Закрытая система культуре клеток протокола Использование HyperStack Суда с газопроницаемых Технология Материал

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать правильное использование емкостей стека Corning Hypers в закрытой системе. Это достигается путем предварительного посева и заполнения сосудов средой методом гравитационной подачи. Далее клеточная суспензия изолируется в каждом из слоев и клетки инкубируются.

После инкубации отработанная среда удаляется. Заключительным этапом процедуры является забор клеток из сосудов гиперстека. В конечном счете, получены результаты газовой диффузии, показывающие способность клеток получать доступ к кислороду во время роста до беглости при использовании закрытой системы гиперстека.

Основным преимуществом гиперстекового бака с газопроницаемым материалом является то, что он обеспечивает увеличенную площадь поверхности для роста клеток. Устранив свободное пространство в сосуде, мой коллега. Пардо теперь продемонстрирует протокол закрытой системы для использования сосуда гиперстека. Сосуд гиперстека состоит из стата, который представляет собой отдельный отсек для клеточной культуры, состоящий из верхней пластины и газопроницаемой пленки.

Клетки культивируются в этом компартменте. Жидкостный коллектор соединяет каждый из слоев ette вместе в модуле. Модули соединяются с помощью трубок для формирования сосудов, кратных 12 слоям.

Коллектор позволяет пользователю производить одну манипуляцию с жидкостью для всего сосуда. Воздушный коллектор также соединяет слои статов вместе, но используется для вытеснения воздуха из резервуара при приливании жидкости и содержит линию заполнения для использования во время наполнения между каждым из них. Статический слой — это открытое воздушное пространство, называемое трахеальным пространством, позволяющее газообмену происходить через газопроницаемую пленку каждого слоя.

Трубка для работы с жидкостями подсоединена к жидкостному коллектору и является настраиваемым компонентом, используемым для выполнения всех операций с закрытой системой для выпуска избыточного воздуха при сохранении стерильности. Используется вентиляционная трубка. Вентиляционная трубка соединена с воздушным коллектором и содержит воздушный фильтр.

К трубкам для работы с жидкостями подключены трубки и фильтр, которые используются для откачки жидкости из трубки для работы с жидкостью после наполнения резервуара. Также в этом протоколе используется манипулятор Corning Stack или CSM, который представляет собой манипулятор для помощи в размещении сосудов в правильных положениях во время использования. В данной демонстрации культура клеток закрытой системы демонстрируется для газопроницаемого 36-слойного сосуда.

Однако при использовании CSM детали выполнения этой процедуры на 12-слойном сосуде с использованием заполняющего клина можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Начните с подготовки 3,9 литров фильтрующего материала в мешках перед загрузкой пробирки с фильтрующим материалом. Намочите мешок с сывороткой в мешок для фильтрующего материала и тщательно перемешайте, чтобы получить желаемую концентрацию сыворотки.

Зажмите примерно 300 миллилитров среды в пакете с помощью больших зажимов для мешков. Это гарантирует, что все инокулированные клетки будут использованы во время заполнения, и ни одна из них не останется в мешке для фильтрующего материала. Поместите носитель на подставку для пакета, чтобы ввести его в атмосферу.

Наполните шприц, прикрепленный к трубке, клеточной суспензией. Прикрепите шприц с клеточной суспензией к мешку для фильтрующего материала с помощью трубной сварки. Три трубки по 16 дюймов от шприца до мешка.

Введите суспензию клеток в мешок для фильтрующего материала и хорошо перемешайте. Мешок с модифицированным фильтрующим материалом может быть прикреплен к трубке для работы с жидкостью размером более трех более восьми дюймов с помощью трубной сварки или с помощью многоцелевых соединителей. Сегодня мы будем использовать сварку труб.

Закройте зажимы на трубках для работы с жидкостью и погоню за трубками сосуда. Поместите 36-слойный сосуд в A CSM в грузовом положении. Зацепите трубку вентиляционного фильтра за фиксирующий зажим на CSM.

Затяните крышку и переместите CSM в положение заполнения, чтобы установить воздушный фильтр в самое высокое положение, чтобы предотвратить намокание во время заправки. Угол 10 градусов также позволяет уравновешивать жидкость по слоям во время наполнения чистым воздухом с линии заполнения. Расположите мешок для фильтрующего материала на том же уровне, что и сосуд, удерживая зажим для чеканной трубки закрытым.

Откройте зажим трубки для работы с жидкостью и зажим для мешка со средой, чтобы жидкость попала внутрь резервуара. Используя подставку для мешка, поднимите мешок для фильтрующего материала, чтобы суспензия клеток попала в сосуд. Заполняйте емкость до тех пор, пока вся инокулированная среда не попадет в емкость.

Верхняя часть пакета для фильтрующего материала все еще должна содержать 300 миллилитров фильтрующего материала. Снимите зажим с мешка для фильтрующего материала, чтобы продолжить заполнение резервуара по мере приближения жидкости к верхнему воздушному коллектору. Уменьшите скорость заполнения, опустив пакет для носителя, чтобы предотвратить переполнение.

Медленно доведите уровень жидкости до линии наполнения и закройте трубку для работы с жидкостью. Переведите сосуд в CSM в положение изоляции, поместив оба комплекта коллекторов в самое верхнее положение. Опустите мешок для носителя ниже высоты судна.

Удерживая фильтр в вертикальном положении, откройте зажим для трубки. Это приведет к опорожнению или вытеснению фильтрующего материала из трубки для работы с жидкостью обратно в мешок для фильтрующего материала. Когда трубка опустеет, закройте зажим на трубке мешка для фильтрующего материала.

Удержание фильтра с чеканной трубкой в вертикальном положении. Откройте зажим на трубке для работы с жидкостью в сосуде, чтобы позволить оставшейся жидкости проникнуть в сосуд и уравновеситься в нем. Подождите одну-две минуты, пока это произойдет.

Далее поворачиваем сосуд в CSM так, чтобы коллекторы были слева. Опустите судно в грузовое положение на CSM. Закройте зажимы на трубках для погонов и для работы с жидкостью.

Теперь мешок для фильтрующего материала можно снять с сосуда или оставить его прикрепленным для использования позже в процессе сбора урожая. Чтобы сохранить прикрепленную сумку для носителя, сверните ее в рулон и поместите под фиксирующие ленты в лотке для хранения сосуда. Наконец, переместите сосуд в инкубатор При переноске сосуда следите за тем, чтобы жидкость не попала в фильтр вентиляционного отверстия.

Это достигается путем наклона конца коллектора немного вверх. Чтобы начать процедуру сбора урожая трубки, сварите ячейки Ассоциативный раствор и закалочные мешки вместе Чтобы сформировать сборочный мешок, убедитесь, что все зажимы трубок закрыты. Извлеките сосуд из инкубатора и поместите его в CSM в положение для загрузки.

Освободите сумку для носителя из-под удерживающих лент и повесьте ее на сумку. Встаньте рядом, закрутите крышку, чтобы закрепить сосуд. Зацепите вентиляционную трубку за удерживающий зажим и переместите CSM в положение заполнения.

Убедитесь, что мешок для прессы на подставке для мешков висит ниже сосуда. Откройте зажим на трубке мешка для фильтрующего материала и трубке для работы с жидкостью в сосуде, чтобы позволить фильтру течь в прикрепленный мешок. Как только сосуд будет пуст примерно на три четверти, измените настройки CSM на окончательное пустое положение.

Когда сосуд и трубка для работы с жидкостью опустеют, поднимите трубку, чтобы протолкнуть фильтрующий материал мимо зажима на трубке пакета для отработанного фильтрующего материала. Затем закройте зажим на трубке для работы с жидкостью и зажим на трубке мешка для отработанного материала. Замените мешок с отработанным материалом на сборочный мешок в сборе с помощью сварки труб

Поднимите высоту мешка для диссоциации ячеек выше высоты сосуда с помощью подставки для мешка. Поместите CSM в положение заполнения. Откройте трубку с зажимом для диссоциации клеток и зажим для сбора мешка для сбора урожая и переложите раствор в сосуд.

Когда перенос будет завершен, закройте зажимы на трубке для работы с жидкостью и трубке раствора для диссоциации ячеек. Затем переведите CSM в положение нагрузки, удерживая рычаг горизонтального позиционирования открытым. Аккуратно покачивайте сосуд из стороны в сторону с помощью колеса, распределяя раствор по слоям клеток.

Сосуд может время от времени возвращаться в заполненное положение во время качания для поддержания равномерного распределения раствора. После того, как раствор будет должным образом распределен, отпустите рычаг на CSM, чтобы зафиксировать положение заполнения. Оставьте сосуд в таком положении в течение необходимого для клеток времени диссоциации.

Используйте помутнение в качестве ориентира для определения отслойки клеток. После отсоединения переместите CSM в положение для загрузки. Откройте зажим для закалочного мешка и зажим трубки для работы с жидкостью, чтобы обеспечить попадание закалочной среды в резервуар.

Закройте зажим на трубке для работы с жидкостью. После завершения передачи верните CSM в положение для загрузки и удерживайте рычаг горизонтального позиционирования, чтобы раскачивать судно из стороны в сторону. С помощью подставки для мешков опустите место сборщика мешков ниже уровня сосуда.

Установите CSM в пустое положение. Откройте трубку для работы с жидкостью в сосуде с зажимом и переложите раствор ячейки обратно в мешок для закалки. Верните CSM в грузовое положение и отсоедините узел мешка для сбора урожая от сосуда с помощью герметика для трубок.

Теперь клеточное решение готово к переработке в традиционных системах клеточного выращивания. Благодаря Headspace кислород в фильтрующем материале истощается в среднем на 50% в течение трех дней. В культуре этот рисунок показывает снижение в миллиграммах на литр кислорода на уровне клеток с течением времени в одной и той же системе роста, градиент кислорода через среду высотой три миллиметра почти на 50% больше на стыке среды в Headspace, чем на клеточном слое

Показано процентное содержание кислорода в трахейном пространстве гиперстека во время роста клеток. На рисунке показано, что в течение 96 часов процентное содержание кислорода между слоями, которые подаются на дно каждой газопроницаемой пленки, остается постоянным. Это демонстрирует способность клеток получать доступ к кислороду во время роста до беглости.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как заполнять и собирать стековый бак Corning Hypers в закрытой системе.