Направленный метод Эволюция Saccharomyces CEREVISIAE: Mutant Создание и скрининг библиотеки

Общая цель этого протокола — показать, как конструировать и проверять мутантные библиотеки в Saccharomyces Cerevisiae для экспериментов направленной эволюции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы использования лабораторных исследований для экспериментов по направленной эволюции, например, как назначить перекрывающиеся области для сборки и клонирования. Основным преимуществом этой методики является ее простота и надежность, так как всего за один шаг трансформации можно назначить уровни хорошего качества.

Этот протокол для создания и скрининга мутантных библиотек будет продемонстрирован для грибковой арилспиртоксидазы или ААО. Области для сфокусированной направленной эволюции сначала выбираются с помощью вычислительных алгоритмов, основанных на доступной кристаллической структуре или моделях гомологии фермента. Две области ААО будут нацелены на случайный мутагенез и рекомбинацию: область M1 и область M2.

Будет проведена мутагенная ПЦР для амплификации целевых областей. Для стимулирования сплайсинга in vivo у дрожжей путем наложения ПЦР-реакций определенных областей будут созданы перекрывающиеся области между сегментами, состоящие примерно из 50 пар оснований каждый. Приготовьте мутагенные ПЦР объемом 50 микролитров, каждый из которых содержит 46 нанограммов ДНК-матрицы 90 наномоляров смысловых и антисмысловых праймеров 0,3 миллимоляра ДНТФ, 3% ДМСО, 1,5 миллимоляра хлорида магния, 05 миллимолар хлорида марганца и 05 единиц на микролитр ДНК-полимеразы.

95 градусов Цельсия в течение двух минут, 95 градусов Цельсия в течение 45 секунд, 50 градусов Цельсия в течение 45 секунд, 74 градуса Цельсия в течение 45 секунд в течение 28 циклов и 74 градуса Цельсия в течение 10 минут. Остальная часть гена AAO, HF-область, будет амплифицирована с помощью высокоточной ПЦР с соответствующими областями, перекрывающими мутагенные сегменты, и/или включенными линеаризованными векторными выступами.

Приготовьте высокоточную ПЦР в окончательном объеме 50 микролитров, содержащую 10 нанограмм матрицы ДНК, по 250 наномоляров смысловых и антисмысловых праймеров, 0,8 миллимоляра ДНТФ, 3% ДМСО и 02 единицы на микролитр ультравысокоточной ДНК-полимеразы iProof. Используйте следующую программу для ПЦР. 98 градусов Цельсия в течение 30 секунд, 98 градусов Цельсия в течение 10 секунд, 55 градусов Цельсия в течение 25 секунд, 72 градуса Цельсия в течение 45 секунд в течение 28 циклов и 72 градуса Цельсия в течение 10 минут.

Затем все фрагменты ПЦР очищаются с помощью коммерческого набора для экстракции гелем в соответствии с протоколом производителя. Следующим шагом является линеаризация вектора для создания фланговых областей примерно из 50 пар оснований, которые гомологичны пяти простым и трем простым концам гена-мишени. Приготовьте реакционную смесь линеаризации с 20 миколитерами, содержащую 2 микрограмма ДНК, 7,5 единиц BamH-one, 7,5 единиц XHO-one, 20 микрограммов BSA и два микролитра 10-кратного буфера BamH-one.

Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов 40 минут. После этого инактивируйте реакцию при температуре 80 градусов Цельсия на 20 минут. Чтобы очистить линеаризованный вектор во избежание загрязнения остаточным кольцевым плазмидом, загрузите смесь для реакции разложения в мегалунку полупрепаративного агарозного геля с низкой температурой плавления.

Загрузите пять микролитров реакционной смеси в соседнюю лунку в качестве репортера. Запустите электрофорез ДНК при четырех градусах Цельсия и пяти вольтах на сантиметр между электродами. Затем отделите соответствующий мегалунке агарозный гель и храните его при температуре четыре градуса Цельсия в одном XTAE.

Окрасьте дорожку с помощью лестницы молекулярных масс и репортера. Визуализируйте полосы под ультрафиолетовым светом и отметьте положение, в котором находится линеаризованный вектор. При отсутствии ультрафиолетового излучения и с помощью наведения зазубрин на окрашенной репортерной полосе определите линеаризованный вектор в фрагменте мегалунки и исчерпайте его.

Извлеките линеаризованный вектор из агарозы и очистите его с помощью коммерческого набора для экстракции гелем в соответствии с протоколом производителя. Затем очищенный линеаризованный вектор смешивают с фрагментами ПЦР и эту смесь ДНК используют для трансформации компетентных дрожжевых клеток с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя. Поместите трансформированные клетки на планшеты для выпадения SC и инкубируйте их при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней.

Чтобы подготовиться к этому анализу, выберите отдельные колонии из выпадающих планшетов SC и перенесите их в 96 луночных планшетов, содержащих 50 микролитров минимальной среды на лунку. В каждую пластину прививают столбец номер шесть с родительским типом в качестве внутреннего стандарта. В качестве отрицательного контроля хорошо инокулируют H-one, наполненные средами SC с добавлением урацила с отрицательными URA3 ESI висцеральными клетками без плазмиды.

Накройте тарелки крышками, оберните их пара-пленкой и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия во влажном шейкере в течение 48 часов. Через 48 часов добавьте по 160 микролитров среды для сцеживания в каждую лунку и снова запечатайте пластины. Инкубируйте еще 24 часа.

После центрифугирования планшеты используют роботизированную мультистанцию для работы с жидкостями для переноса 20 микролитров надосадочной жидкости из лунок в каждой пластине на пластину-реплику. Добавьте в каждую лунку по 20 микролитров двух миллимоларов Р-метоксибензилового спирта и 100 миллимоларов натрийфосфатного буфера pH 6,0. Быстро перемешайте пластины с помощью 96-луночного миксера и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте 160 микролитров реганта FOX в каждую реплику пластины и быстро перемешайте миксером. Считывайте показания пластин с точностью до 560 нанометров на считывателе пластин. Инкубируйте пластины при комнатной температуре до тех пор, пока не разовьется цвет.

Еще раз измерьте абсорбцию. Относительная активность рассчитывается на основе разницы между значением поглощения после инкубации и значением первоначального измерения, нормированным к родительскому типу для каждой пластины. На этом репрезентативном изображении геля показан линеаризованный вектор на второй дорожке, сегмент M1 PCR на третьей дорожке, сегмент M2 PCR на четвертой дорожке, сегмент HF PCR на пятой дорожке и повторно собранный вектор in vivo, линеаризованный с помощью NHE one на шестой дорожке.

На следующем геле показана мини-подготовка плазмиды вновь собранного вектора на второй дорожке, линеаризована с помощью NHE one на третьей дорожке, плазмида линеаризована с помощью BamH one и XHO one на четвертой дорожке, а линеаризованная плазмида получена экстракцией геля и очисткой на пятой дорожке. Мутационные нагрузки корректировались путем выборки мутантных библиотек с различными ландшафтами, подсчета количества клонов с менее чем 10% активности родительского фермента и последующей верификации путем секвенирования случайной выборки активных и неактивных вариантов. Оценка предела обнаружения в этом анализе показала, что анализ был линейным в присутствии сорбита, представленного черными кругами.

В отсутствие сорбита, представленного белыми квадратами, линейность была более стойкой, но реакция была слабее. Наблюдалась линейная корреляция между концентрацией ААО и абсорбцией. Мутантная библиотека из 2000 клонов была сконструирована и проверена с помощью этого анализа.

Затененный квадрат показывает мутантов ААО с заметно улучшенной секрецией и активностью в отношении P-метоксибензилового спирта. После освоения библиотеки мутантов могут быть созданы примерно за четыре часа, если это сделано правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о назначении правильных перекрывающихся областей для каждого семейства ПЦР и линеаризованных векторов для сплайсинга и клонирования in vivo за один трансформационный шаг.

Следуя аналогичному подходу, могут быть выполнены другие методы, такие как отбор проб ДНК in vivo, библиотека мутагенеза насыщения или сборка ДНК для создания мутантных библиотек и/или метаболических путей. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биоинженерии к исследованию деятельности, стабильности или даже к изобретению бесконечных видов взаимодействия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать это устройство Saccharomyces Cerevisiae для создания и просмотра библиотек