Мутагенеза и функциональные Выбор протоколов для направленной эволюции белков в Е. палочки

Общая цель этой процедуры заключается в создании случайной мутантной библиотеки для данной целевой последовательности ДНК, а также в быстрой идентификации и характеристике мутантов с помощью полуколичественного функционального отбора. Это достигается путем первичной трансформации плазмиды с кишечной палочкой, одним из источников репликации, содержащим целевую последовательность, в мутаторный штамм. После осаждения и инкубации клеток в течение ночи их собирают и выделяют целевую плазмиду для получения мутантной библиотеки, затем мутантную библиотеку преобразуют в считываемый штамм для характеристики мутаций во второй части протокола.

Завершающим этапом процедуры является штамповочный перенос этих бактериальных культур в градиент. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают изменения в профиле фенотипа данной последовательности-мишени через различия в росте на градиенте препарата. В этом видео представлен метод направленной эволюции белков в кишечной палочке.

Этот процесс имитирует естественную эволюцию в создании случайных библиотек питательных веществ, за которой следует отбор, ограничивающий это разнообразие. Таким образом, это улучшает нашу способность генерировать новые биохимические активности для промышленных или биомедицинских целей. Эта процедура состоит из двух компонентов: генерация библиотеки случайных мутантных мутантов и функциональный отбор для получения усиления функциональных мутаций, демонстрирующих эту процедуру, будет Дженнифер Аллен, техник из моей лаборатории.

До начала разработки настоящего протокола считалось, что электрокомпетентные клетки JS 200, экспрессирующие вариант ДНК-полимеразы с низкой точностью один или полюс с низкой точностью, который был предварительно получен, как описано в письменном протоколе, эти клетки содержат чувствительный к температуре аллель полюса один, так что активность полюса один с низкой точностью преобладает при температуре 37 градусов Цельсия. строить. Плазмида-мишень, содержащая кишечную палочку, один источник репликации с клонированной последовательностью-мишенью рядом с началом репликации, полюс низкой точности, один инициирует кишечную палочку, один плазмидный реплицируется. Таким образом, вносятся мутации для инициации мутагенеза.

Объедините 40 микролитров электрокомпетентных клеток и от 30 до 250 нанограммов целевой плазменной ДНК в двухмиллиметровом зазоре. Электропорация вет импульсная, смесь в электро при напряжении 1800 вольт. Проверьте постоянную времени или TC, чтобы обеспечить единообразные условия для каждого образца.

В идеале TC равен пяти-шести миллисекундам. Дайте смеси клеточной ДНК восстановиться в одном миллилитре бульона LB в течение 40 минут при температуре от 37 до Цельсия, встряхивая при 250 оборотах в минуту. Возьмите 100-миллиметровую чашку Петри LV, предварительно подогретую до 37 градусов Цельсия, содержащую соответствующие антибиотики, чтобы выбрать для обеих плазмид пластину из восстановленных клеток в соответствующем разведении для получения концентрации, близкой к газону, которая определяется как отчетливое, но неисчислимое количество колоний, как показано в этом примере.

После ночной инкубации соберите колонии бактерий в чашках Петри с помощью бульона LB. Выделите плазмиду, ДНК из собранных клеток, полученную плазмиду. ДНК представляет собой библиотеку случайных мутантов.

Проведите рестрикционный дайджест, разрезав библиотеку плазмид ферментом рестрикции, который линеаризирует как целевую плазмиду, так и полюс. Одна плазмида запускает аналитический арогель на выделенную плазмидную ДНК для подтверждения качества и количества. После того, как плазмиды проверены, расщепите один микрограмм библиотеки с помощью фермента рестрикции, который линеаризует полюс одной плазмиды, но не разрезает плазмиду-мишень.

После того, как дайджест рестрикции будет завершен, очистите библиотеку с помощью набора для очистки ДНК. Наконец, преобразуйте чистую библиотеку в считываемый штамм для характеристики мутаций. Чтобы начать подготовку градиента, отметьте 10 полос, равномерно расположенных по одному краю дна квадратной чашки Петри.

Поставьте блюдо под наклоном так, чтобы отмеченный дном край был приподнят на семь миллиметров. Налейте в наклонную посуду 25 миллилитров теплого лб-агара, хорошо перемешанного с соответствующей концентрацией средства отбора. Это нижний слой градиента.

Убедитесь, что агар LB покрывает чашку Петри таким образом, что приподнятый отмеченный конец чашки содержит примерно один миллиметр агара LB, а опущенная часть содержит около восьми миллиметров. Накройте тарелку крышкой KU для проветривания и дайте агри застыть в течение 10-15 минут. После того как нижний слой агара LB застынет, переместите блюдо на ровную поверхность.

Затем налейте 25 миллилитров теплого фунтового агара без подбирающего агента, чтобы покрыть первую сельскохозяйственную поверхность, убедившись, что покрыт весь нижний слой. Накройте тарелку крышкой КУ для проветривания, а затем дайте агри застыть в течение 10 – 15 минут, чтобы выполнить штамп переноса бактерий. Во-первых, получают бактериальные культуры считываемого штамма и разбавляют их так, чтобы они имели идентичную плотность клеток с оптической плотностью на 600 нанометров менее 1,0.

Далее перелейте два миллилитра жидкого мягкого агара, уравновешенного до 42 градусов Цельсия, на дно 100-миллиметровой круглой чашки Петри, наберите пипеткой 40 микролитров бактериальной культуры в более мягкую и затем перемешайте, покачивая пластину. Смажьте длинный край стекла предметного стекла микроскопа более мягкой смесью. Затем совместите закрашенный край горки с нижней отметкой на градиентной тарелке.

Прикоснитесь предметным стеклом к поверхности агара. Достаточно мягкого прикосновения, чтобы перенести ленту мягкого агара на градиентную поверхность. Затем предметное стекло откладывается в сторону для очистки и повторного использования.

Повторите этот процесс. Остальные образцы, экспериментального контроля, должны быть включены в каждую градиентную чашку. Если выполняется несколько градиентов, инкубируйте градиентную чашку сверху вниз в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, и температура инкубации может отличаться для разных считываемых штаммов бактерий, но для видимого роста обычно достаточно ночи при 37 градусах Цельсия.

Наконец, визуализируйте и анализируйте рост клеток, как описано в письменном протоколе. Показывать. Ниже приведены изображения считываемой деформации, преобразованной либо с помощью включенного звука P-G-F-U-V, либо с помощью мутантной библиотеки PG FPUV, которые были перенесены. Четыре раунда мутагенеза темных или тусклых колоний указывают на плазмиду, содержащую инактивирующие мутации GFP.

На этом рисунке показана частота мутаций по всей нейтральной последовательности плазмиды-мишени с интервалом в 100 пар оснований. Обратите внимание, что мутации происходят по всей последовательности плазмиды, но с наибольшей частотой, ближайшей к началу репликации. Здесь показан рост мутантов на фоне лекарственного градиента.

Расстояние, увеличенное к вершине градиента, указывает на дифференциальный профиль лекарственной устойчивости среди мутантов. В этом примере плазмидные библиотеки человеческой окислительной деметилазы ABH 2 были проверены на наличие мутантов с повышенной устойчивостью к метилметансульфонату с использованием градиентов выбора лекарств. Два. Показаны такие библиотеки, представляющие две и четыре итерации протокола мутагенеза, в сравнении с родительским диким типом и пустым вектором.

Белой линией обозначен порог, выше которого отдельные колонии мутантов были изолированы. Для дальнейшего фенотипического анализа бета-лактамазные мутанты R 1 64 H и E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, ранее идентифицированные с помощью мутагенеза P one с низкой точностью, а также выбор astri и m показаны в дозах 0,4 мкг на миллилитр и четыре мкг на миллилитр. Градиентная защита цефотаксима от цефотаксима свидетельствует об активности бета-лактамаз расширенного спектра.

Обратите внимание, что фермент бета-лактамазы дикого типа не дает защиты по сравнению с клетками, экспрессирующими пустой вектор. Таким образом, эти мутанты представляют собой адаптацию или эволюцию новой биохимической активности. Здесь мы представили мощную комбинацию мутагенеза и функционального отбора для этого поколения новых биохимических активностей.

Функциональный отбор может быть получен либо путем отбора лекарств, либо путем генетической комплементации, и он извлекает выгоду из нашей способности создавать большое генетическое разнообразие. Патогенез может быть ограничен определенной последовательностью для оптимизации ранее существовавшей активности белка или для сайт-направленного патогенеза. Это можно легко сделать с помощью клонирования.

Кроме того, мутагенез может быть отделен от функционального отбора с целью получения сигнатурных атак или мутационных следов.