Закрытая система культуре клеток протокола Использование HyperStack Суда с газопроницаемых Технология Материал
November 29th, 2010
Введение в технологию, протокол и обработки судов Corning HyperStack и аксессуары для высокой урожайности приверженцем культуры клеток. Протокол будет показано, как использовать закрытых сосудах системы для повышения ячейки уборки по сравнению с нынешним пластины сложены продукты.
Общая цель этой процедуры — продемонстрировать правильное использование емкостей стека Corning Hypers в закрытой системе. Это достигается путем предварительного посева и заполнения сосудов средой методом гравитационной подачи. Далее клеточная суспензия изолируется в каждом из слоев и клетки инкубируются.
После инкубации отработанная среда удаляется. Заключительным этапом процедуры является забор клеток из сосудов гиперстека. В конечном счете, получены результаты газовой диффузии, показывающие способность клеток получать доступ к кислороду во время роста до беглости при использовании закрытой системы гиперстека.
Основным преимуществом гиперстекового бака с газопроницаемым материалом является то, что он обеспечивает увеличенную площадь поверхности для роста клеток. Устранив свободное пространство в сосуде, мой коллега. Пардо теперь продемонстрирует протокол закрытой системы для использования сосуда гиперстека. Сосуд гиперстека состоит из стата, который представляет собой отдельный отсек для клеточной культуры, состоящий из верхней пластины и газопроницаемой пленки.
Клетки культивируются в этом компартменте. Жидкостный коллектор соединяет каждый из слоев ette вместе в модуле. Модули соединяются с помощью трубок для формирования сосудов, кратных 12 слоям.
Коллектор позволяет пользователю производить одну манипуляцию с жидкостью для всего сосуда. Воздушный коллектор также соединяет слои статов вместе, но используется для вытеснения воздуха из резервуара при приливании жидкости и содержит линию заполнения для использования во время наполнения между каждым из них. Статический слой — это открытое воздушное пространство, называемое трахеальным пространством, позволяющее газообмену происходить через газопроницаемую пленку каждого слоя.
Трубка для работы с жидкостями подсоединена к жидкостному коллектору и является настраиваемым компонентом, используемым для выполнения всех операций с закрытой системой для выпуска избыточного воздуха при сохранении стерильности. Используется вентиляционная трубка. Вентиляционная трубка соединена с воздушным коллектором и содержит воздушный фильтр.
К трубкам для работы с жидкостями подключены трубки и фильтр, которые используются для откачки жидкости из трубки для работы с жидкостью после наполнения резервуара. Также в этом протоколе используется манипулятор Corning Stack или CSM, который представляет собой манипулятор для помощи в размещении сосудов в правильных положениях во время использования. В данной демонстрации культура клеток закрытой системы демонстрируется для газопроницаемого 36-слойного сосуда.
Однако при использовании CSM детали выполнения этой процедуры на 12-слойном сосуде с использованием заполняющего клина можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Начните с подготовки 3,9 литров фильтрующего материала в мешках перед загрузкой пробирки с фильтрующим материалом. Намочите мешок с сывороткой в мешок для фильтрующего материала и тщательно перемешайте, чтобы получить желаемую концентрацию сыворотки.
Зажмите примерно 300 миллилитров среды в пакете с помощью больших зажимов для мешков. Это гарантирует, что все инокулированные клетки будут использованы во время заполнения, и ни одна из них не останется в мешке для фильтрующего материала. Поместите носитель на подставку для пакета, чтобы ввести его в атмосферу.
Наполните шприц, прикрепленный к трубке, клеточной суспензией. Прикрепите шприц с клеточной суспензией к мешку для фильтрующего материала с помощью трубной сварки. Три трубки по 16 дюймов от шприца до мешка.
Введите суспензию клеток в мешок для фильтрующего материала и хорошо перемешайте. Мешок с модифицированным фильтрующим материалом может быть прикреплен к трубке для работы с жидкостью размером более трех более восьми дюймов с помощью трубной сварки или с помощью многоцелевых соединителей. Сегодня мы будем использовать сварку труб.
Закройте зажимы на трубках для работы с жидкостью и погоню за трубками сосуда. Поместите 36-слойный сосуд в A CSM в грузовом положении. Зацепите трубку вентиляционного фильтра за фиксирующий зажим на CSM.
Затяните крышку и переместите CSM в положение заполнения, чтобы установить воздушный фильтр в самое высокое положение, чтобы предотвратить намокание во время заправки. Угол 10 градусов также позволяет уравновешивать жидкость по слоям во время наполнения чистым воздухом с линии заполнения. Расположите мешок для фильтрующего материала на том же уровне, что и сосуд, удерживая зажим для чеканной трубки закрытым.
Откройте зажим трубки для работы с жидкостью и зажим для мешка со средой, чтобы жидкость попала внутрь резервуара. Используя подставку для мешка, поднимите мешок для фильтрующего материала, чтобы суспензия клеток попала в сосуд. Заполняйте емкость до тех пор, пока вся инокулированная среда не попадет в емкость.
Верхняя часть пакета для фильтрующего материала все еще должна содержать 300 миллилитров фильтрующего материала. Снимите зажим с мешка для фильтрующего материала, чтобы продолжить заполнение резервуара по мере приближения жидкости к верхнему воздушному коллектору. Уменьшите скорость заполнения, опустив пакет для носителя, чтобы предотвратить переполнение.
Медленно доведите уровень жидкости до линии наполнения и закройте трубку для работы с жидкостью. Переведите сосуд в CSM в положение изоляции, поместив оба комплекта коллекторов в самое верхнее положение. Опустите мешок для носителя ниже высоты судна.
Удерживая фильтр в вертикальном положении, откройте зажим для трубки. Это приведет к опорожнению или вытеснению фильтрующего материала из трубки для работы с жидкостью обратно в мешок для фильтрующего материала. Когда трубка опустеет, закройте зажим на трубке мешка для фильтрующего материала.
Удержание фильтра с чеканной трубкой в вертикальном положении. Откройте зажим на трубке для работы с жидкостью в сосуде, чтобы позволить оставшейся жидкости проникнуть в сосуд и уравновеситься в нем. Подождите одну-две минуты, пока это произойдет.
Далее поворачиваем сосуд в CSM так, чтобы коллекторы были слева. Опустите судно в грузовое положение на CSM. Закройте зажимы на трубках для погонов и для работы с жидкостью.
Теперь мешок для фильтрующего материала можно снять с сосуда или оставить его прикрепленным для использования позже в процессе сбора урожая. Чтобы сохранить прикрепленную сумку для носителя, сверните ее в рулон и поместите под фиксирующие ленты в лотке для хранения сосуда. Наконец, переместите сосуд в инкубатор При переноске сосуда следите за тем, чтобы жидкость не попала в фильтр вентиляционного отверстия.
Это достигается путем наклона конца коллектора немного вверх. Чтобы начать процедуру сбора урожая трубки, сварите ячейки Ассоциативный раствор и закалочные мешки вместе Чтобы сформировать сборочный мешок, убедитесь, что все зажимы трубок закрыты. Извлеките сосуд из инкубатора и поместите его в CSM в положение для загрузки.
Освободите сумку для носителя из-под удерживающих лент и повесьте ее на сумку. Встаньте рядом, закрутите крышку, чтобы закрепить сосуд. Зацепите вентиляционную трубку за удерживающий зажим и переместите CSM в положение заполнения.
Убедитесь, что мешок для прессы на подставке для мешков висит ниже сосуда. Откройте зажим на трубке мешка для фильтрующего материала и трубке для работы с жидкостью в сосуде, чтобы позволить фильтру течь в прикрепленный мешок. Как только сосуд будет пуст примерно на три четверти, измените настройки CSM на окончательное пустое положение.
Когда сосуд и трубка для работы с жидкостью опустеют, поднимите трубку, чтобы протолкнуть фильтрующий материал мимо зажима на трубке пакета для отработанного фильтрующего материала. Затем закройте зажим на трубке для работы с жидкостью и зажим на трубке мешка для отработанного материала. Замените мешок с отработанным материалом на сборочный мешок в сборе с помощью сварки труб
.Поднимите высоту мешка для диссоциации ячеек выше высоты сосуда с помощью подставки для мешка. Поместите CSM в положение заполнения. Откройте трубку с зажимом для диссоциации клеток и зажим для сбора мешка для сбора урожая и переложите раствор в сосуд.
Когда перенос будет завершен, закройте зажимы на трубке для работы с жидкостью и трубке раствора для диссоциации ячеек. Затем переведите CSM в положение нагрузки, удерживая рычаг горизонтального позиционирования открытым. Аккуратно покачивайте сосуд из стороны в сторону с помощью колеса, распределяя раствор по слоям клеток.
Сосуд может время от времени возвращаться в заполненное положение во время качания для поддержания равномерного распределения раствора. После того, как раствор будет должным образом распределен, отпустите рычаг на CSM, чтобы зафиксировать положение заполнения. Оставьте сосуд в таком положении в течение необходимого для клеток времени диссоциации.
Используйте помутнение в качестве ориентира для определения отслойки клеток. После отсоединения переместите CSM в положение для загрузки. Откройте зажим для закалочного мешка и зажим трубки для работы с жидкостью, чтобы обеспечить попадание закалочной среды в резервуар.
Закройте зажим на трубке для работы с жидкостью. После завершения передачи верните CSM в положение для загрузки и удерживайте рычаг горизонтального позиционирования, чтобы раскачивать судно из стороны в сторону. С помощью подставки для мешков опустите место сборщика мешков ниже уровня сосуда.
Установите CSM в пустое положение. Откройте трубку для работы с жидкостью в сосуде с зажимом и переложите раствор ячейки обратно в мешок для закалки. Верните CSM в грузовое положение и отсоедините узел мешка для сбора урожая от сосуда с помощью герметика для трубок.
Теперь клеточное решение готово к переработке в традиционных системах клеточного выращивания. Благодаря Headspace кислород в фильтрующем материале истощается в среднем на 50% в течение трех дней. В культуре этот рисунок показывает снижение в миллиграммах на литр кислорода на уровне клеток с течением времени в одной и той же системе роста, градиент кислорода через среду высотой три миллиметра почти на 50% больше на стыке среды в Headspace, чем на клеточном слое
.Показано процентное содержание кислорода в трахейном пространстве гиперстека во время роста клеток. На рисунке показано, что в течение 96 часов процентное содержание кислорода между слоями, которые подаются на дно каждой газопроницаемой пленки, остается постоянным. Это демонстрирует способность клеток получать доступ к кислороду во время роста до беглости.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как заполнять и собирать стековый бак Corning Hypers в закрытой системе.
Обзор
Эта статья знакомит с сосудами Corning HYPERStack и их аксессуарами, предназначенными для высокодоходной культуры адгезивных клеток. Протокол демонстрирует использование этих сосудов в закрытой системе для повышения эффективности сбора клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Технология культуры клеток
- Сбор адгезивных клеток
- Протоколы закрытой системы
Фон
- Сосуды Corning HYPERStack обеспечивают увеличенную поверхность для роста клеток.
- Газопереносимые материалы обеспечивают эффективный газовый обмен во время культуры клеток.
- Конструкция закрытой системы минимизирует риск заражения.
- Использование жидкостного манипулятора упрощает манипуляции с жидкостями.
Цель исследования
- Демонстрировать правильное использование сосудов Corning HYPERStack.
- Показать, как эффективно инокулировать и заполнять сосуды.
- Изложить шаги по сбору клеток из сосудов.
Используемые методы
- Инокуляция среды с клеточной суспензией.
- Метод гравитационного подачи для заполнения сосудов.
- Использование манипулятора Corning Stack для работы с сосудами.
- Пайка трубок для соединения сред и рукавов для ручного управления.
Основные результаты
- Успешное заполнение и инокуляция сосудов HYPERStack.
- Эффективный газовый обмен, наблюдаемый во время роста клеток.
- Повышенная эффективность сбора клеток, демонстрируемая в закрытой системе.
- Протокол позволяет легко манипулировать и поддерживать стерильность.
Выводы
- Сосуды Corning HYPERStack эффективны для высокодоходной культуры клеток.
- Протоколы закрытой системы значительно улучшают эффективность сбора клеток.
- Газопереносимые материалы являются преимущественными для роста клеток.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Closed system adherent cell culture using gas permeable vessels addresses scalability challenges in biologics manufacturing by increasing yield per footprint while maintaining sterility. This approach supports process intensification for cell therapy and vaccine production where closed systems are critical for regulatory compliance. The technology enables higher cell densities without expanding facility footprint, improving capital efficiency in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables scalable adherent cell expansion for target validation assays requiring high cell numbers.
- Operational Value: Reduces media and reagent consumption per cell yield through minimized headspace and efficient gas exchange.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible adherent cell layers for consistent assay readouts in drug screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes cell seeding density across layers via liquid manifold distribution, improving assay-to-assay variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports generation of clinical-grade adherent cells for preclinical efficacy and safety testing under closed conditions.
- Operational Value: Facilitates seamless transition from research-scale to GMP-compatible processes using identical vessel architecture.
Pipeline & Workflow Integration
The HYPERStack system integrates into adherent cell production workflows from expansion through harvest, supporting continuous processing in vaccine and therapeutic protein pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing in adherent cell models at scales relevant to target engagement studies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cell outputs for assay standardization in hit-to-lead progression.
- Analytics: Supports oxygen and metabolite monitoring via gas permeable film to assess culture health and metabolic activity.
- Translational Research: Maintains phenotypic fidelity during scale-up, critical for translational consistency in cell-based therapies.
- Enterprise Reuse: Modular design allows reuse across multiple cell lines and processes, reducing capital expenditure per campaign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive culture performance through stable gas exchange and reduced gradient effects compared to traditional stacked plates.
- Operational Value: Closed fluid paths minimize operator intervention, lowering contamination risk and labor intensity.
- Strategic Value: Higher yield per run improves batch consistency and reduces cost of goods in biologics manufacturing.
- Portfolio Impact: Enables risk-advanced allocation of adherent cell resources across multiple projects from a single platform.
Implementation Considerations
- Training in aseptic tubing welding and manifold handling for closed system integrity.
- Integration with standard incubators and biosafety cabinets using Corning Stack Manipulator for vessel positioning.
- Validation of gas diffusion rates to match metabolic demands of specific adherent cell lines.
- Adaptation of harvesting protocols (enzymatic or mechanical) to vessel geometry and layer accessibility.
- Monitoring of liquid handling tubing pressure and flow rates to prevent shear stress during scale-up.
