Изоляция и подготовка бактериальных клеточных стенок для композиционного анализа с помощью ультра производительности жидкой хроматографии

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и расщеплении клеточных стенок бактерий для определения идентичности и относительных фракций различных нейропептидов. С помощью анализа UPLC это достигается путем предварительного лизирования образцов бактерий путем кипячения в сульфате эко натрия. После вымывания SDS вторым шагом является переваривание образцов с проназой Е, чтобы очистить внешнюю мембрану от грамотрицательных бактерий.

Затем образцы расщепляют с целью растворения пептидогликана в отдельные нейропептиды. Последним шагом является снижение нейропептидов и корректировка pH до изоэлектрической точки нейропептида. В конечном счете, UPLC используется для разделения нейропептидов в соответствии с размером и гидрофобностью, облегчая количественную оценку важных характеристик клеточной стенки, таких как степень сшивки и средняя длина гликановой цепи.

Этот метод может помочь найти ответы на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как взаимосвязь между морфогенезом, архитектурой клеточной стенки, активацией иммунной системы и патогенезом. Хотя этот метод был разработан для очистки грамотрицательного пептидилгликанов, он также может быть применен к грамположительным бактериям с добавлением нескольких ферментов и химических обработок. Установите кипящую водяную баню на горячей плите в литровый стакан.

Как только вода закипит, насыпьте шесть миллилитров 6% дилсульфата натрия или SDS в полипропиленовые трубки объемом 50 миллилитров. Добавьте по одной небольшой мешалке к каждой трубке и пальцами надежно затяните крышки пробирок. Поместите трубки на кипящую водяную баню и перемешайте со скоростью 500 об/мин на горячей плите.

Соберите 250 миллилитровые культуры, вращая при 5000 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулы в трех миллилитрах среды или в одном х фосфатном буферном растворе. Медленно пипетируйте клеточные суспензии в 50-литровые пробирки с 6% кипящим SDS, чтобы заразить клетки, пока пробирки погружают в кипящую водяную баню, и снова закройте крышки, чтобы плотно закрыть пальцы.

Накройте кипящую водяную баню крышкой и дайте клеткам покипеть в течение трех часов, периодически проверяя уровень воды и при необходимости снова заливая водяную баню. Через три часа выключите огонь на конфорке и продолжайте помешивать в течение ночи при 500 об/мин. Если SDS выпал в 50-миллилитровых трубках за ночь, установите водяную баню на кипячение еще на один-два часа.

Здесь показано, как должна выглядеть нормальная культура после лизиса в течение ночи. В SDS обратите внимание на прозрачность, а не на непрозрачность, которая коррелирует с осадками. Приготовьте буфер для лежачих Е и активируйте Е в положении лежа при температуре 60 градусов Цельсия в тепловом блоке не менее чем на 30 минут.

Используйте ультрацентрифугу, нагретую на 400 000 G для отжима образцов в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать крупные молекулы пептолгликана или макромолекул PG и тем самым очистить их от других клеточных компонентов. Осторожно удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте каждую гранулу при комнатной температуре. Объем суспензии сверхчистой воды зависит от объема используемых ультрацентрифужных пробирок.

Используйте объем, который заполняет пробирки не менее чем наполовину, но не превышает максимальный объем пробирок. Повторяйте центрифугирование и промывку до тех пор, пока вода не образует пузырьки во время суспензии Resus, указывающие на то, что SDS был полностью удален на этом этапе. Резус суспендирует образцы в 900 микролитрах трис-HCL буфера и перенесет в двухмиллилитровые пробирки, предварительно протыканные отверстиями в верхушках.

С помощью небольшой иглы добавьте 100 микролитров активированной проназы Е в каждый образец перед инкубацией при температуре 60 градусов Цельсия в течение двух часов. Остановите склонное к несварению желудка, добавив 200 микролитров 6% SDS в каждый образец, и кипятите образцы в нагревательном блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение 30 минут. Как и раньше, используйте ультрацентрифугу, установленную на 400 000 умноженных на G, чтобы открутить образцы в течение 20 минут при комнатной температуре и промыть сверхчистой водой комнатной температуры до полного удаления SDS на последнем этапе промывки центрифугированием, восстановите суспендию образцов в 200 микролитрах 50 миллимолярного буфера фосфата натрия.

Этот объем может быть отрегулирован в зависимости от количества пептогликана в образце и может зависеть от вида. Если образец содержит больше пэпгликанов, увеличьте объем суспензии. Если в пробе мало пептидгликанов.

Уменьшите объем суспензии ресусзии минимум до 50 микролитров. Переложите образцы в пробирки объемом 1,5 миллилитра и добавьте один миллиграмм на миллилитр, чтобы получить конечную концентрацию 40 микрограммов на миллилитр. Инкубируйте в течение шести-восьми часов или в течение ночи в блоке с температурой 37 градусов Цельсия.

Чтобы подготовить образцы для УПЛК, включите термоблок до 100 градусов Цельсия. Прокипятите образцы без паспорта безопасности в течение пяти минут, чтобы остановить образцы на центрифуге для разложения на 10 минут при 16 000 раз. G при комнатной температуре.

Нейропептиды теперь находятся в надосадочной жидкости. Перенесите надосадочную жидкость в стеклянные пробирки размером 13 на 100 миллиметров. Постарайтесь восстановить как можно больше надосадочной жидкости, подойдя очень близко к нёбу, не нарушая его.

Отрегулируйте pH, добавив в образец 500 миллимолярных боратных буферов для конечной концентрации 100 миллимолярных боратных отверстий восьмого буфера, совместимого с восстановителем. Боргидрид натрия добавьте несколько зерен борогидрида натрия, чтобы уменьшить каждый образец, и дайте реакции протекать не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем отрегулируйте образцы до уровня pH 6, измеренного с помощью индикаторной бумаги с ортофосфорной кислотой с шагом 20 микролитров, образец должен пузыриться в ответ на добавление ортофосфорной кислоты.

Образец обычно прекращает пузыриться при достижении pH шести. Затем продолжайте регулировать образцы до pH от трех до четырех с помощью ортофосфорной кислоты с шагом в два микролитра. Отфильтруйте образец через шприц 0,22 микрона.

Отфильтруйте непосредственно во флакон A-U-P-L-C. Если в образцах после переноса в пробирки UPLC образовался осадок, нагрейте пробирки в несколько проходов через пламя. Поместите флакон UPLC в автоматический пробоотборник и введите 10 микролитров каждого образца в прибор A-U-P-L-C.

Оснащен колонкой C 18 с обратной фазой UPLC и детектором поглощения, настроенным на контроль. Образцы с яркостью от 202 до 208 нанометров впрыскиваются последовательно. Установите расход на 0,25 миллилитров в минуту и используйте линейный градиент в течение 25 минут, чтобы достичь 100% растворителя B и последовательного E нейропептидов в течение 30 минут.

Если для характеристики нейропептидов после УПЛК будет использоваться масс-спектрометрия, то сбор фракций пика интереса в сборнике фракций, перенос фракций в пробирку объемом 1,5 миллилитра, а затем сушка фракций с помощью центробежного испарителя должна быть обессолена перед анализом МС. В этом типичном для UPLC результате. Обнаружение с помощью поглощения ультрафиолета на глубине от 202 до 208 нанометров в зависимости от времени устанавливает определенное время удержания нейропептидов.

Наблюдается четкое разрешение между большинством видов нейропептидов и сильной мощностью сигнала по всему спектру, что позволяет анализировать степень сшивки средней длины гликановой цепи, а также идентичность нейропептидов и их концентрацию. Пример хроматограммы, отражающей осаждение нейропептидов C, показан здесь. Никаких пиков не упоминалось, что приводит к отсутствию каких-либо данных о составе ПГ.

Отсутствие заметных пиков при анализе UPLC может произойти в результате сверхконцентрации образца или неправильной регулировки pH до уровня значительно ниже изоэлектрической точки нейропептидов. После освоения этой техники можно сделать за три дня, пусть и суматошные, но выполненные должным образом после этой процедуры. Другие методы, такие как масс-спектрометрия, могут быть использованы для положительной идентификации видов нейропептидов на основе массы после их развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области микробиологии к изучению биохимической функции ключевых ферментов клеточной стенки и механизма действия химических ингибиторов у широкого спектра видов и мутантов.