Закрытая система культуре клеток протокола Использование HyperStack Суда с газопроницаемых Технология Материал

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать правильное использование сосудов Corning Hypers stack в качестве закрытой системы. Это достигается путем первоначального инокулирования и заполнения сосудов средой с помощью метода гравитационной подачи. Затем клеточная суспензия изолируется в каждом из слоев, после чего клетки подвергаются инкубации.

После инкубации отработанную среду удаляют. Заключительным этапом процедуры является сбор клеток из сосудов системы hypers stack. В конечном итоге получают результаты диффузии газов, демонстрирующие способность клеток получать кислород в процессе роста до достижения конфлюэнтности при использовании закрытой системы hypers stack.

Основным преимуществом сосуда HyperStack с газопроницаемым материалом является обеспечение увеличенной площади поверхности для роста клеток. Мой коллега П. Пардо продемонстрирует протокол работы в закрытой системе с использованием сосуда HyperStack, который исключает наличие свободного пространства в верхней части сосуда. Сосуд HyperStack состоит из стата — отдельного отсека для культивирования клеток, который представляет собой верхнюю пластину и газопроницаемую пленку.

Клетки культивируют в этом отделении. Жидкостный коллектор соединяет между собой все слои ette внутри модуля. Модули соединяются трубками, образуя сосуды, состоящие из слоев кратно 12.

Коллектор позволяет пользователю выполнять одну манипуляцию с жидкостью во всем сосуде. Воздушный коллектор также соединяет статические слои между собой, но используется для вытеснения воздуха из сосуда при добавлении жидкости и содержит линию заполнения для использования во время заполнения между ними. Статический слой представляет собой открытое воздушное пространство, называемое трахеальным пространством, которое обеспечивает газообмен через газопроницаемую мембрану каждого слоя.

Трубки для перемещения жидкости подключены к жидкостному коллектору и представляют собой настраиваемый компонент, используемый для всех манипуляций с жидкостями в закрытой системе с целью удаления избыточного воздуха при сохранении стерильности. Также используются вентиляционные трубки. Вентиляционные трубки подключены к воздушному коллектору и содержат воздушный фильтр.

К трубкам системы подачи жидкости подключены промывочная трубка и фильтр, которые используются для удаления жидкости из трубок системы подачи после заполнения сосуда. Также в данном протоколе используется манипулятор Corning Stack (CSM) — устройство, которое помогает размещать сосуды в правильных позициях во время работы. В данной демонстрации представлено культивирование клеток в закрытой системе с использованием газопроницаемого 36-слойного сосуда.

Однако при использовании CSM подробную информацию о выполнении данной процедуры для 12-слойного сосуда с использованием заполняющего клина можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Начните с подготовки 3,9 литров среды в пакете перед инокуляцией пробирки со средой. Добавьте сыворотку в пакет со средой и тщательно перемешайте до достижения желаемой концентрации сыворотки.

Пережмите примерно 300 миллилитров среды в пакете с помощью больших зажимов для пакетов. Это гарантирует, что при розливе будут использованы все инокулированные клетки и ни одна из них не останется в пакете со средой. Поместите среду на подставку для пакетов, чтобы провести инокуляцию среды.

Заполните шприц, присоединенный к трубке, суспензией клеток. Присоедините шприц с суспензией клеток к пакету со средой с помощью сварки трубок. Оставьте около 16 дюймов трубки от шприца до пакета.

Введите клеточную суспензию в пакет со средой и тщательно перемешайте. Инокулированный пакет со средой можно подсоединить к трубке для подачи жидкости диаметром 3/8 дюйма, установленной на сосуде, с помощью сварки трубок или используя универсальные соединители. Сегодня мы воспользуемся сваркой трубок.

Закройте зажимы на трубках подачи и слива жидкости сосуда. Поместите 36-слойный сосуд в CSM в положение для загрузки. Закрепите трубку вентиляционного фильтра в удерживающем зажиме на CSM.

Плотно закройте крышку и переместите CSM в положение заполнения, чтобы воздушный фильтр находился в самой верхней точке; это предотвратит его намокание во время операции заполнения. Угол наклона 10 градусов также способствует выравниванию жидкости по слоям в процессе заполнения, удаляя воздух из линии заполнения. Расположите пакет со средой на одном уровне с сосудом, удерживая зажим промывочной трубки закрытым.

Откройте зажим трубки для подачи жидкости и зажим пакета со средой, чтобы жидкость могла поступить в сосуд. Используя подставку для пакета, поднимите пакет со средой, чтобы облегчить поступление клеточной суспензии в сосуд. Наполняйте сосуд до тех пор, пока вся инокулированная среда не поступит внутрь.

В верхней части пакета с питательной средой все еще должно оставаться 300 миллилитров среды. Снимите зажим с пакета, чтобы продолжить заполнение сосуда по мере приближения жидкости к верхнему воздушному коллектору. Чтобы предотвратить переполнение, снизьте скорость заполнения, опустив пакет с питательной средой ниже.

Медленно доведите уровень жидкости до линии заполнения и пережмите трубки системы подачи жидкости. Переведите сосуд в CSM в изолированное положение, установив оба набора манифольдов в самое верхнее положение. Опустите пакет со средой ниже уровня сосуда.

Удерживая фильтр для продувки в вертикальном положении, откройте зажим трубки для продувки. Это позволит слить или продуть среду из трубки системы подачи жидкости обратно в пакет со средой. Как только трубка опустеет, закройте зажим на трубке пакета со средой.

Удерживая фильтр приемной трубки в вертикальном положении, откройте зажим трубки для подачи жидкости на сосуде, чтобы оставшаяся жидкость могла поступить в сосуд и уравновеситься. Подождите одну или две минуты до завершения этого процесса.

Затем поверните сосуд в CSM так, чтобы коллекторы находились слева. Опустите сосуд в позицию загрузки в CSM. Закройте зажимы как на трубках для промывки, так и на трубках для подачи жидкости.

Теперь пакет со средой можно извлечь из сосуда или оставить закрепленным для последующего использования в процессе сбора урожая. Чтобы сохранить закрепленный пакет со средой, сверните его и поместите под фиксирующие ленты в лоток для хранения сосуда. В завершение переместите сосуд в инкубатор. При переноске сосуда следите за тем, чтобы жидкость не попала в воздушный фильтр.

Это достигается путем небольшого наклона конца коллектора вверх. Чтобы начать процедуру сбора, соедините трубками пакет с раствором для диссоциации клеток и пакет для квенчинга, чтобы сформировать узел пакетов для сбора; убедитесь, что все зажимы на трубках закрыты. Извлеките сосуд из инкубатора и поместите его в CSM в положение загрузки.

Освободите пакет со средой из-под фиксирующих лент и подвесьте его на стойку для пакетов. Стоя рядом, плотно закрутите крышку, чтобы зафиксировать сосуд. Закрепите вентиляционную трубку в держателе и переместите CSM в положение заполнения.

Убедитесь, что пакет со средой на стойке подвешен ниже, чем сосуд. Откройте зажим на трубке пакета со средой и на трубке системы подачи жидкости сосуда, чтобы среда могла перетечь в присоединенный пакет. Когда сосуд будет опорожнен примерно на три четверти, переведите настройки CSM в конечное положение опорожнения.

Когда сосуд и трубки системы подачи жидкости опустеют, приподнимите трубку, чтобы прогнать среду мимо зажима на трубке мешка для отработанной среды. Затем закройте зажим на трубке системы подачи жидкости и зажим на трубке мешка для отработанной среды. Замените мешок для отработанной среды на узел мешка для сбора путем сварки трубок.

Используя стойку для пакета, поднимите узел пакета для диссоциации клеток выше уровня сосуда. Установите CSM в положение для заполнения. Откройте зажим трубки с раствором для диссоциации клеток и зажим узла пакета для сбора, затем перенесите раствор в сосуд.

После завершения переноса закройте зажимы на трубках системы подачи жидкости и трубках с раствором для диссоциации клеток. Затем, удерживая рычаг горизонтального позиционирования в открытом положении, переместите CSM в положение загрузки. Осторожно раскачивайте сосуд из стороны в сторону с помощью колеса, распределяя раствор по слоям клеток.

Во время раскачивания сосуд можно периодически возвращать в положение заполнения для поддержания равномерного распределения раствора. После того как раствор будет распределен надлежащим образом, отпустите рычаг CSM, чтобы зафиксировать его в положении заполнения. Оставьте сосуд в этом положении на время, необходимое для диссоциации клеток.

Для определения степени открепления клеток ориентируйтесь по мутности среды. После открепления переместите CSM в положение загрузки. Откройте зажим пакета с гасителем и зажим трубки системы подачи жидкости, чтобы среда-гаситель могла поступить в сосуд.

Закройте зажим на трубке системы подачи жидкости. После завершения переноса верните CSM в исходное положение и, удерживая рычаг горизонтального позиционирования, покачайте сосуд из стороны в сторону. С помощью подставки для пакета опустите узел пакета для сбора ниже уровня сосуда.

Переведите CSM в пустое положение. Откройте зажим трубки системы подачи жидкости в сосуд и перенесите клеточный раствор обратно в пакет для гашения. Верните CSM в положение загрузки и отсоедините узел пакета для сбора из сосуда с помощью запайщика трубок.

Теперь клеточный раствор готов к обработке в традиционных системах культивирования клеток. При использовании метода Headspace содержание кислорода в среде истощается в среднем на 50% за три дня. В культуре этот показатель демонстрирует снижение содержания кислорода в миллиграммах на литр на уровне клеток с течением времени в той же системе роста; градиент кислорода при высоте среды три миллиметра почти на 50% выше на границе раздела среды и газовой фазы (Headspace), чем на уровне слоя клеток.

Представлен процент содержания кислорода в трахеальном пространстве стека hypers в процессе роста клеток. На рисунке показано, что в течение 96 часов процент кислорода между слоями, подаваемого к каждому газопроницаемому дну, остается постоянным. Это демонстрирует способность клеток получать доступ к кислороду во время роста до достижения конфлюэнтности.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять заполнение и сбор клеток из сосуда Corning Hypers stack в закрытой системе.