Разделение нуклеотидов (p)ppGpp на основе тонкослойной хроматографии, выделенных из стресс-индуцированных бактерий

Начните с меченых радиоактивными нуклеотидными экстрактами, полученных из бактериальной культуры до и после индукции стресса.

В состоянии стресса бактериальные ферменты превращают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат в стресс-индуцированные нуклеотиды гуанозинпентафосфат и гуанозинтетрафосфат.

Нанесите экстракты на тонкослойную хроматографическую пластину, предварительно покрытую катионным полимером в качестве неподвижной фазы.

Поместите планшет в камеру, содержащую буфер в качестве подвижной фазы, следя за тем, чтобы жидкость оставалась ниже пятна для предотвращения ранней диффузии.

Позвольте буферу подняться за счет капиллярного действия, разделяя отрицательно заряженные нуклеотиды на отдельные полосы в зависимости от их заряда и размера.

После проявления снимите пластину, высушите на воздухе и обрежьте верхнюю часть, чтобы устранить свободные изотопы и снизить фоновый сигнал.

Подвергните пластину воздействию радиационно-чувствительного экрана, чтобы обнаружить радиоактивный сигнал.

Повышенные уровни гуанозинтетрафосфата и пентафосфата гуанозина после индукции напряжения выявляют динамические сдвиги в пуле нуклеотидов гуанозина.

Во-первых, установите пластину ТПК из целлюлозы PEI размеро