JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:43 мин • September 26th, 2025
Начните с меченых радиоактивными нуклеотидными экстрактами, полученных из бактериальной культуры до и после индукции стресса.
В состоянии стресса бактериальные ферменты превращают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат в стресс-индуцированные нуклеотиды гуанозинпентафосфат и гуанозинтетрафосфат.
Нанесите экстракты на тонкослойную хроматографическую пластину, предварительно покрытую катионным полимером в качестве неподвижной фазы.
Поместите планшет в камеру, содержащую буфер в качестве подвижной фазы, следя за тем, чтобы жидкость оставалась ниже пятна для предотвращения ранней диффузии.
Позвольте буферу подняться за счет капиллярного действия, разделяя отрицательно заряженные нуклеотиды на отдельные полосы в зависимости от их заряда и размера.
После проявления снимите пластину, высушите на воздухе и обрежьте верхнюю часть, чтобы устранить свободные изотопы и снизить фоновый сигнал.
Подвергните пластину воздействию радиационно-чувствительного экрана, чтобы обнаружить радиоактивный сигнал.
Повышенные уровни гуанозинтетрафосфата и пентафосфата гуанозина после индукции напряжения выявляют динамические сдвиги в пуле нуклеотидов гуанозина.
Во-первых, установите пластину ТПК из целлюлозы PEI размером 20 на 20 сантиметров.
С помощью ножниц удалите верхние пять сантиметров, а мягким карандашом наметьте линию начала координат в одном сантиметре от края. Нанесите каплю размером пять микролитров каждого образца на поверхность PEI.
Прежде чем пятно высохнет, перенесите планшет в резервуар, содержащий слой 1,5 молярного монокалийфосфата, который достаточно мелкий, чтобы не касаться исходного пятна образца. Накройте бак герметичным уплотнителем, и дайте жидкости подняться на верх 15-сантиметрового обрезанного листа. После этого удалите полностью развившуюся хроматограмму и высушите ее на воздухе при комнатной температуре.
Разрежьте и выбросьте верхнюю часть хроматограммы, содержащую свободный Р32, в радиоактивные отходы. Используйте люминофорный экран для экспонирования аудиорадиографических пленок в течение ночи. На следующий день проявите пленку и с помощью люминофора захватите и количественно оцените зеленый сигнал люминофора.
Затем используйте программное обеспечение ImageJ для количественной оценки радиоактивных пятен.