Подготовка ткани мышиного мочевого пузыря для визуализации бактериальной инфекции

Начните с эвтаназии мыши с открытым мочевым пузырём, предварительно инфицированной патогенными бактериями.

Бактерии проникают в уротелий и формируют колонии. После созревания эти бактерии разрывают эпителиальную клетку и заражают окружающие клетки.

Введите катетер, подключённый к шприцу, наполненному фиксацией. Постепенно вводите фиксатив для надувания мочевого пузыря и сохранения его архитектуры.

Зажмите уретру, чтобы сохранить фиксатор и форму мочевого пузыря.

Снимите катетер, затем перережьте уретру. Перенесите мочевой пузырь в свежий фиксатор и инкубуйте для сохранения структуры.

Разделите мочевой пузырь на две половинные чашки, чтобы открыть уротелий, и прополосните буфером.

Покрасьте металлическим реагентом для усиления контраста, затем стирайте с ультрачистой водой.

Сушить секции с помощью градиента этанола, затем сушить в критической точке.

Разрежьте каждую засохшую чашку мочевого пузыря пополам.

Образец теперь готов к дальнейшей обработке с целью визуализации взаимодействий хозяина и патогена.

После использования туберкулинового шприца фиксативом прикрепите катетер к концу, скошенным лицом напротив отметок шприца.

Срежьте лишнюю трубку в 1–2 миллиметрах от конца иглы, стараясь не обнажать кончик иглы. Щёлкни шприцом, чтобы убрать пузырьки, и нажми поршень для пустого воздуха. Затем наполните катетер фиксатором через микроцентрифугную трубку. После анестезии и жертвы мыши, когда ноги закреплены, откройте тазовую область мыши щипцами и хирургическими ножницами, чтобы обнажить мочевой пузырь. Аккуратно отодвините соседний жир, но оставьте мочевой пузырь на месте.

Держите шприц доминирующей рукой с иглой, направленной вниз. Окуньте кончик катетера в стерильную смазку и разместите его у отверстия уретры, удерживая ствол шприца под углом 30–45 градусов над телом мыши.

Приложите давление вниз с лёгким движением по часовой стрелке и аккуратно введите катетер в уретру. Когда кончик катетера входит, наклоните шприц к хвосту мыши, продолжая вводить катетер дальше в уретру, пока ствол шприца не станет параллельно рабочей поверхности. Весь стержень иглы катетера должен попасть в мышь, размещая кончик катетера внутри просвета мочевого пузыря. Медленно вводите 50–80 микролитров фиксирующего средства, вызывая надувание мочевого пузыря, словно шарик.

Держите катетер на месте и немного поднимите шприц, наклоняя кончик вверх. Другой рукой откройте гемостат и провьите один штырь под иглу катетера в месте пересечения уретры. Частично закройте гемостат, пока он не соприкоснётся с иглой.

Аккуратно выведите иглу катетера из мочевого пузыря, одновременно полностью зажимая и блокируя гемостат, чтобы предотвратить потерю фиксативного вещества. Держите гемостат так, чтобы он был параллелен рабочей поверхности, а мочевой пузырь лежал сверху. Аккуратно поднимите и аккуратно разрезайте под гемостатом, чтобы удалить мочевой пузырь, пока гемостат всё ещё прикреплён.

Поместите мочевой пузырь и гемостат в трубку Falcon с подогретым фиксатором. Убедитесь, что мочевой пузырь полностью погружен в жидкость и не прижат к стенкам трубки.

Чтобы сфотографировать мочевой пузырь с помощью сканирующей электронной микроскопии, сагиттально разрежьте его чистым двусторонним лезвием или скальпелем и сделайте второй разрез касательной к гемостату для освобождения мочевого пузыря. В результате получаются две чашки с половиной мочевого пузыря. Если на внешней стороне мочевого пузыря остались жировые подушечки, аккуратно их удалите.

Прополосните половинки мочевого пузыря три раза в буфере натрия какодилата. Покрасить ткань 1% тетроксидом осмия в буфере 0,15 моляра какодилата в течение 1 часа при комнатной температуре. Выполните этот шаг, обёрнув сосуд для окрашивателя фольгой, чтобы сохранить тёмную среду. После окрашивания прополосните половинки мочевого пузыря три раза в сверхчистой воде.

Если на поверхности воды наблюдается осмиковатое масло, аспирируйте или отведите его, чтобы предотвратить загрязнение во время сушки. После обезвоживания ткани разрежьте мочевой пузырь пополам чистой двусторонней бритвой, чтобы получить всего четыре части.