Направленный метод Эволюция Saccharomyces CEREVISIAE: Mutant Создание и скрининг библиотеки
1 апреля 2016 г.
Мы представляем подробный протокол для создания и скрининга мутантных библиотек для кампаний направленной эволюции у Saccharomyces cerevisiae.
Общая цель этого протокола — показать, как конструировать и проверять мутантные библиотеки в Saccharomyces Cerevisiae для экспериментов направленной эволюции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы использования лабораторных исследований для экспериментов по направленной эволюции, например, как назначить перекрывающиеся области для сборки и клонирования. Основным преимуществом этой методики является ее простота и надежность, так как всего за один шаг трансформации можно назначить уровни хорошего качества.
Этот протокол для создания и скрининга мутантных библиотек будет продемонстрирован для грибковой арилспиртоксидазы или ААО. Области для сфокусированной направленной эволюции сначала выбираются с помощью вычислительных алгоритмов, основанных на доступной кристаллической структуре или моделях гомологии фермента. Две области ААО будут нацелены на случайный мутагенез и рекомбинацию: область M1 и область M2.
Будет проведена мутагенная ПЦР для амплификации целевых областей. Для стимулирования сплайсинга in vivo у дрожжей путем наложения ПЦР-реакций определенных областей будут созданы перекрывающиеся области между сегментами, состоящие примерно из 50 пар оснований каждый. Приготовьте мутагенные ПЦР объемом 50 микролитров, каждый из которых содержит 46 нанограммов ДНК-матрицы 90 наномоляров смысловых и антисмысловых праймеров 0,3 миллимоляра ДНТФ, 3% ДМСО, 1,5 миллимоляра хлорида магния, 05 миллимолар хлорида марганца и 05 единиц на микролитр ДНК-полимеразы.
95 градусов Цельсия в течение двух минут, 95 градусов Цельсия в течение 45 секунд, 50 градусов Цельсия в течение 45 секунд, 74 градуса Цельсия в течение 45 секунд в течение 28 циклов и 74 градуса Цельсия в течение 10 минут. Остальная часть гена AAO, HF-область, будет амплифицирована с помощью высокоточной ПЦР с соответствующими областями, перекрывающими мутагенные сегменты, и/или включенными линеаризованными векторными выступами.
Приготовьте высокоточную ПЦР в окончательном объеме 50 микролитров, содержащую 10 нанограмм матрицы ДНК, по 250 наномоляров смысловых и антисмысловых праймеров, 0,8 миллимоляра ДНТФ, 3% ДМСО и 02 единицы на микролитр ультравысокоточной ДНК-полимеразы iProof. Используйте следующую программу для ПЦР. 98 градусов Цельсия в течение 30 секунд, 98 градусов Цельсия в течение 10 секунд, 55 градусов Цельсия в течение 25 секунд, 72 градуса Цельсия в течение 45 секунд в течение 28 циклов и 72 градуса Цельсия в течение 10 минут.
Затем все фрагменты ПЦР очищаются с помощью коммерческого набора для экстракции гелем в соответствии с протоколом производителя. Следующим шагом является линеаризация вектора для создания фланговых областей примерно из 50 пар оснований, которые гомологичны пяти простым и трем простым концам гена-мишени. Приготовьте реакционную смесь линеаризации с 20 миколитерами, содержащую 2 микрограмма ДНК, 7,5 единиц BamH-one, 7,5 единиц XHO-one, 20 микрограммов BSA и два микролитра 10-кратного буфера BamH-one.
Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов 40 минут. После этого инактивируйте реакцию при температуре 80 градусов Цельсия на 20 минут. Чтобы очистить линеаризованный вектор во избежание загрязнения остаточным кольцевым плазмидом, загрузите смесь для реакции разложения в мегалунку полупрепаративного агарозного геля с низкой температурой плавления.
Загрузите пять микролитров реакционной смеси в соседнюю лунку в качестве репортера. Запустите электрофорез ДНК при четырех градусах Цельсия и пяти вольтах на сантиметр между электродами. Затем отделите соответствующий мегалунке агарозный гель и храните его при температуре четыре градуса Цельсия в одном XTAE.
Окрасьте дорожку с помощью лестницы молекулярных масс и репортера. Визуализируйте полосы под ультрафиолетовым светом и отметьте положение, в котором находится линеаризованный вектор. При отсутствии ультрафиолетового излучения и с помощью наведения зазубрин на окрашенной репортерной полосе определите линеаризованный вектор в фрагменте мегалунки и исчерпайте его.
Извлеките линеаризованный вектор из агарозы и очистите его с помощью коммерческого набора для экстракции гелем в соответствии с протоколом производителя. Затем очищенный линеаризованный вектор смешивают с фрагментами ПЦР и эту смесь ДНК используют для трансформации компетентных дрожжевых клеток с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя. Поместите трансформированные клетки на планшеты для выпадения SC и инкубируйте их при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней.
Чтобы подготовиться к этому анализу, выберите отдельные колонии из выпадающих планшетов SC и перенесите их в 96 луночных планшетов, содержащих 50 микролитров минимальной среды на лунку. В каждую пластину прививают столбец номер шесть с родительским типом в качестве внутреннего стандарта. В качестве отрицательного контроля хорошо инокулируют H-one, наполненные средами SC с добавлением урацила с отрицательными URA3 ESI висцеральными клетками без плазмиды.
Накройте тарелки крышками, оберните их пара-пленкой и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия во влажном шейкере в течение 48 часов. Через 48 часов добавьте по 160 микролитров среды для сцеживания в каждую лунку и снова запечатайте пластины. Инкубируйте еще 24 часа.
После центрифугирования планшеты используют роботизированную мультистанцию для работы с жидкостями для переноса 20 микролитров надосадочной жидкости из лунок в каждой пластине на пластину-реплику. Добавьте в каждую лунку по 20 микролитров двух миллимоларов Р-метоксибензилового спирта и 100 миллимоларов натрийфосфатного буфера pH 6,0. Быстро перемешайте пластины с помощью 96-луночного миксера и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем добавьте 160 микролитров реганта FOX в каждую реплику пластины и быстро перемешайте миксером. Считывайте показания пластин с точностью до 560 нанометров на считывателе пластин. Инкубируйте пластины при комнатной температуре до тех пор, пока не разовьется цвет.
Еще раз измерьте абсорбцию. Относительная активность рассчитывается на основе разницы между значением поглощения после инкубации и значением первоначального измерения, нормированным к родительскому типу для каждой пластины. На этом репрезентативном изображении геля показан линеаризованный вектор на второй дорожке, сегмент M1 PCR на третьей дорожке, сегмент M2 PCR на четвертой дорожке, сегмент HF PCR на пятой дорожке и повторно собранный вектор in vivo, линеаризованный с помощью NHE one на шестой дорожке.
На следующем геле показана мини-подготовка плазмиды вновь собранного вектора на второй дорожке, линеаризована с помощью NHE one на третьей дорожке, плазмида линеаризована с помощью BamH one и XHO one на четвертой дорожке, а линеаризованная плазмида получена экстракцией геля и очисткой на пятой дорожке. Мутационные нагрузки корректировались путем выборки мутантных библиотек с различными ландшафтами, подсчета количества клонов с менее чем 10% активности родительского фермента и последующей верификации путем секвенирования случайной выборки активных и неактивных вариантов. Оценка предела обнаружения в этом анализе показала, что анализ был линейным в присутствии сорбита, представленного черными кругами.
В отсутствие сорбита, представленного белыми квадратами, линейность была более стойкой, но реакция была слабее. Наблюдалась линейная корреляция между концентрацией ААО и абсорбцией. Мутантная библиотека из 2000 клонов была сконструирована и проверена с помощью этого анализа.
Затененный квадрат показывает мутантов ААО с заметно улучшенной секрецией и активностью в отношении P-метоксибензилового спирта. После освоения библиотеки мутантов могут быть созданы примерно за четыре часа, если это сделано правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о назначении правильных перекрывающихся областей для каждого семейства ПЦР и линеаризованных векторов для сплайсинга и клонирования in vivo за один трансформационный шаг.
Следуя аналогичному подходу, могут быть выполнены другие методы, такие как отбор проб ДНК in vivo, библиотека мутагенеза насыщения или сборка ДНК для создания мутантных библиотек и/или метаболических путей. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биоинженерии к исследованию деятельности, стабильности или даже к изобретению бесконечных видов взаимодействия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать это устройство Saccharomyces Cerevisiae для создания и просмотра библиотек
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает создание и отбор мутантных библиотек в Saccharomyces cerevisiae для экспериментов по направленной эволюции. Он подчеркивает практичный подход, который позволяет эффективно проводить мутагенез и рекомбинацию.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Генетическая инженерия
- Микробиология
Фон
- Направленная эволюция - это метод, используемый для разработки белков с желаемыми свойствами.
- Saccharomyces cerevisiae служит модельным организмом для этих экспериментов.
- Случайный мутагенез и рекомбинация являются ключевыми техниками в этом процессе.
- Компьютерные алгоритмы помогают в выборе целевых регионов для мутагенеза.
Цель исследования
- Демонстрация протокола создания и отбора мутантных библиотек.
- Определение перекрывающихся областей для сборки и клонирования в направленной эволюции.
- Нацеливание на определенные регионы грибкового арил-спиртового оксидазы (AAO) для улучшения.
Используемые методы
- Выбор целевых регионов с использованием вычислительных алгоритмов.
- Случайный мутагенез M1 и M2 регионов AAO.
- Отбор мутантных библиотек через один этап трансформации.
- Оценка качества полученных мутантов.
Основные результаты
- Успешное создание мутантных библиотек в Saccharomyces cerevisiae.
- Идентификация эффективных мутантов с желаемыми свойствами.
- Демонстрация надежности протокола.
- Взгляд на процесс направленной эволюции для AAO.
Выводы
- Протокол предоставляет надежный метод для исследований направленной эволюции.
- Нацеливание на определенные регионы повышает эффективность мутагенеза.
- Этот подход может быть применен к различным белкам, помимо AAO.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
