью шприцевого фильтра. Затем загрузите в колонку до 240 микролитров белкового раствора с белком до пяти миллиграммов на миллилитр.

Запускаем 1,5 колонок объемом буфера и собираем 0,25 миллилитровые фракции. Моющие комплексы белка XB элюируют в пике при объеме элюирования от 10 до 15 миллилитров. Возьмите пять микролитровых проб пиковых фракций.

Смешайте каждый образец один к одному с двукратным буфером SDS для образца. Проанализируйте образцы на 10%-ном полиакриламидном геле, чтобы оценить количество и чистоту MEX B в каждой фракции, извлеките фракции, содержащие чистый ME B. Этот полиакриламидный гель был загружен извлеченными фракциями из колонки iMac и отдельными фракциями из колонки фильтрации геля. После фильтрующей колонки геля белок оказывается чистым на окрашенном полиакриламидном геле кумаси.

След от фильтрационной колонки геля показывает основной пик белкового моющего комплекса, элюирующего из колонки. Средний выход белка mxb составляет примерно два миллиграмма на шесть литров двух культур XYT После освоения эта процедура может быть выполнена за восемь часов, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как экспрессировать растворять и очищать мембранный белок.