Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить вирусный тропизм у ВИЧ-инфицированного пациента путем секвенирования V-трех областей гена вирусной оболочки для начала извлечения H-I-V-R-N-A из плазмы крови пациента. Затем амплифицируйте V три области ВИЧ GP one 20 с помощью вложенных R-T-P-C-R. Затем определили наличие продукта с помощью гель-электрофореза с последующим популяционным секвенированием амплифицированных продуктов V 3.

Наконец, проанализируйте последовательности с помощью программного обеспечения для вызова базы и сделайте вывод об использовании корецепторов с помощью алгоритма «геном-фено». В конечном счете, эти результаты могут показать, является ли вирусный отряд пациента R 5 или не R 5, с помощью популяционного секвенирования третьей петли ВИЧВ. Таким образом, основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как фенотипические клеточные анализы, заключается в том, что он может быть выполнен в любой лаборатории, оборудованной оборудованием для секвенирования, с меньшими затратами за меньшее количество времени и меньшим количеством исходного материала.

Этот метод актуален для лечения антиретровирусной терапией, поскольку он может определить, будет ли вирусная популяция пациента реагировать на пять антагонистов CCR из 500 микролитров плазмы. Используйте простой автоматический экстрактор для извлечения H-I-V-R-N-A. Теперь перейдем в чистую комнату для ПЦР, чтобы настроить R-T-P-C-R для обеспечения адекватного отбора проб вирусной популяции.

Запланируйте выполнение каждой реакции обратной транскрипции в трех экземплярах в этой одношаговой реакции. Используйте вирусную РНК для синтеза CDNA, в частности, амплигируя три области HIVV с помощью SQV трех F1 и CO 6 0 2 первичной репарации. В зависимости от компонентов реакции.

Приготовьте исходный раствор смеси, достаточный для амплификации количества образцов с помощью пипетки-репитера Добавьте по 36 микролитров смеси образцов в каждую лунку ПЦР-планшета. Теперь переключитесь на многоканальную пипетку, чтобы преобразовать микролитры экстракта образца РНК в каждую из назначенных лунок. Следите за тем, чтобы советы менялись между каждым добавлением.

После завершения переноса накройте лунки крышками для ПЦР-лент. Затем поместите ПЦР-планшет в амплификатор, запрограммированный на одноступенчатый R-T-P-C-R трех областей ВИЧВ. Для вложенной ПЦР используйте восстановление праймера SQV three F two и CD four R.

Рассчитайте необходимое количество реагента для количества образцов, подлежащих амплификации в чистой комнате для ПЦР. Сгенерируйте вложенную смесь ПЦР, а затем используйте пипетку-репитер для сбора 19 микролитров на лунку чистой ПЦР-планшета. По завершении R-T-P-C-R перейдите в помещение для постамплификации.

Используйте восьмиканальную многоканальную пипетку для переноса одного микролитра матрицы R-T-P-C-R во вложенную смесь для ПЦР. Меняйте чаевые между каждым добавлением. Накройте лунки колпачками для ПЦР-стрип и перенесите пластину в термоамплификатор для амплификации.

Снимите пластину с амплификатора после того, как температура вернется к 25 градусам Цельсия. Для того чтобы подтвердить, что область V 3 была успешно амплифицирована, сначала проанализируйте продукты с помощью гель-электрофореза. Приготовьте гель 1,6% AROS с кибербезопасным гелевым морилкой.

С помощью многоканальной пипетки объемом 10 микролитров. Перенесите восемь микролитровых образцов ПЦР в соответствующие лунки. Также загрузите лестницу для анализа ДНК хотя бы в одну лунку на ряд.

Запустите гель при напряжении около 100 вольт в течение 10 минут. Визуализируйте каналы с помощью ультрафиолетовой флуоресценции и документируйте изображение с помощью фотографии. Запишите образцы, в которых все тройные усиления были успешными.

При необходимости повторите R-T-P-C-R для тех образцов, в которых менее трех амплификаций продукта. Амплифицированные образцы вирусных CDNA дополнительно верифицируются с помощью секвенирования ДНК; реакции будут проводиться с использованием трех праймеров R one V 3, 0, 2 F и S QV. Достаньте большой реагент из морозилки и разморозьте при комнатной температуре.

Рассчитайте и подготовьте реагенты, необходимые для обработки проб. Аликвотируйте пять микролитров секвенирования реакционной смеси в соответствующие планшетные лунки с помощью многоканальной пипетки. Накройте тарелку салфеткой Kim и отложите в сторону.

Тем временем приготовьте разведение одного к 15 амплифицированного продукта ПЦР, добавив 180 микролитров стерильной воды к оставшемуся продукту ПЦР. Пипеткой нанесите один микролитр разведенного образца на дно соответствующей пластины. Лунки всегда меняют наконечники между образцами после завершения переноса образца.

Запечатайте пластину полосчатыми колпачками и закрутите на одну секунду. Чтобы центрифугировать пластину, установите скорость на 140 5G. Когда скорость вращения достигнет 140 5G, останавливаем вращение.

Поместите пластину в амплификатор, чтобы реакция протекала. В каждую скважину осаждают ДНК с четырьмя микролитрами трех моляров ацетата натрия и 40 микролитрами охлажденного 95%-ного этанола, закупоривают крышками. Нанесите кортекс на пластину на 10 секунд и постучите по ней, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Поместите тарелки при температуре минус 20 градусов Цельсия на срок от 30 минут до двух часов. Восстановите ДНК путем центрифугирования при 2000 G в течение 20 минут. Снимите и выбросьте крышки от полосок.

Переверните тарелку над контейнером для отходов и сцедите супер натин. Избавьтесь от остатков супер натина. Промокнув перевернутые пластины на бумажном полотенце.

Сложите два листа бумажного полотенца, чтобы тарелка заслонилась. Поместите пластину лицевой стороной вниз в центрифугу и вращайте при 140 5G. Остановка вращения при достижении 140 5G.

Затем постирать 155 микролитрами 95% этанола и сцедить. Затем повторите центрифугирование. Дайте тарелке постоять две-пять минут, чтобы последний этанол испарился.

Для того, чтобы денатурировать образцы ДНК, с помощью многоканальной пипетки распределите 10 микролитров красителя для медвежонка во все лунки на пластине, включая те, которые пусты. Запечатайте пластину септимой и поместите в амплификатор при температуре 90 градусов Цельсия на две минуты. Наконец, поместите планшет с образцом в планшет для секвенирования и в секвенсор.

Одним из приемлемых способов анализа данных является использование функции вызова программного обеспечения для выполнения автоматического вызова базы без вмешательства человека. Recall — это бесплатное программное обеспечение для звонков на основе пользовательских настроек, вход в систему и выбор образцов файлов для загрузки с помощью опции обзора. Найдите файл необработанных данных секвенирования и загрузите до 20 мегабайт.

Затем установите последовательность отсчета на V три. Нажмите Process data. Выберите полученную папку в правой части страницы, чтобы отобразить список образцов.

Те, которые красные, потерпели неудачу. Те, что зеленые, прошли. Нажав на конкретный образец и кнопку просмотра, вы можете просмотреть последовательность, следовать инструкциям в правой части страницы для навигации по последовательности, загрузить файлы в zip-папку.

О вирусном тропизме можно судить по последовательностям, полученным с помощью популяционного секвенирования с использованием алгоритма гено-фенокорецептора. Из выпадающего меню значимой настройки выберите оптимизированную на основе анализа клинических данных от мотивации 2% и 5,75% FPR. Теперь выберите выгрузку или вставку последовательности для анализа.

Файлы FASTA принимаются. Не добавляйте другие действия, чтобы получить предиктор Geno Tono FPRA отзывчивости на пять антагонистов CCR. Сгенерированный отчет G two P содержит последовательность петли V 3 в аминокислотах и указывает соответствующие позиции от мутаций, связанных с не-R 5 с использованием вируса.

В нижней части отчета приводится процент ложноположительных результатов, который интерпретируется в терминах реакции на антагонист CCR 5. Этот отчет можно скачать в формате PDF. Если предполагается, что какая-либо из трех последовательностей из образца не является R 5, то маловероятно, что пациент ответит на антагонист CCR 5, поскольку ожидаемый гель-электрофорез RTP CR Амплификации петли HIV one V three указывает на то, что не все клинические образцы продуцируют продукт.

Сгенерированные последовательности из амплифицированных образцов могут быть визуализированы в хроматограмме, считываемой путем вызова. Ожидается чистая последовательность с небольшим количеством смесей. Иногда последовательности могут быть беспорядочными и не поддаваться точному назначению базы.

У некоторых пациентов может быть идентифицирован вирус без CCR 5, как показано здесь. Эти пациенты вряд ли ответят на лечение антагонистом CCR 5. Тем не менее, у большинства пациентов обнаруживается вирусная популяция, состоящая из CCR 5 с использованием вируса, на что указывает зеленая рамка в нижней части отчета об анализе G 2 P.

Таким образом, как только вы освоите эту технику, ее можно выполнить примерно за четыре дня от начала до конца. Это от добычи до анализа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как прогнозировать вирусный тропизм с помощью методов популяционного секвенирования в сочетании с алгоритмом фенобиоинформатики генома.

Ладно, вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.