Направленный метод Эволюция

Общая цель данного протокола — продемонстрировать способ создания и скрининга библиотек мутантов Saccharomyces Cerevisiae для экспериментов по направленной эволюции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при создании лабораторных конструкций для целевых экспериментов по направленной эволюции, например, о том, как определить перекрывающиеся области при сборке и клонировании. Основным преимуществом данной методики является ее простота и надежность, так как всего за один этап трансформации можно получить библиотеки высокого качества.

Данный протокол по созданию и скринингу библиотек мутантов будет продемонстрирован на примере грибковой арилспиртовой оксидазы (AAO). Области для направленной эволюции сначала выбираются с помощью вычислительных алгоритмов на основе доступной кристаллической структуры или гомологичных моделей фермента. Для случайного мутагенеза и рекомбинации будут выбраны две области AAO: область M1 и область M2.

Для амплификации целевых участков будет проведена мутагенная ПЦР. Чтобы способствовать сплайсингу in vivo в дрожжах, будут созданы перекрывающиеся области длиной примерно 50 п. н. между сегментами путем наложения ПЦР-реакций определенных регионов. Подготовьте реакционные смеси для мутагенной ПЦР объемом 50 µL, каждая из которых содержит 46 ng матричной ДНК, по 90 nM прямого и обратного праймеров, 0.3 mM dNTP, 3% DMSO, 1.5 mM хлорида магния, 0.5 mM хлорида марганца и 0.5 U/µL Taq-ДНК-полимеразы.

Используйте следующую программу ПЦР: 95 °C в течение двух минут, затем 28 циклов по 95 °C в течение 45 секунд, 50 °C в течение 45 секунд и 74 °C в течение 45 секунд, и завершающий этап при 74 °C в течение 10 минут. Остальная часть гена AAO, регион HF, будет амплифицирована с помощью высокоточной ПЦР с включением соответствующих участков, перекрывающихся с мутагенными сегментами и/или линейными навесными концами вектора.

Подготовьте реакционную смесь для высокоточной ПЦР в конечном объеме 50 µL, содержащую 10 ng матричной ДНК, по 250 nM прямого и обратного праймеров, 0.8 mM dNTP, 3% DMSO и 02 U/µL высокоточной ДНК-полимеразы iProof. Используйте следующую программу ПЦР: 98 °C в течение 30 секунд, затем 28 циклов: 98 °C в течение 10 секунд, 55 °C в течение 25 секунд и 72 °C в течение 45 секунд, и финальный этап при 72 °C в течение 10 минут.

Затем все ПЦР-фрагменты очищают с помощью коммерческого набора для экстракции из геля в соответствии с протоколом производителя. Следующим шагом является линеаризация вектора для создания фланкирующих областей длиной примерно 50 п.н., гомологичных 5'- и 3'-концам целевого гена. Приготовьте реакционную смесь для линеаризации объемом 20 µL, содержащую 2 µg ДНК, 7,5 ед. BamH-one, 7,5 ед. XHO-one, 20 µg BSA и 2 µL 10x буфера BamH-one.

Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение двух часов 40 минут. После этого инактивируйте реакцию при 80 °C в течение 20 минут. Чтобы очистить линеаризованный вектор и избежать контаминации остаточной кольцевой плазмидой, внесите смесь после рестрикции в мега-лунку полупрепаративного агарозного геля с низкой температурой плавления.

Внесите пять µL реакционной смеси в соседнюю лунку в качестве репортера. Проведите электрофорез ДНК при температуре четыре °C и напряженности поля пять В/см между электродами. Затем вырежьте из агарозного геля область, соответствующую мега-лунке, и храните ее при температуре четыре °C в 1X TAE.

Окрасьте дорожку с маркером молекулярной массы и репортером. Визуализируйте полосы под УФ-светом и сделайте надрезы в позициях, соответствующих линейному вектору. В отсутствие УФ-света, ориентируясь по надрезам в окрашенной дорожке с репортером, определите положение линейного вектора в фрагменте в мега-лунке и вырежьте его.

Извлеките линеаризованный вектор из агарозы и очистите его с помощью коммерческого набора для экстракции из геля в соответствии с протоколом производителя. Затем очищенный линеаризованный вектор смешивают с ПЦР-фрагментами, и полученную смесь ДНК используют для трансформации компетентных клеток дрожжей с помощью коммерческого набора согласно инструкциям производителя. Высейте трансформированные клетки на чашки с селективной средой SC (dropout plates) и инкубируйте их при 30 °C в течение трех дней.

Для подготовки к данному анализу выберите отдельные колонии с чашек с селективной средой SC (dropout plates) и перенесите их в 96-луночные планшеты, содержащие по 50 µL минимальной среды в каждой лунке. В каждом планшете инокулируйте шестой столбец родительским типом в качестве внутреннего стандарта. В качестве отрицательного контроля инокулируйте лунку H-1, заполненную средой SC с добавлением урацила, клетками висцеральных органов ESI, которые являются URA3-отрицательными и не содержат плазмиды.

Накройте планшеты крышками, оберните их парафильмом и инкубируйте при 30 °C в увлажненном шейкере в течение 48 часов. Через 48 часов добавьте по 160 µL экспрессионной среды в каждую лунку и снова закройте планшеты. Инкубируйте еще в течение 24 часов.

После центрифугирования планшетов используйте многостанционную роботизированную систему для работы с жидкостями, чтобы перенести 20 µL супернатанта из лунок каждого планшета в дублирующий планшет. Добавьте в каждую лунку 20 µL 2 mM p-метоксибензилового спирта и 100 mM натрий-фосфатного буфера с pH 6.0. Кратковременно перемешайте содержимое планшетов на миксере для 96-луночных планшетов и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте по 160 µL реагента FOX в каждую планшет-реплику и осторожно перемешайте с помощью миксера. Измерьте оптическую плотность планшетов при 560 нм на планшетном ридере. Инкубируйте планшеты при комнатной температуре до развития окраски.

Снова измерьте абсорбцию. Относительная активность рассчитывается как разница между значением абсорбции после инкубации и начальным измерением, нормированная по родительскому типу для каждой лунки. На этом репрезентативном изображении геля в дорожке два показан линеаризованный вектор, в дорожке три — ПЦР-сегмент M1, в дорожке четыре — ПЦР-сегмент M2, в дорожке пять — ПЦР-сегмент HF и в дорожке шесть — реассемблированный in vivo вектор, линеаризованный с помощью NHE one.

На следующем геле представлены: в дорожке два — результат мини-препарации плазмиды реассемблированного вектора, в дорожке три — плазмида, линеаризованная с помощью NHE I, в дорожке четыре — плазмида, линеаризованная с помощью BamH I и Xho I, и в дорожке пять — линеаризованная плазмида, полученная путем гель-экстракции и очистки. Мутационная нагрузка регулировалась путем отбора из мутантных библиотек с различными ландшафтами, расчета количества клонов с активностью менее 10% от активности родительского фермента и последующей верификации путем секвенирования случайной выборки активных и неактивных вариантов. Оценка предела обнаружения данного анализа показала, что анализ был линейным в присутствии сорбитола, что обозначено черными кружками.

В отсутствие сорбитола (белые квадраты) линейность была более устойчивой, однако отклик оказался слабее. Наблюдалась линейная корреляция между концентрацией AAO и оптической плотностью. С помощью данного анализа была создана и проскринирована библиотека мутантных клонов из 2 000 образцов.

Закрашенный квадрат указывает на мутанты AAO с заметно улучшенной секрецией и активностью в отношении P-метоксибензилового спирта. После освоения метода создание библиотек мутантов занимает примерно четыре часа при условии правильного выполнения процедуры. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости назначения соответствующих перекрывающихся областей для каждой группы ПЦР и линеаризованного вектора для сплайсинга in vivo и клонирования за один этап трансформации.

Используя аналогичный подход, для создания мутантных библиотек или метаболических путей могут быть применены другие методы, такие как отбор ДНК in vivo, создание библиотек насыщающего мутагенеза или сборка ДНК. После своей разработки эта методика открыла перед исследователями в области биоинженерии возможности для изучения активности, стабильности или даже создания бесконечного множества вариантов взаимодействий. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать этот инструмент на базе Saccharomyces Cerevisiae для конструирования и скрининга библиотек